王 嵩，黃思捷，郤 慶 綜述，李國文，沈朝斌 審校

環(huán)狀RNA(circular RNA,circRNA)成為近年來研究的熱點(diǎn)，是繼微小RNA(microRNA,miRNA)和長鏈非編碼RNA(long non-coding RNA,lncRNA)之后一種新型非編碼RNA。circRNA在細(xì)胞中廣泛地表達(dá)，具有高度穩(wěn)定及保守的特性。隨著生物信息技術(shù)的快速發(fā)展，越來越多的circRNA被報道，并成為新的研究靶點(diǎn)。circRNA分子能夠選擇性地調(diào)節(jié)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄、與miRNA相互作用等。circRNA的表達(dá)與多種疾病密切相關(guān)，一些circRNA可能通過調(diào)節(jié)miRNA的表達(dá)起到miRNA海綿的作用。miRNA是一類由長度約22個核苷酸組成的非編碼單鏈RNA，它參與動、植物轉(zhuǎn)錄后基因表達(dá)的調(diào)控。circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)是一些疾病的相關(guān)調(diào)節(jié)模式，circRNA可作為miRNA海綿發(fā)揮作用，并調(diào)節(jié)下游相關(guān)mRNA。本文中，我們討論了目前對于circRNA的理解以及通過circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)在疾病中的作用作一闡述。

1 circRNA的生物學(xué)特征

circRNA最早由SANGER等[1]在植物類病毒中發(fā)現(xiàn)并提出的。隨著高通量測序等技術(shù)的發(fā)展，相繼在人、動物、植物等多種生物中檢測出數(shù)千種circRNA，并且數(shù)量還在不斷增加。大部分circRNA存在于細(xì)胞質(zhì)，小部分存在于細(xì)胞核中[2-4]。不同細(xì)胞中的circRNA表達(dá)水平存在差異，但高于同一來源的線性RNA的表達(dá)[5]。目前，盡管一些研究發(fā)現(xiàn)circRNA可以通過結(jié)合miRNA在調(diào)節(jié)相應(yīng)線性mRNA的活性中起到作用，但是在circRNA及其相應(yīng)的線性轉(zhuǎn)錄物之間尚未發(fā)現(xiàn)功能方面的特定關(guān)聯(lián)。circRNA不同于線性RNA，它是由一個外顯子3′端和另一個外顯子5′端通過共價結(jié)合形成的一個閉合環(huán)形結(jié)構(gòu)。由于缺乏加帽結(jié)構(gòu)及缺少自由端，因此不易被核酸外切酶降解，無法被翻譯成蛋白，具有較強(qiáng)的穩(wěn)定性[6]。大多數(shù)外顯子circRNA的半衰期超過48 h，而mRNA的平均半衰期為10 h[7]，因此，它是診斷及治療疾病潛在的分子標(biāo)志物。

研究[8]發(fā)現(xiàn)多種circRNA在特定的組織中如腦及血液中高表達(dá)。一些circRNA還會隨著發(fā)育的不同階段發(fā)生改變，其表達(dá)隨著年齡的增長而變化，GRUNER等[9]發(fā)現(xiàn)22月齡的小鼠大腦中，circ_004501和circ_013636的表達(dá)較12月齡增高。

2 circRNA主要的功能

2.1 miRNA海綿作用 miRNA是轉(zhuǎn)錄后水平基因表達(dá)的關(guān)鍵調(diào)節(jié)因子，circRNA含有miRNA的結(jié)合位點(diǎn)，因此可競爭性分離、結(jié)合miRNA，充當(dāng)miRNA的海綿，從而起到降解靶向mRNA的作用，間接控制基因的表達(dá)[10]。研究[11-12]發(fā)現(xiàn)有包括circACVR2A、has_circ_0002577等在內(nèi)的多種circRNA具有miRNA海綿作用。主要分布于細(xì)胞質(zhì)中的circACVR2A在膀胱癌細(xì)胞和組織中低表達(dá)，這與膀胱癌病人的不良臨床病理特征相關(guān)。circACVR2A可與細(xì)胞中的miRNA-626相互作用，其過表達(dá)能拮抗miRNA-626介導(dǎo)的膀胱癌細(xì)胞中細(xì)胞增殖、遷移和侵襲能力的增強(qiáng)，表明circACVR2A可以作為miRNA-626的海綿來調(diào)節(jié)EYA4基因的表達(dá)，可作為膀胱癌潛在的生物標(biāo)志物和治療靶點(diǎn)[11]。在對has_circ_0002577的研究中發(fā)現(xiàn)，hsa_circ_0002577高表達(dá)于子宮內(nèi)膜癌組織中，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和子宮內(nèi)膜癌病人的總體存活率相關(guān)。hsa_circ_0002577可能是與miR-197相結(jié)合，通過其靶基因CTNND1發(fā)揮作用，調(diào)節(jié)細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲能力，最終降低體內(nèi)腫瘤的生長。該研究推測hsa_circ_0002577可以通過hsa_circ_0002577/miR-197/CTNND1/Wnt/β-catenin信號通路發(fā)揮關(guān)鍵功能，作為子宮內(nèi)膜癌治療的新型治療應(yīng)用[12]。circRNA在基因不同位置有不同的表達(dá)，它們也可以作為miRNA介導(dǎo)的轉(zhuǎn)錄調(diào)控網(wǎng)絡(luò)的重要組成部分。

2.2 調(diào)控親本基因的表達(dá) 非編碼RNA的一個主要作用是調(diào)控親本基因的表達(dá)，不同類型的非編碼RNA的調(diào)控機(jī)制各有不同。circRNA能與RNA結(jié)合蛋白結(jié)合，影響其親本基因的表達(dá)。在circRNA的形成過程中，內(nèi)含子間通過競爭性互補(bǔ)影響mRNA的表達(dá)以及蛋白質(zhì)的轉(zhuǎn)錄。相關(guān)研究預(yù)測了一些環(huán)狀內(nèi)含子RNA或外顯子-內(nèi)含子circRNA可作為基因表達(dá)的轉(zhuǎn)錄后調(diào)節(jié)因子，調(diào)節(jié)線性RNA的轉(zhuǎn)錄和蛋白的表達(dá)，豐富的circRNA以未知的機(jī)制促進(jìn)其親本基因的轉(zhuǎn)錄；同時外顯子-內(nèi)含子circRNA定位于細(xì)胞核內(nèi)，結(jié)合核糖蛋白復(fù)合物來上調(diào)特定基因，并使其形成circRNA反向鏈接過程中的各種轉(zhuǎn)錄。circRNA通過與特異性RNA聚合酶Ⅱ的相互作用，促進(jìn)相關(guān)親本基因的轉(zhuǎn)錄。此外circRNA可以結(jié)合轉(zhuǎn)錄機(jī)制之外的蛋白質(zhì)來調(diào)節(jié)其細(xì)胞功能，如內(nèi)含子circRNA通過結(jié)合來影響肌萎縮側(cè)索硬化中退化的運(yùn)動神經(jīng)元中TDP-43蛋白的聚集。因此認(rèn)為circRNA的轉(zhuǎn)錄可競爭性地抑制其親本基因mRNA的形成[12-13]。

2.3 蛋白編碼調(diào)控 作為一種非編碼RNA，circRNA由于其特殊的結(jié)構(gòu)，無法提供適合的核糖體進(jìn)入位點(diǎn)，被認(rèn)為無法進(jìn)行翻譯。但從1995年起就有研究發(fā)現(xiàn)，外源性circRNA可以募集核糖體，進(jìn)入位點(diǎn)后啟動翻譯機(jī)制，將對應(yīng)的蛋白質(zhì)進(jìn)行翻譯[14]。ZHANG等[15]在肺腺癌組織篩選中發(fā)現(xiàn)，高表達(dá)的circ_0007766可以上調(diào)細(xì)胞周期的關(guān)鍵蛋白Cyclin D1/Cyclin E1/CDK4的表達(dá)，細(xì)胞周期在G0/G1期停滯，但細(xì)胞凋亡未受影響，從而促進(jìn)肺腺癌的惡性增殖。circRNA_104075的過表達(dá)抵消了中藥苦參堿對細(xì)胞增殖的抑制作用，并促進(jìn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251細(xì)胞對細(xì)胞凋亡和自噬的作用，被抑制的Wnt/β-catenin和PI3K/AKT信號通路被circRNA_104075過表達(dá)激活[16]。

3 circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)在疾病中的應(yīng)用

由于circRNA可與疾病相關(guān)的miRNA、蛋白、基因等相互作用，引起異常的表達(dá)。circRNA異常表達(dá)會通過circRNA-miRNA-mRNA調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)參與相關(guān)致病基因的表達(dá)，影響疾病的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)。通過細(xì)胞中circRNA、miRNA和mRNA的差異表達(dá)進(jìn)行篩選，進(jìn)行生物信息學(xué)分析，并獲得與疾病相關(guān)的各類RNA。由于circRNA可作為海綿吸附miRNA并影響其表達(dá)，miRNA的調(diào)整會引起下游靶基因的上調(diào)。部分研究以差異性表達(dá)的miRNA為核心，下游靶基因通過靶向預(yù)測與差異性表達(dá)的mRNA進(jìn)行匹配，得到靶向關(guān)系的miRNA-mRNA。通過篩選得到上游circRNA，并最終得到相對應(yīng)的circRNA-miRNA-mRNA通路，對下游的mRNA及其蛋白進(jìn)行更深入的研究，挖掘circRNA的潛在作用[17]。

3.1 心腦血管疾病 心腦血管疾病是全球死亡的主要原因。包括lncRNA、circRNA和miRNA的非編碼RNA，通過各種機(jī)制參與心腦血管的病理發(fā)展。動脈粥樣硬化是心血管疾病的重要致病因素之一，ZHANG等[18]為了探索circRNA在動脈粥樣硬化中的功能，研究了3只動脈粥樣硬化模型兔的circRNA、miRNA和mRNA的表達(dá)譜，構(gòu)建了差異表達(dá)的circRNA-miRNA-mRNA的網(wǎng)絡(luò)圖，通過生成一個circRNA相關(guān)的內(nèi)源競爭RNA(competing endogenous RNA,ceRNA)網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)了7個circRNA(ocu-cirR-novel-18038，-18298，-15993，-17934，-17879，-18036和-14389)與粥樣動脈硬化有關(guān)，這些circRNA參與了細(xì)胞黏附、細(xì)胞活化和免疫反應(yīng)。證明了circRNA通過在動脈粥樣硬化的發(fā)病機(jī)理中競爭性共享miRNA而充當(dāng)ceRNA來調(diào)節(jié)miRNA。因此circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)在動脈粥樣硬化中可能扮演著重要的角色。TIAN等[19]通過高通量RNA測序研究發(fā)現(xiàn)，在人類急性Stanford A型主動脈夾層的病人中存在506個circRNA顯著失調(diào)，酪氨酸受體激酶Fgr在其中起重要的作用。通過差異性表達(dá)發(fā)現(xiàn)Fgr的上游調(diào)節(jié)分子circMARK3，可作為該疾病診斷的潛在生物標(biāo)志物。評估血清中circMARK3和miR-1273-3p的表達(dá)，能進(jìn)一步提高診斷的靈敏度和特異性。

3.2 骨骼疾病 SHEN等[20]對豬骨骼肌中的lncRNA和circRNA的表達(dá)進(jìn)行全基因多樣性分析，鑒定出差異性表達(dá)的111個lncRNA和137個circRNA參與了糖酵解、氧化還原和ATP代謝。進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)circRNA290-miR27b-Foxj3和circRNA9210-miR-23a-MEF2C兩個競爭性網(wǎng)絡(luò)與肌肉纖維的轉(zhuǎn)換密切相關(guān)。XIAO等[21]通過illumine測序平臺對骨關(guān)節(jié)炎病人的膝關(guān)節(jié)髁中的circRNA的表達(dá)，共鑒定出hg_circ_0007474等197個差異性表達(dá)的circRNA，21個目標(biāo)miRNA和2 466個相關(guān)基因，其中hsa_circ_0045714、hsa_circ_0002485和hsa_circ_0005567三個circRNA與該疾病密切相關(guān)。成骨細(xì)胞的形成與破骨細(xì)胞的吸收動態(tài)維持骨穩(wěn)定。在破骨細(xì)胞過度活化誘導(dǎo)骨穩(wěn)定態(tài)失調(diào)的研究中，RANKL+CSF1處理后的破骨細(xì)胞顯著誘導(dǎo)circRNA_28313的表達(dá)。circRNA_28313的敲除會抑制RANKL+CSF1誘導(dǎo)的骨髓單核細(xì)胞/巨噬細(xì)胞內(nèi)破骨細(xì)胞的分化。因此circRNA_28313被認(rèn)為通過充當(dāng)ceRNA緩解miR-195a介導(dǎo)的對CSF1的抑制，來調(diào)節(jié)破骨細(xì)胞的分化，影響卵巢切除誘導(dǎo)的小鼠骨吸收[22]。此外骨形態(tài)蛋白2通過circ19142/circ5846靶向的miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)誘導(dǎo)成骨細(xì)胞分化。hsa_circ_0005846和has_circ_0019142分別與51和21個miRNA相互作用，并且都充當(dāng)miR-70675p的海綿，此外它們還參與了FGF、EGF、PDGF和Wnt信號通路[23]。

3.3 腫瘤 由于circRNA可與腫瘤相關(guān)的miRNA、基因等相互作用，其異常表達(dá)會引起癌變。circRNA的異常表達(dá)通過circRNA-miRNA-mRNA影響細(xì)胞周期。藥物控制是肝細(xì)胞癌病人的重要治療方法，XIONG等[24]通過構(gòu)建circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)，發(fā)現(xiàn)has_circRNA_100291和has_circRNA_104515可以作為ceRNA在肝細(xì)胞癌中發(fā)揮關(guān)鍵作用，在此基礎(chǔ)上確定了7個基因(JUN、MYCN、AR、ESR1、FOXO1、IGF1和CD34)，并將地西他濱、吉非替尼和BW-B70C確定為肝細(xì)胞癌的治療藥物。XIAO等[25]通過該網(wǎng)絡(luò)圖譜鑒定出4個關(guān)鍵基因，并篩選出對胰腺導(dǎo)管腺癌有潛在治療價值的南蛇藤醇等3種活性物質(zhì)。CHENG等[26]首先發(fā)現(xiàn)了miR-124和miR-29b與胃癌中的circHIPK3表達(dá)相關(guān)，miR-124和miR-29b在胃癌病人中表達(dá)持續(xù)下調(diào)，circHIPK3對miR-124/miR-29b的表達(dá)起負(fù)調(diào)節(jié)作用，并抑制胃癌細(xì)胞的增殖。通過篩選circHIPK3對miR-124/miR-29b網(wǎng)絡(luò)中的共同靶標(biāo)，確認(rèn)COL1A和COL4A1兩種人類膠原蛋白基因為胃癌病人預(yù)后的生物標(biāo)志物。在對102個原代胃癌組織中的ciRS-7的表達(dá)水平進(jìn)行評估并驗證發(fā)現(xiàn)，作為miRNA-7海綿的ciRS-7的表達(dá)顯著上調(diào)，過表達(dá)的ciRS-7阻斷的miR-7誘導(dǎo)的腫瘤，通過拮抗miR-7介導(dǎo)的PTEN/PI3K/AKT途徑抑制MGC-803和HGC-27細(xì)胞，并導(dǎo)致更具侵襲性的致癌表型[27]。XIA等[28]在前列腺病人中發(fā)現(xiàn)了1 021個差異表達(dá)的circRNA，其中circ_0057558與總膽固醇呈正相關(guān)。通過circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)分析發(fā)現(xiàn)，circ_0057558和circ_0034467調(diào)節(jié)miR-6884的表達(dá)，而circ_0062019和circ_0060325影響miR-5008的表達(dá)。因此推斷circ_0062019和circ_0057558的差異性表達(dá)與宿主基因SLC19A1可用作前列腺癌的標(biāo)志物。在乳腺癌病人MCF-7細(xì)胞中，has_circ_0011946的海綿miR-26a/b直接靶向基因RFC，敲除該基因可抑制RFC3 mRNA和蛋白的表達(dá)，has_circ_0011946/RFC3信號通路的失活可顯著抑制MCF-7細(xì)胞的遷移和入侵[29]。由于circRNA的高穩(wěn)定性，因此將circRNA的異常表達(dá)作為治療靶點(diǎn)或標(biāo)志物，可作為檢測和治療癌癥的新的有效途徑。

3.4 其他疾病 QIAN等[30]在系統(tǒng)性紅斑狼瘡病人中發(fā)現(xiàn)，circPTPN22的親本基因PTPN22是T細(xì)胞活化的有效調(diào)節(jié)劑。circPTPN22的下調(diào)與其系統(tǒng)性紅斑狼瘡疾病活動指數(shù)評分呈負(fù)相關(guān)。評分較高的病人circPTPN22表達(dá)水平較低，長期激素治療會顯著增加circPTPN22的水平。非酒精性脂肪性肝炎被認(rèn)為是非酒精性肝病的重要階段，肝細(xì)胞中的脂質(zhì)沉淀而沒有酒精過度消耗，但其詳細(xì)機(jī)制尚不明確。JIN等[31]通過蛋氨酸和膽堿缺乏癥飲食建立非酒精性脂肪性肝炎小鼠模型。最初通過微陣列篩選肝臟circRNA和mRNA譜，隨后進(jìn)行qRT-PCR驗證。通過qRT-PCR驗證重疊預(yù)測的miRNA作為circRNA的下游靶標(biāo)和mRNA的上游調(diào)節(jié)子，構(gòu)建了circRNA_002581-miR-122-Slc1a5，circRNA_002581-miR-122-Plp2，circRNA_002581-miR-122-Cpeb1和circRNA_007585-miR-326-UCP四種circRNA-miRNA-mRNA途徑，但目前僅基于動物模型階段。黃斑變性與年齡密切相關(guān)，SU等[32]構(gòu)建了具有303個circRNA節(jié)點(diǎn)，4個miRNA節(jié)點(diǎn)和51個mRNA節(jié)點(diǎn)的circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)，通過分析確定了hsa_circRNA9329/hsa_miR-9/SCD的調(diào)控軸，促進(jìn)巨噬細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥和病理性血管的形成，從而導(dǎo)致的黃斑變性的發(fā)生。在對膿毒癥誘導(dǎo)的肺損傷后的巨噬細(xì)胞極化作用的研究中發(fā)現(xiàn)，上調(diào)的circRNA參與多種生物學(xué)功能，如調(diào)節(jié)線粒體分布和Notch結(jié)合，而下調(diào)的circRNAs主要參與生物學(xué)過程中組蛋白H3K27的甲基化，TGF-β信號通路與上調(diào)的circRNA有關(guān)[33]。

4 小結(jié)與展望

隨著高通量測序與生信技術(shù)的快速發(fā)展，在組織中發(fā)現(xiàn)了多種具有穩(wěn)定結(jié)構(gòu)特征的circRNA，涉及到不同的細(xì)胞過程，包括生長、衰老、凋亡等。已經(jīng)確定的一些與各疾病相關(guān)的失調(diào)的circRNA的表達(dá)譜，通過circRNA-miRNA-mRNA網(wǎng)絡(luò)，可將其作為疾病的臨床診斷標(biāo)志物和靶向藥物的尋找工具。盡管對于circRNA的研究和認(rèn)識以及構(gòu)建的circRNA-miRNA-mRNA還較為局限，隨著研究的深入，在未來人類疾病信號通路中具有更為新穎的作用。