董國璋綜述，許 林審校

0 引 言

癌癥是世界上第二大死亡原因，到2030年，估計(jì)死亡人數(shù)將增加1310萬[1]，其特征在于細(xì)胞不受控制的增殖，并且可在身體任何部位發(fā)育。我國目前已經(jīng)成為腫瘤發(fā)病率和病死率第一的國家[2]，并且腫瘤的發(fā)病率和病死率仍在逐漸增長。盡管目前腫瘤的治療方法在手術(shù)治療、靶向治療、免疫治療等領(lǐng)域取得了諸多進(jìn)展，但是腫瘤的生存率改善仍然有限，5年生存率依舊不高。因?yàn)榇蟛糠值哪[瘤患者在確診時(shí)已經(jīng)處于中晚期或已經(jīng)發(fā)生了遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移。因此，如果能較早發(fā)現(xiàn)腫瘤并進(jìn)行治療干預(yù)，將會(huì)提高患者的5年生存率。

揮發(fā)性有機(jī)物(volatile organic compounds，VOCs)是指常溫下以蒸汽形式存在于空氣中的一類有機(jī)物，美國環(huán)境保護(hù)委員會(huì)將蒸氣壓小于0.1 mmHg設(shè)定為VOCs的判定標(biāo)準(zhǔn)。人體內(nèi)VOCs可根據(jù)來源分為內(nèi)源性和外源性的VOCs[3]。內(nèi)源性的VOCs主要由細(xì)胞的基礎(chǔ)功能如維持細(xì)胞膜完整性、能量代謝、氧化應(yīng)激等過程產(chǎn)生[4]。外源性的VOCs主要存在于呼氣中，這些VOCs從外界吸入并且同內(nèi)源性的VOCs一起呼出。揮發(fā)性有機(jī)化合物是細(xì)胞代謝的最終產(chǎn)物，可能是由于癌細(xì)胞的基因或蛋白質(zhì)改變導(dǎo)致細(xì)胞膜氧化應(yīng)激或過氧化而產(chǎn)生的。揮發(fā)性有機(jī)碳可反映任何因炎癥、壞死、癌癥退化、微生物區(qū)系改變而引起的代謝變化，也可與環(huán)境污染、藥物和飲食[5]等外部因素有關(guān)。這些代謝物被釋放到血液中，在體內(nèi)的任何地方產(chǎn)生，均會(huì)到達(dá)肺泡、腎小管和消化道中。在過去的二十年里，VOCs檢測已經(jīng)應(yīng)用于各種臨床場景。本文將對(duì)各種揮發(fā)性有機(jī)物分析在腫瘤中的研究現(xiàn)狀作一綜述。

1 揮發(fā)性有機(jī)物檢測方法

1.1 GC-MSGC-MS是目前應(yīng)用最為廣泛的揮發(fā)性有機(jī)物檢測方法。1971年，Pauling等[6]率先對(duì)代謝物的揮發(fā)性部分進(jìn)行了分析，使用氣相色譜-質(zhì)譜儀(Gas chromatography-mass spectrometry, GC-MS)描述了人類呼氣和尿液中約250種揮發(fā)性有機(jī)化合物的存在。1985年Gordon等[7]首次使用GC-MS測定了肺癌患者呼氣中VOCs。自此，VOCs分析在癌癥檢測的臨床潛力引起了人們的興趣，最近30年來發(fā)表的論文數(shù)量迅速增加也有力證明了這一點(diǎn)。同時(shí)，不僅是肺癌，在很多其他癌種中GC-MS測定VOCs都表現(xiàn)出了不錯(cuò)的效果。GC-MS可對(duì)樣品中的揮發(fā)性分子進(jìn)行物理分離，并隨后對(duì)其性質(zhì)和數(shù)量進(jìn)行鑒定，以確定被分析樣品的確切組成。通過提供有關(guān)樣本成分的定性和定量信息，這種分析技術(shù)可識(shí)別與健康對(duì)照組相比的腫瘤患者的代謝特征。目前，關(guān)于GC-MS測定VOCs的臨床研究已經(jīng)在陸續(xù)開展，這些研究大多采用病例對(duì)照的方法。選擇腫瘤患者為病例組，非臨床診斷為腫瘤的健康患者為對(duì)照組，比較2組患者收集的VOC譜。如果一種已鑒定的揮發(fā)性有機(jī)化合物的濃度在這2組之間有統(tǒng)計(jì)學(xué)上的不同，該化合物就被認(rèn)為是一個(gè)生物標(biāo)志物。這些研究確定的腫瘤生物標(biāo)志物在很大程度上是不一致的，且在各個(gè)癌種中的生物標(biāo)志物也是各不相同。

盡管GC-MS具有效率高的優(yōu)點(diǎn)，但其成本高、可管理性差等，限制了其在大規(guī)模篩查中的常規(guī)應(yīng)用。此外其在分析過程中尚未形成標(biāo)準(zhǔn)化的檢測方法，導(dǎo)致VOCs檢測受氣體收集方法、設(shè)備、方法的敏感性及檢測環(huán)境等多個(gè)方面影響，其重復(fù)性和穩(wěn)定性有待進(jìn)一步驗(yàn)證。

1.2 選擇離子流動(dòng)管質(zhì)譜法(selected Ion flow tube mass spectrometry, SIFT-MS)SIFT-MS是一種定量質(zhì)譜儀技術(shù)，可實(shí)時(shí)測量潮濕空氣樣品中微量氣體分子的濃度。1999年Spanel等[8]首次利用該方法對(duì)膀胱癌和前列腺癌患者尿液中的甲醛進(jìn)行測定。之后也有很多文獻(xiàn)報(bào)道使用該方法對(duì)于胃食管癌[9]、結(jié)直腸癌[10]、肺癌[11]等樣品的VOCs進(jìn)行檢測，其結(jié)果同樣具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。SIFT-MS在高通量和實(shí)時(shí)分析氣體樣本中的VOCs顯示出了巨大的潛力，不過由于其工作原理及零件構(gòu)成使得其成本較高，儀器體積較大，且在呼氣樣本以外的應(yīng)用較罕見。

1.3 電子鼻技術(shù)及其他檢測方法電子鼻技術(shù)是一系列化學(xué)傳感器以及特定的識(shí)別方法組合而成的儀器，該傳感器能夠在化學(xué)類別的VOC存在的情況下產(chǎn)生電響應(yīng)，給出定性的響應(yīng)，而非特定響應(yīng)。因此電子鼻不能識(shí)別單一揮發(fā)性有機(jī)化合物，但就像人類嗅覺一樣，其可檢測不同化學(xué)類別的組合，如烷烴、酒精和芳香化合物[12]。電子鼻技術(shù)比GC-MS更快、更易操作，可通過模式識(shí)別來識(shí)別特定的狀態(tài)。該方法簡便，易攜，在早期腫瘤的篩查中具有很大潛力。其他檢測方法如質(zhì)子轉(zhuǎn)移反應(yīng)質(zhì)譜法[13]、離子遷移質(zhì)譜法[14]等報(bào)道較少，其靈敏度及特異性需要進(jìn)一步進(jìn)行臨床研究驗(yàn)證。

2 不同樣本中的揮發(fā)性有機(jī)物

2.1 呼出氣呼出氣樣本由于其收集方便，易于存儲(chǔ)等優(yōu)勢，成為了最早應(yīng)用于VOCs檢測的樣本。其在肺癌、胃食管癌、結(jié)直腸癌、乳腺癌等中均有應(yīng)用。

呼出氣VOCs用于肺癌診斷及篩查的研究進(jìn)行的最多也最早。有研究分析了12例肺癌患者及健康對(duì)照者之間不同的質(zhì)譜峰值分析圖，從而提出呼出氣體中的28種有機(jī)化合物可作為候選的肺癌標(biāo)志性氣體成分[7，15]，這一發(fā)現(xiàn)提示了VOCs在肺癌篩查中的巨大潛力。此后在肺癌患者的呼吸中也發(fā)現(xiàn)了鄰甲苯胺，苯胺和脂質(zhì)過氧化活性的改變[16-17]。Michael Phillips是呼吸研究領(lǐng)域的先驅(qū)之一，利用GC-MS進(jìn)行了三項(xiàng)獨(dú)立的肺癌生物標(biāo)記物發(fā)現(xiàn)研究[18-20]，鑒于這些研究得出的生物標(biāo)志物各不相同，但主要的生物標(biāo)志物主要是烷烴衍生物，這在其所有三項(xiàng)研究中都是一致的。與健康對(duì)照組相比，肺癌參與者中大多數(shù)VOCs的相對(duì)豐度降低；這種差異可能歸因于肺癌中CYP450基因激活導(dǎo)致脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物分解增加[21]。然而，還有許多其他研究表明烷烴與肺癌無關(guān)[21-23]。這些研究均未評(píng)估檢測到的VOCs的來源。事實(shí)上，大多數(shù)揮發(fā)性有機(jī)物在呼氣中的作用機(jī)制仍不清楚。Hakim等[24]總結(jié)了肺癌相關(guān)揮發(fā)性有機(jī)化合物可能的生化途徑。目前尚無一致且有效的肺癌VOCs生物標(biāo)志物的報(bào)道。造成這些不一致的原因是多方面的，不同的研究在呼吸采樣程序、研究設(shè)計(jì)(對(duì)照組的選擇、患者的選擇等)和數(shù)據(jù)分析方法方面有很大的差異。

近些年，其他腫瘤患者的呼出氣研究也相繼出現(xiàn)。Peng等[5]發(fā)表了首次使用定制的納米傳感器陣列對(duì)腫瘤患者進(jìn)行代謝性呼氣分析，該陣列基于有機(jī)功能化的金納米顆粒(gold nanoparticles，GNPs)和SPME-GC-MS分析，以確定合適的代表性VOCs來區(qū)分這些類型的癌癥。呼吸樣本來自26例結(jié)腸癌患者、30例肺癌患者、22例乳腺癌患者、18例前列腺癌患者和22例健康對(duì)照。GNP陣列在區(qū)分結(jié)腸癌患者和健康對(duì)照方面顯示出很高的鑒別能力。2013年，Altomare等[25]利用TD-GC-MS分析了37例結(jié)腸癌患者和41例健康對(duì)照的呼吸樣本，識(shí)別出15種VOC模式，其靈敏度為86%，特異度為83%，準(zhǔn)確率為85%，ROC曲線下面積(AUC)為0.85%。呼出的VOC模式的辨別能力隨后在另一系列25名受試者的盲目階段進(jìn)行了驗(yàn)證，準(zhǔn)確率為76%[26]。2015年Kumar等[27]分析了81例食管(n=48)或胃腺癌(n=33)和129例包括Barrett上皮化生(n=16)，良性上消化道疾病(n=62)或正常的患者的呼氣樣本(n=51)。篩選出了十二種VOCs(戊酸，己酸，苯酚，甲基苯酚，乙基苯酚，丁醛，戊醛，己醛，庚醛，辛酸，壬醛和癸醛)的濃度顯著高于癌旁組(P<0.05)。Chen等[28]更進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)了可通過呼出氣VOCs檢測來不僅能將胃癌病人與正常人區(qū)分開來，同時(shí)也可區(qū)分出早期胃癌和晚期胃癌，使VOCs檢測腫瘤更為精確，為臨床病情評(píng)估提供了更為精確的依據(jù)。

2.2 尿液尿液中含有高濃度的揮發(fā)性代謝物，且收集和存儲(chǔ)較為方便，使其成為揮發(fā)性有機(jī)化合物分析的另一個(gè)極具吸引力的目標(biāo)。Silva等[29]用動(dòng)態(tài)固相微萃取(DHS-SPME)結(jié)合GC-MS評(píng)價(jià)了腫瘤患者和健康對(duì)照組中尿VOCs譜的差異。腫瘤組包括14例白血病患者、12例結(jié)直腸癌患者和7例淋巴瘤患者，并與21例健康對(duì)照組進(jìn)行比較。在對(duì)照組和腫瘤學(xué)組中共鑒定出82種不同化學(xué)類別的揮發(fā)性代謝物。其中苯類衍生物，萜類化合物和苯酚在腫瘤患者組中最常見，而酮和硫化合物在健康受試者尿液中含量更多。結(jié)果表明在尿液中，腫瘤患者和健康志愿者之間的VOCs濃度有著顯著差異。

另外，在英國考文垂和沃里克郡的大學(xué)醫(yī)院進(jìn)行過兩項(xiàng)研究。第一項(xiàng)研究使用FAIMS儀器和Combi-PAL ITEX自動(dòng)預(yù)濃縮系統(tǒng)，結(jié)合從83例結(jié)腸癌患者和50例健康對(duì)照獲得的GC-MS來評(píng)估尿樣[30]。該研究結(jié)腸癌組于健康對(duì)照組兩組之間的敏感性為88%，特異性為60%。在第二項(xiàng)研究中，作者開發(fā)了一種專用電子鼻系統(tǒng)，該系統(tǒng)由13個(gè)傳感器組成，測試了該系統(tǒng)對(duì)92份尿樣(包括39例結(jié)腸癌患者、35例腸易激綜合征患者和18例健康對(duì)照)尿液中的VOCs。與其他兩組相比，該研究檢測結(jié)直腸癌的靈敏度為78%，特異度為79%[31]。近些年來，尿液也被應(yīng)用于胰腺癌和前列腺癌的無創(chuàng)診斷[32-33]。各種研究均證實(shí)了腫瘤患者尿樣中可識(shí)別的代謝紊亂的存在，以及尿液作為一種潛在的易于獲得的生物樣本進(jìn)行篩查的有效性。

2.3 其他對(duì)于VOCs的研究不僅只局限于呼出氣和尿液。很多學(xué)者在其他樣本，如糞便、膽汁等中同樣做出了嘗試。2014年De等[34]首次報(bào)道了糞便樣本分析經(jīng)驗(yàn)，監(jiān)測了40例結(jié)腸癌患者、60例晚期結(jié)腸腺瘤患者和57例健康對(duì)照。對(duì)35例結(jié)腸癌、46例晚期腺瘤和52例對(duì)照組的糞便標(biāo)本進(jìn)行檢測。在結(jié)直腸癌患者和對(duì)照組的比較中顯示出85%和87%的靈敏度和特異度。將晚期腺瘤患者與對(duì)照組進(jìn)行比較，其敏感度為62%，特異度為86%。對(duì)結(jié)直腸癌和晚期腺瘤患者進(jìn)行比較，敏感性為75%，特異性為73%。Batty等[10]通過 SIFT-MS分析篩選出了糞便中3種可能的結(jié)腸癌生物標(biāo)志物硫化氫、二甲基硫化物和二甲基二硫化物。有研究首次使用膽汁作為樣本,分別篩選出了胰腺癌和膽管癌可能的生物標(biāo)志物(乙醇，丙烯腈，乙腈，乙醛，苯，二硫化碳，二甲基硫，2-普萘洛爾)，并且采用機(jī)器學(xué)習(xí)等方法建立篩選模型，使檢測結(jié)果敏感性和特異性顯著增高(敏感性為93.5%，特異性為100%)[35-37]。

3 結(jié)語與展望

VOCs檢測用于癌癥的早期篩查和診斷是一個(gè)迅速發(fā)展的領(lǐng)域。各項(xiàng)證據(jù)表明，腫瘤的發(fā)生發(fā)展中存在代謝組學(xué)的紊亂，并且可通過呼氣、尿液、糞便等多種方法檢測出來。VOCs作為腫瘤的“氣味印記”，表現(xiàn)出了相當(dāng)不錯(cuò)的潛力。這種“氣味印記”可通過不同分析平臺(tái)和基質(zhì)來進(jìn)行評(píng)估，并且可以無創(chuàng)而有效的實(shí)現(xiàn)腫瘤的早期篩查和早期診斷。但是由于缺乏標(biāo)準(zhǔn)化的實(shí)驗(yàn)流程，至今無統(tǒng)一評(píng)估標(biāo)準(zhǔn)。盡管已經(jīng)基本確定最常見的代謝化學(xué)物為烷烴和芳香族化合物，但各個(gè)研究之間差異仍然較大，較難形成統(tǒng)一的結(jié)果。

為了使VOCs能夠進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為臨床廣泛使用的生物標(biāo)志物，需要再以下三個(gè)關(guān)鍵領(lǐng)域取得進(jìn)展：①開發(fā)標(biāo)準(zhǔn)化和靈活的氣體樣本采集方案；②經(jīng)過仔細(xì)的研究設(shè)計(jì)和外部驗(yàn)證的縱向多中心臨床試驗(yàn)；③對(duì)于腫瘤發(fā)生發(fā)展過程中所涉及的生化途徑進(jìn)一步探究，直接證明VOCs的生化來源。我們相信，這些發(fā)現(xiàn)最終將有助于VOCs檢測成為一種腫瘤早期篩查和早期診斷技術(shù)的發(fā)展，使VOCs檢測能夠?qū)崿F(xiàn)其發(fā)展?jié)摿?，并成為個(gè)性化醫(yī)學(xué)診療中的關(guān)鍵工具。