閆然，上官藝，仇鑫，李子孝，3

動脈粥樣硬化是心腦血管疾病最重要的病因之一。近來的研究表明，意義不明的克隆性造血（clonal hematopoiesis of indeterminate potential，CHIP）與心腦血管疾?。╟ardiovascular and cerebrovascular disease，CVD）風(fēng)險增加相關(guān)，包括動脈粥樣硬化、心肌梗死和缺血性卒中。DNA甲基化酶3A（DNA methylase 3 alpha，DNMT3A）基因為CHIP中最常見的突變基因之一[1-2]，可通過對基因進(jìn)行表觀遺傳學(xué)修飾（DNA甲基化）而調(diào)控基因表達(dá)，引起多種疾病的發(fā)生。本文通過檢索近年來相關(guān)文獻(xiàn)，探討DNMT3A基因突變在動脈粥樣硬化中的可能作用機(jī)制，旨在探索心腦血管疾病治療的新途徑。

1 DNMT3A與CHIP

CHIP是一種由體細(xì)胞突變引起的生物學(xué)狀態(tài)，用以描述存在血液腫瘤相關(guān)基因突變但還未出現(xiàn)腫瘤的現(xiàn)象，其本質(zhì)是基因突變。隨著年齡的增長，個體造血干/祖細(xì)胞（hemopoietic stem and progenitor cell，HSPC）發(fā)生體細(xì)胞突變，其中一些基因的突變可促進(jìn)特定白細(xì)胞克隆的競爭優(yōu)勢和擴(kuò)張，當(dāng)這些突變的變異等位基因頻率（variant allele frequency，VAF）≥2%且無嚴(yán)重的細(xì)胞減少癥或世界衛(wèi)生組織定義的其他血液學(xué)疾病時，被定義為CHIP。因此，CHIP是一種與年齡相關(guān)的現(xiàn)象，在70歲以上的人群中發(fā)生率在10%以上，且90%的CHIP相關(guān)基因突變攜帶者只具有單一驅(qū)動基因的突變。引起CHIP發(fā)生的基因有幾十個，大多數(shù)參與表觀遺傳調(diào)控，DNMT3A基因是其中最常見的驅(qū)動突變基因之一，甚至可占CHIP患者的50%以上[1]。

DNMT3A基因位于染色體2p23，由26個外顯子和25個內(nèi)含子組成，可編碼一種催化甲基轉(zhuǎn)移到DNA中特定CpG結(jié)構(gòu)的酶——DNMT3A。DNMT3A對非甲基化和半甲基化DNA底物具有相同的親和力，其主要功能是參與從頭DNA甲基化過程。DNMT3A基因突變使DNA甲基化過程發(fā)生紊亂，包括基因組DNA總體甲基化水平減低以及部分基因啟動子區(qū)域CpG島甲基化水平增高，從而控制基因的表達(dá)。此外，DNMT3A基因突變可改變骨髓造血干細(xì)胞（hematopoietic stem cell，HSC）的自我更新能力，使其具有向髓系分化以及轉(zhuǎn)變?yōu)閻盒阅[瘤的傾向性[3-5]。有研究顯示，攜帶DNMT3A基因突變的HSPC可能通過促進(jìn)炎癥而改變骨髓微環(huán)境，導(dǎo)致更持久的造血功能改變并導(dǎo)致HSPC有更易受損的傾向性[6]。

2 DNMT3A基因突變與心腦血管疾病

越來越多的研究顯示DNMT3A基因突變在CVD的發(fā)病機(jī)制中起著重要作用。Bick等[7]的研究表明DNMT3A基因突變與包括心肌梗死、冠狀動脈血運(yùn)重建術(shù)、卒中和死亡在內(nèi)的心血管事件的發(fā)生獨立相關(guān)，特別是當(dāng)VAF較大（VAF≥10%）時，患者具有更大的亞臨床動脈粥樣硬化負(fù)擔(dān)，發(fā)生心血管事件的風(fēng)險也顯著提升（HR1.59，95%CI1.21～2.09，P＜0.001）。在另一項研究中，研究者發(fā)現(xiàn)DNMT3A基因突變患者發(fā)生冠心病的風(fēng)險是健康對照組的1.7倍（HR1.7，95%CI1.1～2.6，P=0.01），且早發(fā)（≤50歲）心肌梗死患者攜帶DNMT3A基因等CHIP相關(guān)基因突變的概率是健康對照組的4倍（OR4.0，95%CI2.4～6.7，P＜0.001）[2]，進(jìn)一步表明雖然DNMT3A基因等CHIP相關(guān)基因突變的發(fā)生與年齡密切相關(guān)，但與年輕患者心血管疾病的發(fā)生也有相關(guān)性。作為心腦血管疾病的重要危險因素，高血壓的發(fā)生也與DNMT3A基因突變相關(guān)。近年來的研究認(rèn)為DNA甲基化程度與血管緊張素轉(zhuǎn)換酶（angiotensin converting enzyme，ACE）活性和收縮壓水平呈明顯負(fù)相關(guān)，DNMT3A表達(dá)下調(diào)會阻止腫瘤壞死因子α（tumor necrosis factor，TNF-α）誘導(dǎo)的ACE mRNA和蛋白質(zhì)的水平下降，進(jìn)而調(diào)節(jié)內(nèi)皮細(xì)胞炎癥反應(yīng)中ACE的表達(dá)水平，使血壓升高[8]。相較于在心血管領(lǐng)域，目前在腦血管領(lǐng)域進(jìn)行的DNA甲基化及DNMT3A基因相關(guān)的研究相對較少，需要更多的研究來進(jìn)行探索。

3 DNMT3A基因突變與動脈粥樣硬化

動脈粥樣硬化是一種血管壁內(nèi)的慢性炎癥疾病，其發(fā)生與多種免疫細(xì)胞作用相關(guān)，是冠心病、卒中等心腦血管疾病發(fā)病的病理基礎(chǔ)。研究表明，DNMT3A基因突變可通過巨噬細(xì)胞、肥大細(xì)胞、T細(xì)胞、單核細(xì)胞等多種免疫細(xì)胞及炎癥、斑塊穩(wěn)定性等多種作用機(jī)制影響動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展過程。

白細(xì)胞在人類動脈粥樣硬化斑塊中大量存在，而巨噬細(xì)胞是動脈粥樣硬化中最豐富的白細(xì)胞類型。在小鼠模型研究中，Sano等[9]通過CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)使DNMT3A基因發(fā)生失活突變，隨后將血管緊張素Ⅱ輸注至小鼠體內(nèi)，結(jié)果在心肌組織中可觀察到更多巨噬細(xì)胞蓄積，伴隨著免疫細(xì)胞標(biāo)志物（包括CD68、CD3e、CD4和CD8）的轉(zhuǎn)錄水平升高，提示DNMT3A缺乏會導(dǎo)致心肌炎癥的增加。進(jìn)一步在脂多糖處理后，可觀察到細(xì)胞中趨化因子配體1（chemokine ligand 1，CXCL1）、趨化因子配體2（chemokine ligand 2，CXCL2）、IL-6和趨化因子配體5（chemokine ligand 5，CCL5）等炎癥因子表達(dá)水平上調(diào)，證明DNMT3A在炎癥反應(yīng)中的作用具有復(fù)雜性。還有研究認(rèn)為DNMT3A可通過作用于組蛋白去乙?；?（histone deacetylase 9，HADC9）引起TANK結(jié)合激酶1（TANK binding kinase 1，TBK1）脫乙酰作用來調(diào)控巨噬細(xì)胞，進(jìn)而對炎癥進(jìn)行調(diào)控[10]。近來還有學(xué)者將目光聚焦于斑塊愈合，認(rèn)為動脈粥樣硬化斑塊不穩(wěn)定和愈合之間的平衡被打破很可能是臨床急性血管事件發(fā)生的基礎(chǔ)[11]。在動物實驗和臨床研究中，M2巨噬細(xì)胞都已被證明在動脈粥樣硬化斑塊穩(wěn)定性和動脈粥樣硬化消退中有潛在作用[12-13]。IL-4、IL-13等細(xì)胞因子可促使M2巨噬細(xì)胞分泌抗炎細(xì)胞因子，如IL-10等。這些抗炎細(xì)胞因子能夠抵消M1巨噬細(xì)胞的促炎活性，并促進(jìn)組織修復(fù)。M2a巨噬細(xì)胞可生成促進(jìn)纖維化的因子，如轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）等，促進(jìn)動脈粥樣硬化斑塊愈合[14-16]。DNMT3A基因突變可能通過巨噬細(xì)胞促進(jìn)炎癥、影響斑塊穩(wěn)定性等機(jī)制促進(jìn)動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展。

肥大細(xì)胞是動脈粥樣硬化發(fā)展過程中重要的炎癥介質(zhì)，同時也受DNMT3A基因的調(diào)節(jié)。Leoni等[17]發(fā)現(xiàn)DNMT3A在調(diào)節(jié)肥大細(xì)胞對急性刺激和慢性刺激的反應(yīng)中起著關(guān)鍵作用，其認(rèn)為DNMT3A是通過調(diào)節(jié)肥大細(xì)胞中支架蛋白IQGAP2基因的表達(dá)來控制炎癥細(xì)胞因子的表達(dá)，進(jìn)而對炎癥進(jìn)行調(diào)控。在急性刺激下，缺乏DNMT3A的肥大細(xì)胞對微環(huán)境干擾的敏感性增加，釋放胞質(zhì)顆粒的能力顯著提高。同時，各種細(xì)胞因子（包括IL-6、TNF-α和IL-13）的分泌增加。這些效應(yīng)與IQGAP2基因位點的DNA甲基化變化部分相關(guān)，且此過程不依賴活化T細(xì)胞核因子（nuclear factor of activated T cells，NFAT）。除此之外，研究還表明DNMT3A可能存在與DNA甲基化活性無關(guān)的功能，導(dǎo)致了其對炎癥的抑制。需要更多深入的研究來闡明DNMT3A在動脈粥樣硬化過程中對肥大細(xì)胞進(jìn)行調(diào)節(jié)的作用機(jī)制。

此外，Mas-Peiro等[18]的研究表明攜帶DNMT3A基因突變的患者輔助性T細(xì)胞（T helper cell，Th）17與調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（regulatory cell，Tregs）的比例增加。Abplanalp等[19]的研究發(fā)現(xiàn)DNMT3A基因突變攜帶者Th1、Th2、Th17、CD8+效應(yīng)T細(xì)胞、CD4+記憶T細(xì)胞和Treg特異性信號表達(dá)增加。Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞及其分泌的細(xì)胞因子在動脈粥樣硬化的發(fā)生、發(fā)展過程中起著重要作用。在臨床研究和動物實驗中均表明Th17可以促進(jìn)動脈粥樣硬化的炎癥反應(yīng)[20-21]。Treg細(xì)胞在動脈粥樣硬化中發(fā)揮保護(hù)作用[22]，Tregs比例增加可減小動脈粥樣硬化的面積[23]，甚至可使已形成的動脈粥樣硬化消退[24]。Treg細(xì)胞可能分泌IL-10和TGF-β，從而通過降低外周和大腦中的細(xì)胞因子水平，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的激活、減輕局部炎癥反應(yīng)、促進(jìn)斑塊愈合等機(jī)制作用于缺血的腦組織[25]。近來，Sharma等[26]發(fā)現(xiàn)Tregs在動脈粥樣硬化消退過程中富集于斑塊中，對于動脈粥樣硬化炎癥減退和晚期斑塊收縮至關(guān)重要。IL-2、IL-4、IL-13和IFNG基因受T細(xì)胞DNA甲基化的調(diào)控[27-29]，這與在肥大細(xì)胞中觀察到的表型相似，進(jìn)一步證實了DNMT3A在炎癥反應(yīng)調(diào)節(jié)中的重要性。

最近，Abplanalp等[30]的一項單細(xì)胞RNA測序研究發(fā)現(xiàn)，攜帶DNMT3A基因或TET2基因突變的嚴(yán)重變性主動脈瓣狹窄或慢性缺血后心力衰竭患者的外周血單核細(xì)胞顯示IL-1β、IL-6受體，核苷酸結(jié)合寡聚化結(jié)構(gòu)域樣受體蛋白3（nucleotide-binding oligomerization domain-like receptor protein 3，NLRP3）和CD163表達(dá)增加；采用單細(xì)胞RNA測序法分析了6例攜帶DNMT3A基因突變的心力衰竭患者和4例無DNMT3A基因突變的心力衰竭患者外周血單核細(xì)胞的轉(zhuǎn)錄譜，發(fā)現(xiàn)攜帶DNMT3A基因突變的心力衰竭患者IL-1β、IL-6、IL-8、炎性小體NLRP3、巨噬細(xì)胞炎性蛋白趨化因子配體3（chemokine ligand 3，CCL3）和趨化因子配體4（chemokine ligand 4，CCL4）以及增強(qiáng)單核細(xì)胞-內(nèi)皮黏附的抵抗素基因特異性上調(diào)[19]。T細(xì)胞刺激免疫球蛋白超家族成員CD300LB、CD83、唾液酸結(jié)合免疫球蛋白樣凝集素12（sialic acid-binding immunoglobulin-type lectin 12，SIGLEC12）以及CD2配體和細(xì)胞黏附因子CD58的表達(dá)增加，而后者可能參與了單核細(xì)胞與T細(xì)胞的相互作用。

4 展望

DNMT3A基因突變刺激HSPC克隆并使其后代擴(kuò)增，克隆血細(xì)胞可能通過驅(qū)動IL-6、IL-13等細(xì)胞因子及趨化因子的釋放來促進(jìn)動脈粥樣硬化的進(jìn)展，并導(dǎo)致CVD的發(fā)生。未來可能通過進(jìn)一步的研究為CVD的治療提供新靶點，亦或降低CVD的發(fā)病風(fēng)險，如研發(fā)阻斷下游炎癥因子或直接抑制克隆突變的藥物等。目前，與CHIP相關(guān)的其他基因突變研究已有了實質(zhì)性的進(jìn)展，抗炎藥如IL-1β和NLRP3炎性小體的抑制劑可作為CHIP相關(guān)CVD的潛在療法[31]，相信通過對DNMT3A的進(jìn)一步研究可為該病因卒中患者提供更精準(zhǔn)的治療方案。

綜上所述，DNMT3A可能通過影響炎癥、斑塊穩(wěn)定性、血壓等作用于動脈粥樣硬化，進(jìn)而造成心腦血管疾病的發(fā)生、發(fā)展。目前，對CHIP在心腦血管疾病中作用機(jī)制的研究尚處于初期階段，未來研究要進(jìn)一步明確DNMT3A在心腦血管疾病中的作用通路，將有助于進(jìn)一步研究心腦血管疾病的病因及制訂針對該突變類型患者的精準(zhǔn)治療策略。

【點睛】DNMT3A基因是CHIP中的熱點突變之一，可通過多種作用影響動脈粥樣硬化，進(jìn)而造成心腦血管疾病的發(fā)生、發(fā)展。目前關(guān)于DNMT3A基因突變在動脈粥樣硬化中的作用機(jī)制的研究尚處于初期階段，需要進(jìn)一步的研究明確其作用通路。