劉學杰，李俊強，牛家豐

（1.煙臺市食品藥品檢驗檢測中心，山東 264000；2.棗莊市食品藥品檢驗檢測中心，山東 277000）

補腎止痛膠囊是由鹿角膠、燙狗脊、補骨脂、骨碎補、桑葚、女貞子、醋乳香、醋沒藥、黃連、皂角刺共同組成的中藥復方制劑，是煙臺某中醫(yī)院根據中醫(yī)理論在大量臨床基礎上研制而成，具有補腎溫陽、行氣止痛之功效，臨床上主要用于骨痹之陽虛寒凝癥，如骨痛如折，遇寒加重等癥。處方中的君藥鹿角膠具有溫補肝腎，益精養(yǎng)血的功效［1］；補骨脂亦具有溫腎助陽之功效［2］；醋乳香具有活血生肌，消腫生肌之功［3］；黃連具有清熱燥濕，瀉火解毒之功［4］。對上述藥材進行鑒別及含量測定能夠初步有效的對補腎止痛膠囊的質量進行控制，本文以期對此藥物質量標準的建立提供實驗依據。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 高效液相色譜儀（美國Agilent 1260）；色譜柱為Extend-C18（250 mm×4.6 mm，5μm）柱；電子天平（TB-215D，EL204）；KQ-300DE型數控超聲儀；硅膠板均購自青島基億達硅膠試劑有限公司。

1.2 試藥 甘氨酸對照品（批號110735-200102）、補骨脂對照藥材（批號121056-201605）、乳香對照藥材（批號120970-201305）、鹽酸小檗堿對照品（批號110713-201212）均由中國食品藥品檢定研究院提供，補 腎 止 痛 膠 囊（批 號190901、190902、190903、190904、190905、190906、190907、190908、190909、190910）及各陰性樣品均由制劑室自制；乙腈為色譜純（Thermo Fisher）；水為超純水（Milipore制水機制備）。

2 薄層色譜鑒別

2.1 鹿角膠 取本品內容物5 g，加鹽酸-水（1∶1）溶液20 ml，加熱回流1 h，濾過，濾液蒸干，殘渣加少量甲醇使溶解，轉移至25 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，吸取1 ml，置于10 ml量瓶中，加甲醇稀釋至刻度，作為供試品溶液［5］。按照處方比例和制法制成缺鹿藥材的陰性樣品，同法制成缺鹿角膠的陰性供試品溶液。另取甘氨酸對照品，加甲醇制成每1 ml含1 mg的溶液，作為對照品溶液。取上述供試品及陰性供試品溶液各5μl、對照品溶液2μl，置于同一硅膠G薄層板（薄層板預飽和30 min），以正丁醇-冰醋酸-乙醇-水（4∶1∶1∶1）為展開劑，噴以0.2%茚三酮試液在105℃加熱至斑點顏色清晰，結果見圖1。

圖1 鹿角膠鑒別TLC圖譜

2.2 補骨脂 取本品內容物5 g，加乙酸乙酯20 ml，超聲處理15 min，濾過，濾液蒸干，殘渣加乙酸乙酯1 ml使溶解，作為供試品溶液［6］。按照處方比例和制法制成補骨脂藥材的陰性樣品，同法制成補骨脂的陰性供試品溶液。另取補骨脂對照藥材0.5 g，同法制成對照藥材溶液。取上述供試品及陰性供試品溶液及對照品溶液各4μl，置于同一硅膠G薄層板（薄層板預飽和30 min），以正己烷-乙酸乙酯（4∶1）為展開劑，噴以10%氫氧化鉀甲醇溶液置紫外燈365 nm下檢視，結果見圖2。

圖2 補骨脂鑒別TLC圖譜

2.3 醋乳香 取本品內容物6 g，加乙醇30 ml，超聲處理1 h，放冷，濾過，濾液濃縮至5 ml，作為供試品溶液［7］。按照處方比例和制法制成醋乳香藥材的陰性樣品，同法制成醋乳香的陰性供試品溶液。另取乳香對照藥材0.2 g，加乙醇20 ml，同法制成對照藥材溶液。取上述供試品及陰性供試品溶液各4μl、對照品溶液2μl，置于同一硅膠G薄層板（薄層板預飽和30 min），以石油醚（60～90℃）-環(huán)己烷-乙酸乙酯-甲酸（10∶30∶15∶1）為展開劑，噴以5%香草醛硫酸溶液在105℃加熱至斑點顯色清晰，結果見圖3。

圖3 醋乳香鑒別TLC圖譜

3 鹽酸小檗堿含量測定

3.1 色譜條件 以十八烷基硅烷鍵合硅膠為填充劑（250 mm×4.6 mm，5μm）；以乙腈-0.4%磷酸（28∶72）為流動相；進樣量10μl，柱溫：30℃，流速1.0 ml/min，檢測波長為345 nm。理論板數按鹽酸小檗堿峰計算應不低于5 000。

3.2 溶液的制備

3.2.1 供試品溶液的制備 取本品約2 g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入鹽酸-甲醇（1∶100）50 ml，密塞，稱定重量，超聲處理30 min，放冷，再稱定重量，用鹽酸-甲醇（1∶100）補足減失的重量，搖勻，濾過，精密量取續(xù)濾液20 ml，濃縮至近干，用鹽酸-甲醇（1∶100）適量使溶解并轉移至2 ml量瓶中，加鹽酸-甲醇（1∶100）至刻度，搖勻，濾過，取續(xù)濾液，即得［6］。

3.2.2 對照品溶液的制備 取鹽酸小檗堿對照品

適量，精密稱定，加甲醇制成每1 ml含90μg的溶液，即得。

3.2.3 缺黃連空白溶液的制備 按照處方比例取缺黃連之外的其他藥材，按照補腎止痛膠囊的制備工藝制備黃連陰性樣品，并按照“3.2.1”項下方法制成黃連陰性供試品溶液。

3.3 系統(tǒng)適用性試驗 分別精密吸取鹽酸小檗堿對照品溶液、供試品溶液與缺黃連陰性供試品溶液各5μl，注入液相色譜儀，在345 nm處測定。結果表明，鹽酸小檗堿對照品溶液和供試品溶液在該波長處均有最大吸收峰，而缺黃連陰性供試品溶液在該波長處未見明顯色譜峰出現(xiàn)，表明本測定無明顯干擾，結果見圖4。

圖4對照品（A）供試品（B）陰性樣品（C）HPLC色譜圖

3.4 線性關系考查 分別精密吸取相當鹽酸小檗堿對照品0.093、0.265、0.464、0.619、0.795和0.93μg的對照品溶液，注入高效液相色譜儀，測定峰面積積分值。以峰面積積分值（A）為縱坐標，鹽酸小檗堿進樣量（μg）為橫坐標，繪制標準曲線，結果進樣量在0.093～0.930μg范圍內線性關系良好。對所得數據進行回歸分析，得回歸方程Y=485.45X-184.68（r=0.999 2）。

3.5 精密度試驗 精密吸取對照品溶液5μl，按上述色譜條件測定，連續(xù)進樣6次，測定峰面積積分值，結果6次測定RSD為0.19%，表明精密度良好。

3.6 穩(wěn)定性試驗 精密吸取供試品溶液5μl，按上述色譜條件測定，每隔2 h測定1次，共測定5次，其峰面積積分值在測定時間8 h內基本不變，供試品5次測定的RSD為0.28%，表明穩(wěn)定性良好。

3.7 重復性試驗 取同一批樣品（批號為190901）6份，按“3.2.1”項下方法制備供試品溶液，依法測定鹽酸小檗堿的含量，結果6次測定的平均含量為0.175mg/g，其RSD為1.92%，表明重復性良好。

3.8 回收率試驗 取同批（批號為190901）已知含量的樣品約1 g，精密稱定，共取6份，分別加入鹽酸小檗堿0.178 mg（準確加入0.178 mg/ml的鹽酸小檗堿溶液1.0 ml），按供試品溶液制備的方法制成回收率各試驗溶液，并按照上述測定方法進樣10μl測定各樣品中鹽酸小檗堿的含量，計算回收率，結果平均回收率為99.06%，RSD為0.69%。見表1。

表1 加樣回收試驗結果

3.9 樣品的測定 取不同批號的樣品制成供試品溶液，精密吸取供試品溶液5μl，注入液相色譜儀，按上述色譜條件進行測定，共測定10批本制劑樣品的鹽酸小檗堿含量，結果平均含量為75μg/粒。見表2。

表2 含量測定結果

由表2可知，每粒膠囊中鹽酸小檗堿的含量范圍為63～91μg/粒，考慮到黃連藥材的質量差異，按照平均含量60%定為每粒鹽酸小檗堿的最低含量，故規(guī)定每粒含黃連以鹽酸小檗堿（C20H17NO4·HCl）計，不得少于45μg。

4 討論

4.1 鹿角膠的鑒別 此次試驗過程中，作者曾嘗試用《中國藥典》方法對鹿角膠進行鑒別，但是操作過于繁瑣，故參考文獻中阿膠檢驗方法對其進行鑒別，此方法操作簡便，且重現(xiàn)性較好。

4.2 檢測波長及流動相的選擇 本文取鹽酸小檗堿對照品溶液進行掃描（200～600 nm）發(fā)現(xiàn)橙皮苷在345.2 nm處有最大吸收，結合《中國藥典》黃連項下鹽酸小檗堿含量測定，故確定本文含量測定的波長為345 nm。本文嘗試用黃連項下流動相進行流動相乙腈-0.05 mol/L磷酸二氫鉀溶液（50∶50）（每100 ml中加十二烷基硫酸鈉0.4 g，再以磷酸調節(jié)pH為4.0），結果發(fā)現(xiàn)雜質干擾較多，小檗堿分離度未能達到要求，故選用本文流動相。

4.3 含量測定提取條件的選擇

4.3.1 提取方式的選擇 本文比較了超聲和回流兩種不同的提取方式，兩種提取方式效果相近，但超聲操作更簡便，故本文采用超聲提取方式。

4.3.2 提取時間的選擇 本文比較了超聲提取20、30和40 min的提取效率，結果30 min基本可以將鹽酸小檗堿提取完全，因此本文確定超聲提取的時間為30 min。

本文采取TLC法對處方中鹿角膠、補骨脂和醋乳香進行了鑒別，用HPLC對處方黃連中的鹽酸小檗堿進行了含量測定，此方法基本能夠對補腎止痛膠囊的質量進行控制，為制定此制劑的標準提供實驗依據。