張皖靜,張 琪,張曉霞,吳文靜,楊 丹,袁文天,許 燕*,趙 凱

(1 上海師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院,上海 200234;2 上海博滿生物科技有限公司,上海 201106;3上海市農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所,上海 201106 )

非洲豬瘟(African Swine Fever,ASF)被我國(guó)列為A 類重點(diǎn)防范傳染病。 起初,非洲豬瘟發(fā)生在非洲國(guó)家肯尼亞,因此命名為非洲豬瘟,并傳播到西歐國(guó)家。 2017 年3 月,在俄羅斯遠(yuǎn)東地區(qū)發(fā)現(xiàn)了非洲豬瘟;2018 年8 月3 日,中國(guó)確診首個(gè)非洲豬瘟病例。 非洲豬瘟可以通過(guò)血液、糞便、分泌物、尿液、淚液、傷口和空氣傳播,呈流行性發(fā)生時(shí),病毒迅速蔓延。 病豬的臨床表現(xiàn)是體溫迅速升高、呼吸急促、呼吸困難、嘔吐、死亡等癥狀。 我國(guó)是生豬和豬肉的主要生產(chǎn)和消費(fèi)國(guó),由于尚未研制出預(yù)防非洲豬瘟的有效疫苗,非洲豬瘟病毒的檢測(cè)技術(shù)研究迫在眉睫。

非洲豬瘟病毒(African Swine Fever Virus,ASFV)屬于DNA 病毒目、非洲豬瘟病毒科、非洲豬瘟病毒屬成員,也是這個(gè)家族唯一的成員。 非洲豬瘟病毒是一條雙鏈DNA 分子,基因組全長(zhǎng)約為170—190 kb,含有151 個(gè)開(kāi)放閱讀框(ORFs),以非洲豬瘟病毒為模板,可以編碼150—200 種蛋白,如p72 蛋白。 其中p72蛋白是最重要的結(jié)構(gòu)蛋白之一,在非洲豬瘟病毒檢測(cè)中經(jīng)常用作非洲豬瘟的血清學(xué)診斷。 歐洲毒株基因(即格魯吉亞2007∕1 株)與報(bào)道的中國(guó)遼寧省沈陽(yáng)市沈北新區(qū)某養(yǎng)殖場(chǎng)發(fā)生的非洲豬瘟病毒序列完全匹配,可以此為靶序列構(gòu)建非洲豬瘟病毒質(zhì)粒作為核酸檢測(cè)的陽(yáng)性對(duì)照。 目前非洲豬瘟病毒的檢測(cè)主要分為免疫學(xué)檢測(cè)方法和核酸檢測(cè)方法。

1 免疫學(xué)檢測(cè)方法

1.1 ELISA 檢測(cè)(酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn))

酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(ELISA)的基本原理是將特異性反應(yīng)系統(tǒng)、間接放大系統(tǒng)和顯示系統(tǒng)結(jié)合起來(lái),該方法在檢測(cè)抗體和抗原方面發(fā)揮著重要的作用。 應(yīng)用ELISA 法檢測(cè)非洲豬瘟病毒,可以在早期檢測(cè)出帶有非洲豬瘟的病豬,并及時(shí)予以隔離。 ELISA 法具有高靈敏度、可以大量檢測(cè)的優(yōu)點(diǎn),但也存在特異性不強(qiáng)、每個(gè)試劑盒的標(biāo)準(zhǔn)不均一的局限性。 2012 年,董志珍等[1]將克隆獲得的ASFV 蛋白對(duì)小鼠進(jìn)行免疫獲得單克隆抗體,利用此單克隆抗體建立了非洲豬瘟抗體的ELISA 檢測(cè)法,這種方法具有很強(qiáng)的特異性,比間接熒光法的靈敏度更高。 2016 年,曹琛福等[2]利用大腸桿菌轉(zhuǎn)化表達(dá)獲得了P54 蛋白,從而建立了非洲豬瘟病毒抗體競(jìng)爭(zhēng)ELISA 方法,這種方法通過(guò)特異性檢測(cè),與其他病毒均無(wú)交叉反應(yīng),特異性達(dá)100%,靈敏度達(dá)96.22%。

1.2 膠體金免疫層析(GICA)試紙條

膠體金是一種常見(jiàn)的標(biāo)記技術(shù)。 它是一種以膠體金為示蹤劑標(biāo)記的用于抗原抗體的免疫標(biāo)記技術(shù),具有獨(dú)特的優(yōu)勢(shì)。 非洲豬瘟抗原涂在硝酸纖維素膜的檢測(cè)區(qū)域,將有膠體金標(biāo)記的非洲豬瘟抗原附著于下部,形成免疫金標(biāo)試紙條。 使用該試紙條建立用于檢測(cè)非洲豬瘟抗體水平的免疫金標(biāo)記方法,優(yōu)點(diǎn)在于試紙條不僅可以用于血清的檢測(cè),也可以用于檢測(cè)全血樣品,操作簡(jiǎn)便快速,結(jié)果準(zhǔn)確率高、肉眼可直接判斷,適用于抗體檢測(cè)和現(xiàn)場(chǎng)樣本的大規(guī)模推廣;缺點(diǎn)在于需要獲得非洲豬瘟的抗原,但非洲豬瘟病毒變異性強(qiáng),獲得有效的抗原有一定的難度。 2017 年,林彥星等[3]為了篩選出具有抗原性的非洲豬瘟病毒蛋白多肽,將牛血清蛋白(BSA)與利用非洲豬瘟病毒的VP73 蛋白合成的多肽進(jìn)行偶聯(lián),從而建立了非洲豬瘟病毒抗體的膠體金免疫層析檢測(cè)技術(shù)。 這種技術(shù)具有較強(qiáng)的特異性和穩(wěn)定性,但不足之處在于靈敏度低,檢測(cè)結(jié)果需要根據(jù)臨床性狀和病史判斷,并且只能對(duì)死豬檢測(cè),試驗(yàn)結(jié)果還需要核酸檢測(cè)驗(yàn)證。

2 分子生物學(xué)檢測(cè)方法

2.1 PCR 技術(shù)(聚合酶鏈?zhǔn)綌U(kuò)增)

PCR 技術(shù)是一種用于擴(kuò)增特定DNA 片段的分子生物學(xué)技術(shù)。 模板可以是DNA 或者RNA,當(dāng)模板是DNA 時(shí),DNA 聚合酶從一小段雙鏈DNA 開(kāi)始合成,互補(bǔ)序列與1 個(gè)或2 個(gè)合成寡核苷酸引物的單鏈DNA模板結(jié)合,一部分形成雙鏈結(jié)構(gòu)。 基于PCR 的PCR 儀器實(shí)際上是一種溫度控制裝置,可以在變性溫度、復(fù)性溫度和延伸溫度之間進(jìn)行控制。 用這種方法檢測(cè)非洲豬瘟病毒存在與否,優(yōu)點(diǎn)在于方法簡(jiǎn)單,不易污染,但也存在操作時(shí)間長(zhǎng),檢測(cè)一組非洲豬瘟病毒時(shí)間為2—3 h,且靈敏度較低,若模板拷貝數(shù)較低可能無(wú)法檢測(cè)出等缺點(diǎn)。 非洲豬瘟病毒中的B646L基因具有一段保守區(qū),因此常常被用來(lái)設(shè)計(jì)引物檢測(cè)非洲豬瘟病毒的存在。 Basto 等[4]基于B646L基因設(shè)計(jì)了一對(duì)引物,以建立具有內(nèi)部引物擴(kuò)增片段243 bp和外部引物擴(kuò)增片段370 bp 的ASFV 巢式PCR 方法。 該方法不僅可以檢測(cè)組織、血液樣本和培養(yǎng)物,還可以檢測(cè)攜帶ASFV 的昆蟲。 2008 年,Giammarioli 等[5]建立了多重PCR 方法用來(lái)檢測(cè)ASFV、豬瘟病毒(CSFV)、豬圓環(huán)病毒2 型(PCV-2)、豬細(xì)小病毒(PPV)和豬繁殖與呼吸障礙綜合病(PRRS),其中,對(duì)ASFV 檢測(cè)使用的引物就是使用世界動(dòng)物衛(wèi)生組織(OIE)推薦的保守區(qū)設(shè)計(jì)的引物。 但是,由于PCR 需要分析擴(kuò)增產(chǎn)物,極微量的PCR 產(chǎn)物交叉污染可能導(dǎo)致假陽(yáng)性;臨床上還可能存在酶抑制劑導(dǎo)致產(chǎn)物無(wú)法進(jìn)行擴(kuò)增,從而導(dǎo)致假陰性。

2.2 Real-time PCR 技術(shù)(實(shí)時(shí)熒光定量PCR)

實(shí)時(shí)熒光定量PCR(Real-Time Flurescent Quantitive Polymerase Chain Reaction)是運(yùn)用具有特異性的熒光探針技術(shù),將試驗(yàn)操作時(shí)間控制在數(shù)小時(shí)內(nèi)。 設(shè)計(jì)多對(duì)引物,并且同時(shí)進(jìn)行多組熒光定量PCR,可以用來(lái)檢測(cè)非洲豬瘟病毒是否存在、及其病毒含量,其優(yōu)點(diǎn)在于可將結(jié)果量化,通過(guò)明確的數(shù)據(jù)顯示結(jié)果,具有引物和探針的雙重特異性,因此實(shí)時(shí)熒光定量PCR 具有很強(qiáng)的特異性。 利用SYBR Green1 作為熒光染料即采用完全閉管式操作,避免了產(chǎn)物產(chǎn)生陽(yáng)性污染,同時(shí)提高了檢測(cè)速度。 但是用這種方法測(cè)定非洲豬瘟病毒的存在,只能夠單管單測(cè),且操作步驟復(fù)雜繁瑣,需要專業(yè)人員操作及專業(yè)實(shí)驗(yàn)室。 董志珍等[6]設(shè)計(jì)出基于E183L基因的引物和探針,并建立了ASFV 熒光定量PCR 方法,這種方法可檢測(cè)小于15 copies∕μL 的病毒樣品,并獲得了國(guó)家專利。 根據(jù)OIE 推薦的保守區(qū),King 等[7]建立了非洲豬瘟的TaqMan 探針熒光PCR 檢測(cè)方法,使用的熒光探針和引物均由B646L的高度保守區(qū)設(shè)計(jì),靈敏度提高了10—100 倍。

2.3 重組酶聚合酶擴(kuò)增(RPA)技術(shù)

RPA 技術(shù)是一種新興的可以在常溫下進(jìn)行的核酸快速擴(kuò)增技術(shù),它模擬了DNA 在細(xì)胞中的擴(kuò)增方式,在常溫且等溫的條件下,引物與重組酶形成聚合體,這種聚合體能夠促進(jìn)引物與模板配對(duì),單鏈DNA結(jié)合蛋白(SSB)能夠促進(jìn)模板DNA 解旋,然后在DNA 聚合酶的作用下形成新的DNA 互補(bǔ)鏈。 其反應(yīng)速度快,產(chǎn)物DNA 數(shù)量呈指數(shù)增加,一般反應(yīng)時(shí)間小于10 min。 2016 年,王建昌等[8]建立了非洲豬瘟病毒的RPA 檢測(cè)方法,根據(jù)已知的非洲豬瘟病毒中P72 的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物,設(shè)計(jì)出該病毒的RPA 檢測(cè)方法,通過(guò)這種方法,非洲豬瘟最低檢測(cè)到100 copies∕μL。 2017 年,李林等[9]對(duì)非洲豬瘟病毒的B646L基因的保守區(qū)設(shè)計(jì)引物,從而建立了非洲豬瘟病毒的RPA 檢測(cè)方法,該方法對(duì)非洲豬瘟病毒的檢測(cè)時(shí)間小于20 min,最低檢測(cè)限為16 copies∕μL,具有較高的靈敏度和較強(qiáng)的特異性;缺點(diǎn)是試劑成本較高。

2.4 LAMP 技術(shù)(環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增技術(shù))

環(huán)介導(dǎo)等溫?cái)U(kuò)增核酸技術(shù)(Loop-mediated Isothermal Amplification,LAMP)是一種新興的核酸檢測(cè)技術(shù)。 2009 年,江彥增等[10]根據(jù)OIE 推薦的引物,建立了非洲豬瘟的LAMP 檢測(cè)方法,相比于OIE 的推薦的PCR 方法,此方法的靈敏度提高了100 倍。 本研究課題組利用非洲豬瘟病毒中P72 的保守區(qū)設(shè)計(jì)了3對(duì)引物,建立了非洲豬瘟病毒LAMP 檢測(cè)方法。 試驗(yàn)結(jié)果用熒光進(jìn)行顯色判斷,陽(yáng)性產(chǎn)物為綠色,陰性產(chǎn)物為橘紅色,無(wú)需電泳即可進(jìn)行可視化判斷。 這三對(duì)引物其中一對(duì)為環(huán)引物,用于識(shí)別目標(biāo)序列中識(shí)別位置的特定擴(kuò)展序列,這大大提高了核酸擴(kuò)增的特異性,加快了反應(yīng)速度。 LAMP 反應(yīng)發(fā)生在恒溫條件下,只需要金屬浴、3 把移液器即可操作,設(shè)備簡(jiǎn)單,總費(fèi)用6 000 元(人民幣,下同);試劑成本低,一頭生豬試劑成本只需2 元。 根據(jù)對(duì)非洲豬瘟病毒的臨床檢測(cè),LAMP 反應(yīng)檢測(cè)靈敏度為2 copies∕μL,檢測(cè)時(shí)間為20 min。 具有高靈敏度,反應(yīng)時(shí)間短,溫度要求低的優(yōu)點(diǎn)。 在百級(jí)凈化車間,將試劑分裝為兩部分,A 試劑吹干在管蓋上,B 試劑分裝在PCR 管中,封裝好。 現(xiàn)場(chǎng)只需加樣一次,減化了操作步驟,減少了勞動(dòng)強(qiáng)度和受污染的風(fēng)險(xiǎn)。 由于核酸染料在反應(yīng)前體系配制時(shí)加入,反應(yīng)后無(wú)需開(kāi)蓋添加染料進(jìn)行顯色,避免了開(kāi)蓋產(chǎn)生的氣溶膠的污染。 試劑放置室溫可長(zhǎng)達(dá)7 個(gè)月,避免了冷鏈運(yùn)輸。 液體樣品可以直接加入反應(yīng)體系作為模板,無(wú)需進(jìn)行純化,固體樣品加入裂解液,95 ℃裂解10 min,上清液即可作為模板。 現(xiàn)場(chǎng)操作步驟簡(jiǎn)單易學(xué)。 然而,LAMP 檢測(cè)方法也具有一定的局限性:靶序列要求較長(zhǎng),低于100 bp 無(wú)法設(shè)計(jì)引物。

3 展望

目前,全球尚無(wú)有效的非洲豬瘟疫苗可用于預(yù)防,有效的防控仍是對(duì)非洲豬瘟病毒進(jìn)行檢測(cè),落實(shí)及時(shí)發(fā)現(xiàn)、快速處置、精準(zhǔn)管控。 根據(jù)檢測(cè)結(jié)果,對(duì)發(fā)生疫情的地方嚴(yán)防死守,對(duì)疫點(diǎn)地區(qū)生豬全部撲殺,進(jìn)行無(wú)害化處理,防止疫情的擴(kuò)散。 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部要求生豬養(yǎng)殖、飼料廠、屠宰廠和流通環(huán)節(jié)必須嚴(yán)格進(jìn)行非洲豬瘟病毒檢測(cè)。

現(xiàn)在非洲豬瘟病毒的檢測(cè)技術(shù)主要分為定量和定性兩個(gè)方面。 其中,定量主要是實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)。 這種方法的優(yōu)點(diǎn)在于特異性強(qiáng),靈敏度較高,可以對(duì)試驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行量化分析;缺點(diǎn)在于儀器設(shè)備成本高,需要專業(yè)人員進(jìn)行操作,操作時(shí)間長(zhǎng),同時(shí)需要配備專業(yè)的實(shí)驗(yàn)室,不適合現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)。 定性主要有ELISA、膠體金免疫層析試紙條、RPA 技術(shù)和LAMP 技術(shù)。 ELISA 的優(yōu)點(diǎn)在于通量高,缺點(diǎn)在于靈敏度低,需要專業(yè)的實(shí)驗(yàn)室和專業(yè)人員操作。 膠體金免疫層析試紙條優(yōu)點(diǎn)在于可用于現(xiàn)場(chǎng)可視化檢測(cè),操作方便;缺點(diǎn)在于靈敏度低,檢測(cè)結(jié)果需要根據(jù)臨床性狀和病史判斷,并且只能對(duì)死豬檢測(cè),結(jié)果還需要核酸檢測(cè)驗(yàn)證。 RPA 的優(yōu)點(diǎn)在于靈敏度高,反應(yīng)時(shí)間短,操作方便,可用于現(xiàn)場(chǎng)可視化檢測(cè);缺點(diǎn)是試劑成本高。 LAMP 優(yōu)點(diǎn)特異性強(qiáng),靈敏度高,反應(yīng)時(shí)間短,可用于現(xiàn)場(chǎng)可視化檢測(cè),操作方便,試劑成本低;缺點(diǎn)是RPA 和LAMP 靈敏度非常高,容易污染,現(xiàn)場(chǎng)采取無(wú)污染操作措施要求高。

根據(jù)目前非洲豬瘟流行情況,現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)要求通量大和快速簡(jiǎn)便,有時(shí)需要對(duì)結(jié)果定量分析,因此檢測(cè)方法應(yīng)向兼顧定性定量、高通量方向發(fā)展。 另外,樣品制備、樣本的處理、核酸擴(kuò)增和結(jié)果的顯示,應(yīng)向自動(dòng)化、一體化方向發(fā)展。