陸崢琳，黃瑞松，吳氏海燕

（1.廣西國(guó)際壯醫(yī)醫(yī)院，南寧 530001；2.廣西醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院，南寧 530022）

黃皮根來源于蕓香科植物黃皮（Clausena lansinm）的干燥根。黃皮在中國(guó)南方多地均有栽培［1］，黃皮果實(shí)為大眾所喜食的果品，除此之外民間還以黃皮的根、葉、果、果核等入藥［2，3］。黃皮根性辛、微苦，溫，具有行氣止痛之功，可用于治療氣滯胃痛、腹痛、疝痛、風(fēng)濕骨痛、痛經(jīng)、黃疸、瘧疾［4-8］。關(guān)于黃皮根的研究不多。文獻(xiàn)記載［4］黃皮根中含歐前胡素、去氫印黃皮內(nèi)酯、8-牻牛兒氧基補(bǔ)骨脂素和倍半萜酮右旋日本刺參萜酮等成分。其中，歐前胡素又名歐前胡內(nèi)酯、歐芹屬素乙、前胡內(nèi)酯、白芷乙素，是線性呋喃香豆素類化合物，具有抑制癲癇發(fā)作、擴(kuò)張血管、抑制心肌肥大、抑制腫瘤細(xì)胞增殖、抗微生物、影響新陳代謝酶活性等多種藥理作用［9，10］。目前尚未見有黃皮根中歐前胡素含量測(cè)定的報(bào)道，本研究采用單因素試驗(yàn)和正交設(shè)計(jì)對(duì)黃皮根中歐前胡素提取條件進(jìn)行優(yōu)化，建立了黃皮根中歐前胡素含量的高效液相色譜測(cè)定方法。

1 材料與方法

1.1 材料

黃皮根（1號(hào)2016年1月6日采于廣西隆安縣龍虎山景區(qū)；2號(hào)2016年2月18日采于廣西鳳山縣鳳城鎮(zhèn)；3號(hào)2016年4月1日采于廣西隆安縣那桐鎮(zhèn)），3批黃皮根樣品對(duì)應(yīng)的帶花臘葉標(biāo)本經(jīng)廣西中醫(yī)藥大學(xué)韋松基教授及廣西中醫(yī)藥研究院黃云峰副研究員鑒定為蕓香科植物黃皮；歐前胡素對(duì)照品（批號(hào)110826-201415，純度為99.7%，供含量測(cè)定用），中國(guó)食品藥品檢定研究院；甲醇、乙腈色譜純，德國(guó)Merck公司，水為超純水，其余試劑均為分析純。

1.2 儀器

Agilent 1260型高效液相色譜儀（帶自動(dòng)進(jìn)樣器及VWD檢測(cè)器），美國(guó)安捷倫科技公司；LC-20 AT高效液相色譜儀（帶自動(dòng)進(jìn)樣器、二極管陣列檢測(cè)器）、UV-2401PC紫外-可見分光光度計(jì)，日本島津公司；KQ-3200DE型數(shù)控超聲波清洗器，昆明市超聲儀器有限公司；XS205十萬分之一電子分析天平，瑞士梅特勒-托利多公司；EASYPUREⅡ超純水器，美國(guó)熱電公司。

1.3 方法

1.3.1 色譜條件

1）色譜柱的選擇。在其他色譜條件相同的情況下，分別采用島津C18、賽芬C18和菲羅門Gemini NX C1（8規(guī)格均為5 μm，4.6 mm×250 mm）3根不同色譜柱測(cè)定黃皮根樣品（2號(hào)），比較其分離效果。

2）流動(dòng)相的選擇。在同一色譜條件下，分別對(duì)甲醇-水（55∶45）、甲醇-水（60∶40）以及乙腈-水（55∶45）3個(gè)流動(dòng)相系統(tǒng)進(jìn)行試驗(yàn)。

3）分析波長(zhǎng)的選擇。取歐前胡素對(duì)照品的甲醇溶液，經(jīng)UV-2401PC紫外-可見分光光度計(jì)在190～400 nm進(jìn)行紫外光譜掃描，確定歐前胡素的最大吸收波長(zhǎng)。

1.3.2 供試品溶液制備方法的研究

1）單因素試驗(yàn)。以歐前胡素含量為指標(biāo)，考察不同提取溶劑及不同提取方法的效果。歐前胡素為呋喃香豆精類，結(jié)合其化學(xué)性質(zhì)及參考有關(guān)文獻(xiàn)［11-13］，擬定提取溶劑考察甲醇、乙醇，提取方式考察超聲處理、加熱回流。精密稱取黃皮根（2號(hào)）粉末4份，每份約0.5 g，精密加入溶劑15 mL，密塞后稱定重量。以甲醇超聲處理、乙醇超聲處理、甲醇加熱回流、乙醇加熱回流提取30 min，靜置放冷，用相應(yīng)的溶劑補(bǔ)足減少的重量，過濾，取續(xù)濾液，作為供試品溶液。分別精密吸取上述供試品溶液各10 μL注入液相色譜儀測(cè)定。

2）正交設(shè)計(jì)優(yōu)化試驗(yàn)。依據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，對(duì)藥材破碎度、溶劑體積分?jǐn)?shù)、提取時(shí)間進(jìn)行三因素三水平考察，因素與水平見表1。以歐前胡素的含量為考核指標(biāo)，采用L9（34）正交設(shè)計(jì)安排試驗(yàn)。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平

1.3.3 方法學(xué)考察

1）專屬性試驗(yàn)。精密稱取歐前胡素對(duì)照品適量，加甲醇制成濃度為30 μg/mL的溶液，作為對(duì)照品溶液；精密稱取黃皮根粉末0.5 g，按供試品溶液制備方法的優(yōu)化結(jié)果制備供試液，以0.45 μm微孔濾膜過濾，取續(xù)濾液作為供試品溶液；以甲醇溶液作為陰性對(duì)照溶液。取上述3種溶液各10 μL，進(jìn)樣測(cè)定并記錄色譜，考察該方法測(cè)定歐前胡素含量有無陰性干擾。

2）線性關(guān)系。精密稱取歐前胡素對(duì)照品8.2 mg，加甲醇定容至25 mL。分別精密吸取0.2、1.0、2.0、3.0、4.0、5.0 mL置于10 mL容量瓶中，各加甲醇稀釋至刻度，搖勻，作為不同濃度的對(duì)照品溶液。分別精密吸取上述不同濃度對(duì)照品溶液各10 μL進(jìn)樣測(cè)定，以對(duì)照品的進(jìn)樣量（μg）為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y），繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。

3）精密度試驗(yàn)。取同一份黃皮根藥材的供試品溶液（2號(hào)），連續(xù)進(jìn)樣測(cè)定6次。分別記錄歐前胡素峰面積，計(jì)算RSD值。

4）重復(fù)性試驗(yàn)。取黃皮根藥材（2號(hào)）粉末，分別精密稱定0.5 g，平行制備6份供試品溶液，進(jìn)樣測(cè)定歐前胡素含量并計(jì)算RSD值。

5）穩(wěn)定性試驗(yàn)。取黃皮根藥材同一供試品溶液（2號(hào)），分別于0、2、4、6、12、24 h進(jìn)樣測(cè)定，計(jì)算人參皂苷Rb1含量及RSD值。

6）加樣回收率試驗(yàn)。分別精密稱取已知含量的黃皮根粉末（2號(hào)）0.25 g共6份，各加入歐前胡素對(duì)照品的甲醇溶液（26.61 μg/mL）15 mL，照供試品溶液制備方法的優(yōu)化結(jié)果制備供試品溶液，測(cè)定歐前胡素含量，計(jì)算平均回收率及RSD值。

7）檢測(cè)限及定量限的確定 取歐前胡素對(duì)照品甲醇溶液按不同比例進(jìn)行稀釋，計(jì)算信噪比S/N=3、S/N=10時(shí)注入儀器的量，分別得歐前胡素對(duì)照品的檢出限及定量限。

8）耐用性試驗(yàn)。分別采用島津C18、賽芬C18和菲羅門Gemini NX C1（8規(guī)格均為5 μm，4.6 mm×250 mm）3根不同品牌色譜柱，測(cè)定黃皮根樣品（2號(hào)）中歐前胡素的含量及RSD值；分別采用安捷倫1260型和島津LC-20AT 2臺(tái)不同品牌的色譜儀，測(cè)定黃皮根樣品（2號(hào)）中歐前胡素含量，計(jì)算RAD值。

1.3.4 樣品含量測(cè)定 精密稱取3批黃皮根樣品，制備供試品溶液，按照確定的色譜條件測(cè)定黃皮根中歐前胡素的含量。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜條件的確定

2.1.1 色譜柱的確定 島津C18、賽芬C18和菲羅門Gemini NX C1（8規(guī)格均為5 μm，4.6 mm×250 mm）3根色譜柱對(duì)歐前胡素均可得到良好的分離效果。選擇菲羅門Gemini NX C18柱作為試驗(yàn)用色譜柱。

2.1.2 流動(dòng)相的確定 在同一色譜條件下，以甲醇-水（55∶45）為流動(dòng)相，分離效果優(yōu)于甲醇-水（60∶40）、乙腈-水（55∶45），故以甲醇-水（55∶45）進(jìn)行試驗(yàn)。

2.1.3 檢測(cè)波長(zhǎng)的確定 歐前胡素在圖1所示的幾個(gè)波長(zhǎng)均有吸收峰，結(jié)合黃皮根樣品的高效液相色譜，其在300 nm波長(zhǎng)處雜質(zhì)峰干擾較小，故本研究選用300 nm為檢測(cè)波長(zhǎng)。

圖1 歐前胡素甲醇溶液紫外光譜

2.2 供試品溶液制備方法的優(yōu)化結(jié)果

2.2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果與分析以不同溶劑及不同提取方式制備黃皮根樣品溶液，測(cè)歐前胡素含量，結(jié)果見表2。以甲醇、乙醇2種不同溶劑提取的歐前胡素含量相差不大；以超聲提取法和加熱回流提取法提取時(shí)，前者歐前胡素含量明顯優(yōu)于后者。本研究確定采用甲醇超聲提取的方法制備供試品溶液。

表2 單因素試驗(yàn)制備的供試液歐前胡素含量（n=2）

2.2.2 正交試驗(yàn)結(jié)果 正交實(shí)驗(yàn)結(jié)果與方差分析見表3、表4。影響提取黃皮根中歐前胡素含量的因素大小順序?yàn)椋核幉钠扑槎龋炯状俭w積分?jǐn)?shù)＞提取時(shí)間，藥材破碎度對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響較大，提取時(shí)間對(duì)試驗(yàn)結(jié)果影響較小，綜合考慮，確定最佳提取條件為A3B3C1。

表3 正交試驗(yàn)結(jié)果

表4 正交試驗(yàn)結(jié)果方差分析

2.2.3 供試品溶液制備方法的確定綜合單因素試驗(yàn)及正交試驗(yàn)結(jié)果確定供試品溶液制備方法為：精密稱取黃皮根粉末（過四號(hào)篩）0.5 g，置錐形瓶中，精密加入15 mL甲醇并密塞，稱定重量，超聲處理（功率150 W，頻率40 kHz）30 min，放至室溫，以甲醇補(bǔ)重，搖勻，取續(xù)濾液作為供試品溶液。

2.3 方法學(xué)考察結(jié)果

2.3.1 專屬性試驗(yàn)結(jié)果供試品溶液的色譜中均有與歐前胡素對(duì)照品保留時(shí)間相同的吸收峰，甲醇陰性溶液的色譜則無此吸收峰。說明用該方法測(cè)定歐前胡素含量無陰性干擾，專屬性強(qiáng)。結(jié)果見圖2。

圖2 對(duì)照品（A）、供試品（B）和陰性對(duì)照（C）HPLC色譜

2.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制歐前胡素進(jìn)樣量在0.065 6～1.640 0 μg，進(jìn)樣量與峰面積呈良好的線性關(guān)系，回歸方程為：Y=2 400.3X+3.069 4，r=0.999 8。式中，X為歐前胡素進(jìn)樣質(zhì)量，Y為峰面積，標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖3所示。

圖3 歐前胡素的標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.3.3 精密度試驗(yàn)結(jié)果 連續(xù)測(cè)定6次，歐前胡素峰面積分別為1 131.0、1 121.0、1 116.5、1 115.6、1 111.8、1 118.4，平均值為1 119.1，RSD=0.59%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.3.4 重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果 平行測(cè)定6份供試品溶液，歐前胡素含量分別為0.158%、0.157%、0.158%、0.158%、0.157%、0.154%，平均值為0.157%，RSD為0.96%（n=6），表明該試驗(yàn)方法重復(fù)性較好。

2.3.5 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果24 h內(nèi)6次測(cè)定供試品溶液，歐前胡素含量分別為0.154%、0.155%、0.155%、0.157%、0.157%、0.155%，平均值為0.156%，RSD為0.87%（n=6），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3.6 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果 黃皮根樣品溶液的歐前胡素平均回收率為97.2%，RSD為0.89%（n=6）（表5），說明該方法準(zhǔn)確度高，可用于測(cè)定黃皮根中歐前胡素的含量。

表5 黃皮根中歐前胡素的加樣回收試驗(yàn)（n=6）

2.3.7 儀器檢出限及定量限的確定測(cè)得歐前胡素對(duì)照品的檢出限為3.28×10-4μg，定量限為1.1×10-3μg。

2.3.8 耐用性試驗(yàn)結(jié)果3根不同品牌色譜柱測(cè)得黃皮根樣品（2號(hào)）中歐前胡素的含量分別為0.147%、0.149%、0.145%，平均值為0.147%，RSD為1.36%（n=3）；2臺(tái)不同品牌的色譜儀測(cè)得黃皮根樣品（2號(hào)）中歐前胡素含量分別為0.156%、0.154%，平均值為0.155%，RAD為0.65%（n=2），表明該方法對(duì)不同品牌色譜柱和不同品牌高效液相色譜儀具有良好的耐用性。

2.4 樣品含量測(cè)定結(jié)果

3批黃皮根樣品的歐前胡素含量按干燥品計(jì)，分別為0.170%、0.157%、0.044%。

3 討論

色譜條件探索時(shí)曾對(duì)0.8、1.0和1.2 mL/min 3個(gè)不同流速進(jìn)行比較試驗(yàn)，結(jié)果在上述3種流速下歐前胡素均可得到良好的分離效果，本研究采用的是1.0 mL/min的流速。同時(shí)還對(duì)25、30、35℃3種柱溫條件進(jìn)行考察，結(jié)果歐前胡素的分離效果均可，柱溫對(duì)歐前胡素分離效果影響不大，本研究采用的是25℃。在確定的色譜檢測(cè)條件下，測(cè)得3批黃皮根的歐前胡素理論板數(shù)均大于3 000，符合高效液相色譜法含量測(cè)定標(biāo)準(zhǔn)。

本研究測(cè)定了3批不同產(chǎn)地的黃皮根歐前胡素含量，含量差距較大，可能和藥材的生境或采集月份有關(guān)，有待采集多批樣品測(cè)定進(jìn)行下一步研究。

本研究基于高效液相色譜法建立黃皮根藥材中的歐前胡素含量測(cè)定法，供試品制備方法簡(jiǎn)便，色譜分離好，無其他成分干擾，具備較好的專屬性。經(jīng)方法學(xué)考察，重復(fù)性、精密度好，準(zhǔn)確度高，可用于黃皮根質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的評(píng)價(jià)，有利于控制藥材質(zhì)量，為黃皮根資源的開發(fā)利用和規(guī)范化種植及進(jìn)一步制定黃皮根藥材質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)提供了科學(xué)依據(jù)。