羅學軍，田介峰，李 冉，3，李瑞明*

（1.天士力控股集團有限公司天士力研究院，天津 300410；2.天士力醫(yī)藥集團股份有限公司創(chuàng)新中藥關鍵技術國家重點實驗室，天津 300410；3.天津中醫(yī)藥大學，天津 301617）

復方丹參滴丸（Dantonic?，美國研發(fā)代號：T89）在美國FDA法規(guī)條件下的研發(fā)經(jīng)歷了將近10年的周期，其中引入了許多重大的科技創(chuàng)新，并獲得一些關鍵問題的突破性進展，這是全球首個由中國自主研發(fā)的產品完成美國FDAⅢ期臨床試驗，也是首個獲得美國FDAⅢ期臨床試驗陽性結果的復方中藥，為一個新的治療藥物品種——復方植物藥用于全球臨床開拓了一條重要的、全新的道路［1］。復方丹參滴丸由丹參（Salviae Miltiorrhizae radix et rhizoma）、三 七（Notoginseng Radix et rhizoma）、冰 片（Borneolum syntheticum）3味中藥組成，藥效成分主要有酚酸類成分（丹參素、原兒茶醛、丹酚酸U、丹酚酸T、丹酚酸D、迷迭香酸、丹酚酸B、丹酚酸A，即《中國藥典》復方丹參滴丸對照指紋圖譜1～8峰）、皂苷類成分（三七皂苷R1、人參皂苷R b1、人參皂苷R g1、和人參皂苷R e等）以及冰片［2］。中藥國際申報CMC研究中，缺少對照品成為其不可避免的瓶頸問題，如果對照品是從非監(jiān)管當局（如FDA、EMA）認可的來源獲得，比如企業(yè)自制的對照品，則需要進行充分的研究，包括制備、結構鑒定、標化、包裝、穩(wěn)定性等［3-5］。為滿足T89質量標準研究、工藝過程控制、臨床樣品的檢測放行、藥效學及藥代學等各項研究，筆者項目團隊分別對從丹參和三七中自制得到其質量要求中所有的對照品共計10種，解決了該產品國際申報中質量研究用對照品稀缺及質量低下這樣一個瓶頸問題。本文以其中三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Re3種對照品為例，介紹其制備研究過程。

1 儀器與試藥

R220 BUCHI旋轉蒸發(fā)儀（瑞士BICHI公司）；玻璃色譜柱（天津市玻璃儀器廠）；LC80-600動態(tài)軸向加壓色譜儀（法國諾華賽公司）；VT6130真空干燥箱；Agilent 1260高效相色譜儀［安捷倫科技（中國）有限公司］；Advance DRX 500 Bruker型核磁共振儀（美國bruker公司）；METTLER XP205電子天平（梅特勒-托利多中國）。三七藥材（批號201505006，云南天士力三七種植有限公司）；D101型大孔吸附樹脂（天津海光）；D941型大孔吸附樹脂；柱層析硅膠（100～200目、200～300目，青島海洋化工）；色譜純乙腈（Dikma）；色譜純甲醇（Sigma）；水為自制超純水；其余試劑均為市售分析純。

2 方法與結果

2.1 3個對照品的純化制備 取三七飲片6 kg，加入6倍量70%乙醇提取兩次（2.5和2 h）；提取液經(jīng)65℃減壓濃縮至含醇量低于5%后用低速大容量多管離心機（4 200 r/min，20 min）離心，得上清液加入填裝好的D101型大孔樹脂色譜柱中，水除雜，用30%乙醇洗脫并收集洗脫液，洗脫液經(jīng)65℃減壓濃縮至含醇量低于5%，加入填裝好的D941型大孔吸附樹脂色譜柱中，水洗并收集洗脫液，65℃減壓濃縮至干，即得三醇組總皂苷。用硅膠（200～300目）柱層析色譜法分離，得到人參皂苷Rg1粗品（22.3 g）及三七皂苷R1和人參皂苷Re的混合粗品（32.1 g），粗品分別經(jīng)動態(tài)軸向加壓色譜進行精制純化，制備得高純度的人參皂苷Rg1（5.3 g）、三七皂苷R1（5.78 g）和人參皂苷Re（5.8 g），作為3個對照品候選物。

2.2 均一化處理及均一性檢測 3個對照品候選物分別用無水乙醇溶解（質量-體積比1∶20），混合均勻，在旋轉蒸發(fā)儀上60℃減壓回收溶劑，濃縮至干后持續(xù)減壓干燥2～4 h。將干燥的對照品候選物分別轉移至研缽，研細混勻即可。分別平鋪于細胞培養(yǎng)皿中，如圖1所示，將表面劃分成16個區(qū)塊，選取其中15個點取樣，每份10 mg，精密稱定，制成供試品溶液。HPLC檢測，以峰面積/稱樣量計算15個樣品的RSD，結果人參皂苷Rg1、三七皂苷R1和人參皂苷Re 15個點RSD分別為0.9%、1.2%和1.42%，表明所有候選物均一性良好。

圖1 對照品均一化檢測取樣示意圖

2.3 對照品的結構鑒定

2.3.1 人參皂苷Rg1結構鑒定 化合物質譜圖譜顯示質荷比為801的［M+H］+峰，以及質荷比為823的［M+Na］+峰，提示試樣分子量為800。另外高分辨質譜給出了801.507 1的［M+H］+峰（理論值為801.499 5），提示化合物的分子式為C42H72O14，紫外－可見光光譜顯示化合物在203 nm處有最大吸收提示化合物中無共軛體系。紅外圖譜顯示3 400 cm-1附近的羥基的特征吸收峰，提示化合物中含有羥基?；衔锖舜殴舱駭?shù)據(jù)如表1所示，與文獻報道的人參皂苷Rg1核磁共振數(shù)據(jù)一致［6］，綜上所述將化合物鑒定為人參皂苷Rg1。結構圖見圖2。

圖2 人參皂苷Rg1結構

表1 人參皂苷Rg1核磁共振數(shù)據(jù)（δ，ppm，Pyr-d5）

2.3.2 三七皂苷R1結構鑒定 化合物的高分辨質譜給出了931.526 8［M-H］-（理論值為931.527 2）峰，以及相關離子峰977.531 9［M+HCOO］-峰，提示該化合物的分子式為C47H80O18。紫外－可見光光譜顯示化合物在203 nm處有最大吸收提示化合物中無共軛體系。紅外圖譜顯示3 400 cm-1附近的羥基的特征吸收峰，提示化合物中含有羥基?；衔?3C核磁共振數(shù)據(jù)如表2所示，與文獻報道的三七皂苷R1核磁共振數(shù)據(jù)一致［6］，綜上所述將化合物鑒定為三七皂苷R1。結構圖見圖3。

圖3 三七皂苷R1結構

表2 三七皂苷R113C核磁共振數(shù)據(jù)（δ，ppm，CD3OD）

2.3.3 人參皂苷Re結構鑒定 化合物質譜圖譜顯示質荷比為947的［M+H］+峰，以及質荷比為969的［M+Na］+峰，提示試樣分子量應為946。另外高分辨質譜給出了947.559 0的［M+H］+峰（理論值為947.557 4），提示化合物的分子式為C48H82O18，紫外－可見光光譜顯示化合物在203 nm處有最大吸收，提示化合物中無共軛體系。紅外圖譜顯示3 400 cm-1附近的羥基的特征吸收峰，提示化合物中含有羥基。化合物核磁共振數(shù)據(jù)如表3所示，與文獻報道的人參皂苷Re核磁共振數(shù)據(jù)一致［6］，綜上所述將化合物鑒定為人參皂苷Re。結構圖見圖4。

圖4 人參皂苷Re結構

表3 人參皂苷Re核磁共振數(shù)據(jù)（δ，ppm，Pyr-d5）

2.4 對照品的純度定值

2.4.1 色譜純度的測定（高效液相法）

2.4.1.1 色譜條件 色譜柱為Agilent ZORBAX Eclipse XDB C18（250 mm×4.6 mm，5μm）；流動相：水（A）-乙腈（B），洗脫梯度：0～12 min，81%A，19%B；12～60 min，81%A→64%A，19%B→36%B；60～61 min，64%A→81%A，36%B→19%B；61～70 min，81%A，19%B；流速：1 ml/min；檢測波長：203 nm；柱溫：30℃。

2.4.1.2 供試品溶液的制備 分別取三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Re自制對照品候選物，每份約4 mg，精密稱定，用甲醇分別溶解得到濃度分別為0.42、0.40和0.41 mg/ml的溶液。

2.4.1.3 專屬性試驗 ①取甲醇及3個供試品溶液分別進樣10μl，空白溶液色譜圖中，未出現(xiàn)和對照品待測成分色譜峰保留時間一致的色譜峰；②延長分析時間，分別取供試品溶液進樣10μl，當流動相B相比例達到最高（36%）時保持60 min，均未出現(xiàn)新的峰面積大于主峰面積0.1%的雜質峰；③全波長掃描，分別取供試品溶液進樣10μl，使用二極管陣列檢測器（PDA）全波長掃描，在其他波長下未見203 nm下觀察不到的新雜質峰出現(xiàn)。表明方法專屬性良好。

2.4.1.4 準確性試驗 分別稱取人參皂苷Rg1、人參皂苷Re和三七皂苷R1對照品候選物適量，用色譜甲醇完全溶解并配制成15.99、16.01和16.01 mg/ml的母液，分別用甲醇稀釋5個不同的濃度（約為0.1、0.2、0.4、4.0和8.0 mg/ml），分別進樣10μl進行測試，3個對照品不同濃度下的色譜純度RSD均小于1.0%，表明方法準確性良好，見表4。

表4 不同濃度下3個對照品色譜純度數(shù)據(jù) %

2.4.1.5 精密度試驗 ①重復性：每一個對照品分別制備（0.4 mg/g）6份，所得色譜純度的RSD均分別為0.0%、0.0%和0.0%，均小于1%；②重現(xiàn)性：2個不同試驗室檢測所得色譜純度的RAD均為0.0%，表明方法精密度良好。

2.4.1.6 穩(wěn)定性試驗 取“2.4.1.2”項下供試品溶液分別在0、6、12、24、48和72 h分別進行測試分析，所有對照品所得色譜純度與0時比RAD均為0.0%，即均小于1%，表明各供試品溶液在72 h內穩(wěn)定。

2.4.1.7 色譜純度的檢測 精密量取“2.4.1.2”項下供試品溶液10μl。從色譜圖測定結果看，在203 nm下，除主峰外，無可見雜質峰，按峰面積歸一化法計算，三七皂苷R1、人參皂苷Rg1和人參皂苷Re自制對照品色譜純度分別為100.00%、100.00%和100.00%。

2.4.2 水分 以上3種自制對照品按照USP37-NF29＜921＞Ia所規(guī)定的Karl-Fischer方法進行水分測定，結果見表5。

2.4.3 殘留溶劑 按照USP37-NF32＜467＞所規(guī)定方法對各對照品進行溶劑殘留分析，結果見表5。

2.4.4 灰分 按照USP37-NF29＜281＞所規(guī)定方測定各對照品中的灰分，結果見表5。

2.4.5 質量守衡法計算結果 相對純度=色譜純度×（1-水分含量-殘留溶劑含量-灰分含量）×100%，計算各自制對照品相對純度，結果見表5。

表5 3種自制對照品相對純度檢測數(shù)據(jù) %

2.5 對照品的分裝及穩(wěn)定性研究 將3種對照品分別用3 ml棕色西林瓶分裝，壓蓋密封，每支20 mg，于2～8℃下避光保存。分別于1、6、12和24個月取樣，測定3個對照品的色譜純度，結果見表6。結果顯示，3種對照品24個月色譜純度均無下降趨勢，均未見降解產物，暫定3個對照品的有效期為24個月，將持續(xù)考查其穩(wěn)定性。

表6 3種自制對照品穩(wěn)定性數(shù)據(jù)

3 討論

三七飲片通過提取、粗分離，得到不同的中間體，中間體進一步純化可以同時得到3個皂苷類對照品候選物，工藝較為經(jīng)濟，步驟少，純度高。但是該工藝中人參皂苷Rg1與人參皂苷Re在反相制備色譜中分離度較差，人參皂苷Re需要經(jīng)過2次反相制備色譜分離后色譜純度才能達到99%以上。由于西洋參中人參皂苷Re高于三七，而Rg1含量相對較低，因此今后可以考慮從西洋參中提取制備其對照品候選物，可以降低人參皂苷Re的分離難度。

對照品的均一性是由其特殊使命決定的，是對照品必須具備的性質。自制對照品往往存在亞批混批或者同批次不均勻的現(xiàn)象，為了保證對照品的均一性要求根據(jù)各對照品的性質對制備得到的對照品進行均一化處理，常用的均一化手段有：共溶重結晶法、共溶凍干法和共溶濃縮干燥混勻法。

自治對照品純度檢測方法的方法學驗證不同于通常的含量測定方法學驗證，其驗證項目需要依據(jù)風險評估結果確定。對照品色譜純度檢測需全面顯示雜質情況，因此本研究采用空白溶劑、延長分析時間和全波長掃描3種方式來驗證方法的專屬性。濃度增加會使低于檢測限的雜質得以呈現(xiàn)，為了驗證方法的準確性，本研究中最大濃度增加至檢測濃度的40倍，結果表明該方法準確性良好。