李 娜，霍彩霞*，王振軍，甄志彬

（1.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，內(nèi)蒙古 010110；2.北京四環(huán)制藥有限公司，北京 101113）

索磷布韋（Sofosbuvir，SOF），化學(xué)名為（S）-2-{（S）-{（2R，3R，4R，5R）-5-［2，4-二氧代-3，4-二氫嘧啶-1（2H）-基］-4-氟-3-羥基-4-甲基四氫呋喃-2-基}甲氧基（苯氧基）磷酰基氨基}丙酸異丙酯，相對分子質(zhì)量為529.16［1］。該藥為特異性丙型肝炎病毒（HCV）核苷酸類似物NS5B聚合酶抑制劑，是一種新型直接抗丙型肝炎病毒的藥物（DAA藥物），其可以與NS5B聚合酶活性位點競爭性結(jié)合，使新生病毒基因組合成終止，從而抑制HCV的復(fù)制［2-5］。該藥是Pharmasset和Gilead公司研發(fā)的首個特異性HCV核苷酸類似物NS5B聚合酶抑制劑［6-7］，于2013年12月在美國獲批上市，2014年1月在德國等十幾個歐洲國家上市，2017年9月在中國上市［8-9］。

2013年索磷布韋以其具有泛基因型、SVR（sustained virologic response）高、藥物相互作用少及較高的耐藥屏障，開創(chuàng)了嶄新的丙型肝炎直接抗病毒藥物時代。2017年，達(dá)拉他韋+阿舒瑞韋、索磷布韋+利巴韋林和達(dá)拉他韋+索磷布韋的治療是中國首批在HCV治療中被批準(zhǔn)的全口服DAAs方案［10］。以索磷布韋為基礎(chǔ)的聯(lián)合用藥及復(fù)方制劑如索磷布韋/維帕他韋、索磷布韋/達(dá)拉他韋、索磷布韋/維帕他韋/伏西瑞韋等可以進(jìn)一步提高SVR，為不能耐受其他DAA藥物的患者提供更多治療機(jī)會［11］。

索磷布韋分子結(jié)構(gòu)包含尿嘧啶基團(tuán)、磷酸酯基團(tuán)、磷酰胺基團(tuán)和氨基酸酯基團(tuán)，其中尿嘧啶基團(tuán)結(jié)構(gòu)穩(wěn)定，磷酸酯基團(tuán)、磷酰胺基團(tuán)和氨基酸酯基團(tuán)都容易水解，穩(wěn)定性相對較差。因此索磷布韋原料藥、索磷布韋片及其他含有索磷布韋的復(fù)方制劑在生產(chǎn)、運輸和保存過程中，都應(yīng)該對降解產(chǎn)物進(jìn)行研究和控制。目前文獻(xiàn)未報道索磷布韋的穩(wěn)定性研究數(shù)據(jù)，也未報道其降解產(chǎn)物的制備方法。本論文研究了索磷布韋的主要降解產(chǎn)物及其結(jié)構(gòu)，為其生產(chǎn)、包裝、貯藏提供依據(jù)；制備得到了降解產(chǎn)物標(biāo)準(zhǔn)品，為索磷布韋的質(zhì)量研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 索磷布韋的穩(wěn)定性考查

1.1 索磷布韋固體的穩(wěn)定性考查

1.1.1 索磷布韋固體的穩(wěn)定性考查方法 索磷布韋固體在酸、堿、氧化、高溫和光照條件下的穩(wěn)定性考查方法見表1。

1.1.2 索磷布韋固體的穩(wěn)定性考查結(jié)果 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（Agilent Zorbax SB C18柱，4.6 mm×150 mm，5μm）；以0.01 mol/L醋酸銨溶液（冰醋酸調(diào)pH值至5.3）-乙腈（95∶5）為流動相A，以0.01 mol/L醋酸銨溶液（冰醋酸調(diào)pH值至5.3）-乙腈（10∶90）為流動相B進(jìn)行梯度洗脫；柱溫為40℃；流速為1.0 ml/min；檢測波長為260 nm，依照表1擬定考查方法，分別精密量取各溶液10μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，分別考查各條件下的降解程度。索磷布韋固體在酸、堿、氧化、高溫和光照條件下的穩(wěn)定性考查結(jié)果見表2。試驗結(jié)果表明，索磷布韋固體在以上考查條件下，穩(wěn)定性良好，均無顯著降解。

表1 索磷布韋固體穩(wěn)定性考查方法

表2 索磷布韋固體的穩(wěn)定性考查結(jié)果

1.2 索磷布韋溶液的穩(wěn)定性考查

1.2.1 索磷布韋溶液的穩(wěn)定性考查方法 索磷布韋溶液在酸、堿、氧化、高溫和光照條件下的穩(wěn)定性考查方法見表3。

1.2.2 索磷布韋溶液的穩(wěn)定性考查結(jié)果 用十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（Agilent Zorbax SB C18柱，4.6 mm×150 mm，5μm）；以0.01 mol/L醋酸銨溶液（冰醋酸調(diào)pH值至5.3）-乙腈（95∶5）為流動相A，以0.01 mol/L醋酸銨溶液（冰醋酸調(diào)pH值至5.3）-乙腈（10∶90）為流動相B進(jìn)行梯度洗脫；柱溫為40℃；流速為1.0 ml/min；檢測波長為260 nm，照表3擬定考查方法，分別精密量取各溶液10μl，注入液相色譜儀，記錄色譜圖，分別考查各條件下的降解程度。索磷布韋溶液在酸、堿、氧化、高溫和光照條件下的穩(wěn)定性考查結(jié)果見表4。試驗結(jié)果表明，索磷布韋溶液的穩(wěn)定性較差，在酸性溶液、堿性溶液、氧化、高溫和光照條件下均有降解。

表3 索磷布韋溶液的穩(wěn)定性考查方法

表4 索磷布韋溶液的穩(wěn)定性考查結(jié)果

由以上穩(wěn)定性試驗可知，索磷布韋主要潛在的降解產(chǎn)物是化合物1、化合物2、化合物3、化合物4、化合物5和苯酚，相應(yīng)結(jié)構(gòu)式見圖1。這些降解產(chǎn)物是生產(chǎn)、運輸和保存過程中需要重點關(guān)注的雜質(zhì)。其中，化合物1、化合物2、化合物3和化合物4的合成方法未見文獻(xiàn)報道。

圖1 索磷布韋主要降解產(chǎn)物結(jié)構(gòu)

2 制備方法

2.1 儀器與試劑 索磷布韋（吉林匯康制藥有限公司）；四氫呋喃、氫氧化鈉、鹽酸、二氯甲烷、甲醇等（均北京化工廠，所有試劑均為分析純）。Agilent1260-6120B質(zhì)譜儀（美國安捷倫科技有限公司）；島津LC-20A液相色譜儀（島津公司）；BRUCKER AVANCE400核磁共振波譜儀（德國布魯克科技有限公司）。

2.2 化合物1的合成 向反應(yīng)瓶中加入索磷布韋21.16 g（0.04 mol）和四氫呋喃45.00 g室溫下攪拌至溶清，向體系中滴加氫氧化鈉8.00 g（0.2 mol）與純化水40.00 g配制的混合溶液，攪拌過夜，向體系中緩慢滴加濃鹽酸39.46 g（0.4 mol），升溫至（40±3）℃攪拌24 h，減壓蒸除溶劑，將所得油狀物進(jìn)行硅膠柱層析分離（二氯甲烷-甲醇20∶1～2∶1梯度洗脫），得化合物1（10.74 g，收率79.0%）。ESI-MS（m/z）=339.0［M-H］-，1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ7.76（d，J=8.0 Hz，1H，N-CH=C），6.12（d，J=19.2 Hz，1H，O-CH-N），5.84（d，J=8.0 Hz，1H，C=CH-CO），4.30（dd，J=10.8，4.0Hz，1H，C-CH-O），4.16～3.97（m，3H，PO-CH2-CH-O），1.31（d，J=23.2 Hz，3H，CF-CH3）；13C-NMR（100 MHz，DMSO-d6）δ165.8，151.3，140.9，102.7，100.9（d，J=179.2 Hz），89.1（d，J=37.6 Hz），79.7（d，J=8.3 Hz），70.7（d，J=17.5 Hz），62.6（d，J=4.6 Hz），15.7（d，J=24.8 Hz）。

2.3 化合物2的合成 向反應(yīng)瓶中加入索磷布韋10.00 g（0.019 mol）和四氫呋喃45.00 g，滴加鹽酸7.50g。（0.076 mol）和純化水20.00 g配制的混合溶液，升溫至45℃，保溫攪拌過夜，減壓蒸除溶劑，硅膠柱層析分離（二氯甲烷-甲醇5∶1～1∶1梯度洗脫），得化合物2（6.13 g，收率78.0%）。ESI-MS（m/z）=415.0［M-H］-；1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ11.52（s，1H，OCNH-CO），7.57（d，J=8.0 Hz，1H，C=CH-CO），7.36（t，J=7.9 Hz，2H，Ar-H），7.24～7.06（m，3H，Ar-H），6.64（brs，2H，-OH；P-OH），6.03（d，J=19.5 Hz，1H，O-CH-N），5.52（d，J=8.1 Hz，1H，N-CH=C），4.50～4.14（m，2H，PO-CH2-C），4.02（dd，J=9.0，4.0 Hz，1H，O-CH-C），3.81（d，J=17.1 Hz，1H，O-CH-C），1.25（d，J=22.6 Hz，3H，-CH3）；13C-NMR（100 MHz，DMSOd6）δ162.8，151.1，150.5，139.4，129.7，124.5，120.1，102.3，100.4（d，J=180.0 Hz），88.5，79.5，71.6，65.2，16.6（d，J=25.0 Hz）。

2.4 化合物3的合成 向反應(yīng)瓶中加入索磷布韋10.60 g（0.02 mol）和四氫呋喃60.00 g攪拌至溶清，向體系中加入氫氧化鈉3.20 g（0.08 mol）與純化水12.00 g配制的混合溶液，室溫攪拌過夜，減壓蒸除溶劑，將殘余物硅膠柱層析分離（二氯甲烷-甲醇2.5∶1～1∶1梯度洗脫）。得到化合物3（6.75 g，收率82.0%）。ESI-MS（m/z）=434.1［M+Na］+；1H-NMR（400 MHz，D2O）δ7.89（d，J=8.0 Hz，1H，N-CH=C），6.22（d，J=19.2 Hz，1H，O-CH-N），5.96（d，J=8.0 Hz，1H，C=CHCO），4.27～3.94（m，4H，PO-CH2-CH-CH-O），3.61～3.48（m，1H，N-CH-CO），1.37（d，J=23.2 Hz，3H，CH-CH3），1.27（d，J=6.8 Hz，3H，-CH3）；13C-NMR（100 MHz，D2O）δ183.0，167.2，152.4，140.8，102.9，101.2（d，J=179.0 Hz），89.0（d，J=39.0 Hz），80.1（d，J=9.0 Hz），70.5（d，J=17.0 Hz），61.3，52.4，21.3（d，J=5.0 Hz），15.8（d，J=25.0 Hz）。

2.5 化合物4的合成 反應(yīng)瓶中加入索磷布韋21.16 g（0.04 mol）和四氫呋喃135.00 g，室溫下攪拌至溶清，向體系中滴加氫氧化鈉3.20 g（0.08 mol）與純化水40.00 g配制的混合溶液，滴加完畢后攪拌過夜，減壓蒸除溶劑，將所得殘余物硅膠柱層析分離（二氯甲烷-甲醇5∶1～2∶1梯度洗脫），得化合物4（12.88 g，收率71.0%）。ESI-MS（m/z）=454.1［M+H］+；1H-NMR（400 MHz，DMSO-d6）δ11.63（brs，1H，OCNH-CO），8.00（d，J=8.0 Hz，1H，N-CH=C），6.86（brs，1H，P-OH），5.97（d，J=18.4Hz，1H，O-CH-N），5.67（d，J=8.0 Hz，1H，CH=CH-CO），4.87～4.78（m，1H，OCH-CH3），3.99～3.81（m，4H，PO-CH2-CH-CH-O），3.74～3.60（m，1H，N-CH-CO），3.45（brs，1H，C-OH），3.18～3.16（m，1H，P-NH-C），1.27～1.03（m，12H，4×CH3）；13C-NMR（100MHz，DMSO-d6）δ175.3，163.5，151.2，140.3，102.7，101.5（d，J=179.6 Hz），88.5（d，J=38.1 Hz），81.4（d，J=5.5 Hz），71.1（d，J=17.5 Hz），67.7，61.4，50.6，21.9，21.7，21.5（d，J=4.8 Hz），16.8（d，J=25.1 Hz）。

3 降解產(chǎn)物定向合成討論

在確定了索磷布韋主要降解產(chǎn)物的結(jié)構(gòu)后，進(jìn)一步研究了以索磷布韋為原料，高效定向合成這些降解產(chǎn)物的方法。

3.1 化合物1制備條件的優(yōu)化 化合物1嘗試通過索磷布韋在酸性條件下水解制備（序號1），結(jié)果得到的主要是化合物2；之后嘗試通過索磷布韋在堿性條件下水解制備（序號2），結(jié)果得到的主要是化合物3；索磷布韋在單獨的酸性條件或堿性條件的水解，主產(chǎn)物都不是化合物1。而后又嘗試將索磷布韋先在酸性條件下水解，原料消失以后，再將溶液pH調(diào)至強(qiáng)堿性（序號3），但是得到的主產(chǎn)物仍然是化合物2，在堿性條件下化合物2不會再進(jìn)一步轉(zhuǎn)化為化合物1。最終，通過將索磷布韋首先在堿性條件水解，原料消失以后，再將反應(yīng)溶液調(diào)pH至強(qiáng)酸性反應(yīng)（序號4），得到主產(chǎn)物化合物1，柱層析分離后的收率為79%。化合物1制備條件的優(yōu)化結(jié)果見表5。

表5 化合物1的反應(yīng)條件篩選

3.2 化合物2制備條件的優(yōu)化 化合物2通過索磷布韋的四氫呋喃鹽酸水溶液在40～50℃下緩慢降解制備，研究發(fā)現(xiàn)，鹽酸與索磷布韋的摩爾比對化合物2的收率有明顯的影響，相應(yīng)研究結(jié)果見表6。使用2.0摩爾比的鹽酸時，化合物2的收率僅為36%；增加至4.0摩爾比的鹽酸時，化合物2的收率提高至78%；當(dāng)進(jìn)一步增加鹽酸的摩爾比時，收率無明顯提高，因此使用4.0摩爾比的鹽酸是最優(yōu)反應(yīng)條件。

表6 化合物2的反應(yīng)條件篩選

3.3 化合物3和化合物4制備條件的優(yōu)化 以索磷布韋為原料，使用四氫呋喃和氫氧化鈉水溶液做溶劑，在20～30℃反應(yīng)12～16 h，可以得到化合物3和化合物4。研究表明，氫氧化鈉與索磷布韋的摩爾比對降解產(chǎn)物的比例有顯著影響（見表7）。當(dāng)氫氧化鈉的摩爾比小于2.0時，主要降解產(chǎn)物是化合物4；而氫氧化鈉的摩爾比大于4.0時，主要降解產(chǎn)物是化合物3。使用1.0摩爾比的氫氧化鈉時（序號1），化合物4的收率只有36%；使用2.0摩爾比的氫氧化鈉時（序號2），化合物4收率提高至42%，當(dāng)氫氧化鈉溶液以滴加的方式加入（序號3），化合物4的收率會明顯提高，分離收率達(dá)到71%；使用3.0摩爾比的氫氧化鈉時（序號4），得到的主要是化合物3和化合物4混合物；使用4.0摩爾比的氫氧化鈉時（序號5），得到的主產(chǎn)物是化合物3，分離收率達(dá)到82%，進(jìn)一步將氫氧化鈉用量增加至5.0摩爾比（序號6），收率降低。綜上，制備化合物4的最佳反應(yīng)條件是使用2.0摩爾比的氫氧化鈉，并采用滴加的方式加入；制備化合物3的最佳反應(yīng)條件是使用4.0摩爾比的氫氧化鈉。

表7 化合物3和化合物4的反應(yīng)條件篩選

綜上，索磷布韋在不足量的堿性溶液中，磷酰酚酯鍵優(yōu)先水解，生成化合物4和苯酚，當(dāng)使用過量堿時，氨基酸異丙酯鍵進(jìn)一步水解，得到化合物3。索磷布韋在酸性溶液中，磷酰胺鍵優(yōu)先水解，生成化合物2，化合物2含有結(jié)構(gòu)穩(wěn)定的磷酸二酯鍵，即使再將其置于酸性或堿性溶液中，化合物2也難以繼續(xù)水解，但是，將化合物3或化合物4置于酸性溶液，磷酰胺鍵可以繼續(xù)水解，得到降解產(chǎn)物1。該研究提供了制備索磷布韋降解產(chǎn)物的方法，避免了效率低下的制備液相分離過程，從而為索磷布韋的質(zhì)量研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

本文考查索磷布韋原料藥固體狀態(tài)和溶液狀態(tài)下的穩(wěn)定性，固體狀態(tài)在高溫、高濕、光照條件下穩(wěn)定性良好，加速和長期放置過程也無降解；溶液狀態(tài)在酸、堿、高溫、氧化和光照條件下，易發(fā)生不同程度的降解，產(chǎn)生6個主要降解產(chǎn)物。本文以索磷布韋為原料，進(jìn)一步對其降解產(chǎn)物（化合物1、化合物2、化合物3和化合物4）進(jìn)行定向合成。索磷布韋的穩(wěn)定性研究為索磷布韋原料藥及其制劑的質(zhì)量控制，儲存方法，包裝材料，和生產(chǎn)工藝提供了穩(wěn)定性數(shù)據(jù)；降解產(chǎn)物的制備方法研究，為索磷布韋的質(zhì)量研究提供物質(zhì)基礎(chǔ)。