佟彬良 吳夢琦 顏文 趙夢然 楊樹民 張卓 秦榮飛 周春華

川芎定痛膠囊為河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院生產(chǎn)的中藥復(fù)方制劑，其由川芎、絞股藍(lán)、延胡索、白芷、細(xì)辛、全蝎等6味藥材組成，主要含有機(jī)酸類、生物堿類、香豆素類、三萜皂苷及大量揮發(fā)油等活性成分，主要有平肝熄火、調(diào)和氣血，通絡(luò)止痛之功效，主要用于偏頭痛、緊張性疼痛、叢集性頭痛不伴外感癥狀者，臨床應(yīng)用療效確切[1]。君藥川芎具有活血行氣、散瘀止痛、祛風(fēng)燥濕的功效[2]，川芎中綠原酸、阿魏酸具有抗炎、抗氧化活性以及保護(hù)神經(jīng)等藥理作用[3]。君藥全蝎平肝熄風(fēng)，入絡(luò)搜風(fēng)止痛[4]。臣藥絞股藍(lán)具有降血脂、調(diào)血糖、增強(qiáng)免疫、抗炎、護(hù)肝、抗氧化、保護(hù)心腦血管、抗腫瘤等藥理活性[5]。臣藥延胡索主要有鎮(zhèn)痛、活血、理氣之功效，其中延胡索乙素主要有鎮(zhèn)痛、鎮(zhèn)靜等藥理作用[6]。佐藥白芷芳香行氣止痛[7]，其中歐前胡素具有解熱鎮(zhèn)痛、抗菌抗炎、血管舒張等藥理作用[8]。佐藥細(xì)辛有祛風(fēng)散寒、通竅止痛、溫肺化飲之功效[9]。目前川芎定痛膠囊的質(zhì)量內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)只有川芎、絞股藍(lán)的定性鑒別和絞股藍(lán)皂苷的分光光度法的定量分析實驗，還缺乏對多個有效成分的進(jìn)行含量測定的方法。川芎定痛膠囊中單味藥材的質(zhì)量控制僅有少量報道，且僅停留在對部分成分的含量測定上，缺少對產(chǎn)品有效成分的整體評價，無法全面有效控制藥品質(zhì)量[10-14]。因此，本研究建立并應(yīng)用UPLC法同時測定川芎定痛膠囊中四種有效成分的含量，為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 儀器與試藥

1.1.1 試藥:川芎定痛膠囊，河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院自制，批號為170923，180725，190301，191013，批準(zhǔn)文號：冀藥制字Z05000005；綠原酸(Chlorogenic acid，批號：Y24J7K16726)，阿魏酸(Ferulic acid，批號：H27J7L16718)，延胡索乙素(Rotundinum，批號：Y21S7Y17091)，歐前胡素(Imperatorin，批號：P02J9F64791)，均購自上海源葉生物科技有限公司，以上對照品純度均>98%。

1.1.2 儀器:ACQUITY UPLC H-Class 超高效液相色譜儀，配有四元溶劑管理器、柱溫箱、自動進(jìn)樣器、紫外檢測器(TUV)及Empower色譜工作站(美國Waters公司)，由美國沃特世公司生產(chǎn)。

1.2 測定條件與溶液制備

1.2.1 色譜條件:色譜柱：HSS C18柱(2.1×150 mm，1.8 μm)；柱溫：35℃；流動相：0.2%乙酸(A)-乙腈(B)；流速：0.3 ml/min；檢測波長：254 nm；進(jìn)樣量：2 μl；梯度洗脫：5%B預(yù)平衡10 min，0～10 min：5%～14%B，10～20 min：14%～25%B，20～25 min：25%～30%B，25～35 min：30%～55%B，35～45 min：55%～95%B，45～46 min：95%B，46～47 min：95%～5%B。

1.2.2 對照品溶液的制備:分別精密稱取綠原酸、阿魏酸、延胡索乙素和歐前胡素對照品適量，加50%甲醇制得混合對照品溶液，于4℃冰箱保存，稀釋濃度依次為12.01、10.06、674.31、38.13 μg/ml。

1.2.3 樣品溶液的制備:將10粒川芎定痛膠囊內(nèi)容物混勻，精密稱取0.5 g，置具塞量瓶中，精密加入50%甲醇10 ml，稱重，超聲處理40 min，放冷，再稱重，以相同溶劑補(bǔ)足重量差，搖勻，濾過，即得。

1.3 方法學(xué)考察

1.3.1 專屬性:以前述UPLC方法分析溶劑空白溶液，川芎定痛膠囊樣品溶液，含有綠原酸、阿魏酸、延胡索乙素、歐前胡素的混合對照品溶液，考察各成分的色譜分離情況。

1.3.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量下限:以50%甲醇稀釋含有綠原酸、阿魏酸、延胡索乙素、歐前胡素的混合對照品溶液，得系列不同濃度標(biāo)準(zhǔn)溶液，綠原酸、阿魏酸、延胡索乙素和歐前胡素分別在2.40～12.01、2.01～10.06、134.86～674.31、7.63～38.13 μg/ml，采用已建立的UPLC方法檢測，以分析物濃度(x，μg/ml)與峰面積(y)為橫縱坐標(biāo)進(jìn)行線性回歸。以信噪比10∶1確定定量下限。

1.3.3 回收率:按照前述樣品溶液制備方法，取批號為180725的川芎定痛膠囊內(nèi)容物，制備加入混合對照品的樣品溶液共六份，其中分別精密稱取0.25 g，分別精密加入混合對照品溶液，以前述方法采用已建立的UPLC方法檢測，計算綠原酸、阿魏酸、延胡索乙素、歐前胡素的加樣回收率及相對標(biāo)準(zhǔn)偏差(RSD)值。

1.3.4 精密度:按照前述樣品溶液制備方法及所建立的UPLC方法，配制一份批號為180725的川芎定痛膠囊樣品溶液連續(xù)進(jìn)樣6次，連續(xù)測定3 d，記錄峰面積，計算綠原酸、阿魏酸、延胡索乙素、歐前胡素的日內(nèi)和日間RSD值。

1.3.5 重復(fù)性:按照前述樣品溶液制備方法及所建立的UPLC方法，配制6份批號為180725的川芎定痛膠囊樣品溶液進(jìn)樣分析，記錄峰面積，計算綠原酸、阿魏酸、延胡索乙素、歐前胡素的含量RSD值。

1.3.6 穩(wěn)定性:按照前述樣品溶液制備方法及所建立的UPLC方法，分別于0、2、4、6、8、10 h對批號為180725的川芎定痛膠囊樣品溶液進(jìn)樣測定，計算綠原酸、阿魏酸、延胡索乙素、歐前胡素的峰面積RSD值。

2 結(jié)果

2.1 色譜條件優(yōu)化 液相色譜條件通常考察如流動相組成、柱溫、檢測波長、提取溶劑的配比等影響分離的重要因素。為了獲得較高的色譜分離效率及提高化合物峰型的對稱性，本實驗主要從流動相組成、柱溫、檢測波長三方面對色譜分離條件進(jìn)行優(yōu)化。

2.1.1 流動相組成：對流動相中有機(jī)相和水相的組成進(jìn)行調(diào)整，在流動相中加入一定的酸以改善峰形，設(shè)置四個不同比例有機(jī)相，0.2%乙酸-(50%乙腈+50%甲醇)、0.2%乙酸-甲醇、0.3%乙酸-乙腈、0.2%乙酸-乙腈、0.1%乙酸-乙腈、0.1%甲酸-乙腈，純水-乙腈，從川芎定痛膠囊內(nèi)容物樣品的色譜圖可分析，0.2%乙酸-乙腈時洗脫效果較好，峰型對稱性增強(qiáng)，分離度好；與甲醇相比，乙腈作為有機(jī)相，壓力較低、洗脫能力較強(qiáng)，故選擇使乙腈為有機(jī)相。因此，選擇0.2%乙酸-乙腈為流動相進(jìn)行梯度洗脫。見圖1。

圖1 不同流動相考組成條件下測定川芎定痛膠囊內(nèi)容物樣品的色譜圖(a 0.2%乙酸-(50%乙腈+50%甲醇)，b 0.2%乙酸-甲醇，c 0.3%乙酸-乙腈，d 0.2%乙酸-乙腈，e 0.1%乙酸-乙腈，f 0.1%甲酸-乙腈，g 純水-乙腈)

2.1.2 柱溫：考察溫度分別為30℃、35℃、40℃，根據(jù)不同溫度下川芎定痛膠囊內(nèi)容物樣品的色譜圖可分析得出，當(dāng)柱溫為35℃時，洗脫效果好，峰對稱性增強(qiáng)，因此選擇柱溫35℃進(jìn)行下一步測定。見圖2。

圖2 不同柱溫條件下測定川芎定痛膠囊內(nèi)容物樣品的色譜圖(30℃-下、35℃-中、40℃-上)

2.1.3 檢測波長：川芎定痛膠囊所含成分結(jié)構(gòu)類型復(fù)雜，參考不同結(jié)構(gòu)類別成分的吸收波長，考察波長分別為205、254、280、320 nm，根據(jù)不同檢測波長條件下川芎定痛膠囊內(nèi)容物樣品的色譜圖對比分析可得，當(dāng)檢測波長為254 nm時，樣品峰響應(yīng)值較好，靈敏度好，因此選擇檢測波長254 nm進(jìn)行測定。見圖3。

圖3 不同波長下測定川芎定痛膠囊內(nèi)容物樣品的色譜圖；(a 320 nm,b 280 nm,c 254 nm,d 205 nm)

2.2 方法學(xué)考察

2.2.1 專屬性:通過比較川芎定痛膠囊樣品、混合對照品與空白溶液的典型色譜圖，各檢測物成分的色譜峰無雜質(zhì)干擾，峰形良好，保留時間穩(wěn)定。見圖4。

圖4 川芎定痛膠囊樣品(上)、混合對照品(中)與空白溶液(下)的典型色譜圖;1 綠原酸; 2 阿魏酸; 3 延胡索乙素; 4 歐前胡素

2.2.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量下限:以UPLC檢測混合對照品溶液中不同濃度分析物的峰面積，再與其濃度進(jìn)行線性回歸，結(jié)果表明，綠原酸、阿魏酸、延胡索乙素和歐前胡素的線性關(guān)系良好(R2≥0.999)。四個成分的定量下限范圍在0.0027～0.152 μg/ml。見表1。

表1 測定川芎定痛膠囊中四個成分的線性回歸方程

2.2.3 回收率:測定川芎定痛膠囊加入混合對照品后處理的樣品溶液，如表2中結(jié)果表明方法回收率良好，川芎定痛膠囊中綠原酸、阿魏酸、延胡索乙素、歐前胡素的回收率在95.62%～102.67%，RSD在2.33%～3.19%。見表2。

2.2.4 精密度:連續(xù)3 d測定同批次川芎定痛膠囊樣品溶液，結(jié)果表明儀器精密度良好，川芎定痛膠囊中綠原酸、阿魏酸、延胡索乙素、歐前胡素的日內(nèi)日間精密度RSD值范圍分別在0.89%～1.43%、1.37%～1.96%。見表2。

表2 測定川芎定痛膠囊中四個成分的精密度與回收率結(jié)果

2.2.5 重復(fù)性:測定6份同一批號川芎定痛膠囊樣品溶液，結(jié)果川芎定痛膠囊中綠原酸、阿魏酸、延胡索乙素、歐前胡素的含量RSD值范圍在1.16%～1.66%，表明方法重復(fù)性良好。

2.2.6 穩(wěn)定性:測定放置不同時間的川芎定痛膠囊樣品溶液，結(jié)果川芎定痛膠囊中綠原酸、阿魏酸、延胡索乙素、歐前胡素的色譜峰面積RSD值范圍在1.18%～1.53%，表明川芎定痛膠囊樣品溶液在10 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3 方法應(yīng)用 取4批川芎定痛膠囊樣品，以上述方法進(jìn)行樣品制備及樣品測定，記錄色譜圖，以標(biāo)準(zhǔn)曲線法對不同批次川芎定痛膠囊中綠原酸、阿魏酸、延胡索乙素、歐前胡素的含量進(jìn)行計算分析。見表3。

表3 川芎定痛膠囊中四種成分含量測定結(jié)果 mg/g

3 討論

河北醫(yī)科大學(xué)第一醫(yī)院研制的中藥復(fù)方制劑川芎定痛膠囊由川芎、絞股藍(lán)、延胡索、白芷、細(xì)辛、全蝎等6味藥材組成，成分復(fù)雜，臨床療效確切。目前質(zhì)量內(nèi)控標(biāo)準(zhǔn)只有川芎、絞股藍(lán)的定性鑒別和絞股藍(lán)皂苷的分光光度法的定量分析實驗，無其他有效成分的含量測定。川芎定痛膠囊中單味藥的質(zhì)量控制只有少量報道，且僅僅停留在對小部分成分的含量測定上，因此缺少對本中藥復(fù)方制劑有效成分的整體評價。由于川芎定痛膠囊為復(fù)方制劑，成分組成多樣，十分復(fù)雜，有必要將多種有效成分進(jìn)行整體系統(tǒng)研究。

根據(jù)中藥復(fù)方君臣佐使原則選擇典型的指標(biāo)性成分對復(fù)方制劑進(jìn)行質(zhì)量控制具有重要意義[15-17]。川芎定痛膠囊之君藥川芎中綠原酸、阿魏酸為代表成分，臣藥延胡索中延胡索乙素為代表成分，佐藥白芷中的歐前胡素為代表成分，因此，參考中藥復(fù)方君臣佐使配伍原則，選擇四個典型代表成分進(jìn)行質(zhì)量控制方法研究十分必要，能夠進(jìn)一步更加準(zhǔn)確對有效成分進(jìn)行定性定量。

UPLC法具有快速、靈敏、節(jié)省溶劑、峰容量高、分析效率高等特點，近年來越來越多的應(yīng)用于中藥復(fù)雜成分的分析[17-22]。川芎定痛膠囊所含成分復(fù)雜多樣，因此，本研究采用了UPLC方法，分別從流動相組成，檢測波長，溫度對色譜分離條件進(jìn)行優(yōu)化，由于檢測指標(biāo)綠原酸與阿魏酸為有機(jī)酸類成分，為防止此類成分在色譜中拖尾現(xiàn)象，在流動相中加入了不同比例的酸，以改善峰形，經(jīng)過實驗測定，可知在色譜條件流動相組成：0.2%乙酸水-乙腈，流動相梯度洗脫，溫度為35℃時，峰形良好，分離度高。另外，對樣品提取溶劑進(jìn)行考察，分別為20%、50%、70%、100%甲醇-水，根據(jù)不同濃度的提取溶劑處理的川芎定痛膠囊內(nèi)容物樣品的色譜圖可分析得出，其中當(dāng)提取溶劑為50%甲醇-水時，提取效果最佳，因此本實驗利用50%甲醇-水對川芎定痛膠囊內(nèi)容物進(jìn)行提取。

本研究建立了UPLC方法測定川芎定痛膠囊中四種化學(xué)成分。對建立的方法進(jìn)行了專屬性、線性、定量限、檢測限、回收率、精密度、重復(fù)性、穩(wěn)定性等方法學(xué)驗證。在47 min內(nèi)綠原酸、阿魏酸、延胡索乙素、歐前胡素四種化合物分離完全，各分析物在測定濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，相關(guān)系數(shù)>0.999，平均回收率>80%，由此證明，該方法良好，可對川芎定痛膠囊中的四種典型成分進(jìn)行定量。

綜上，本研究建立的UPLC方法簡單、靈敏、穩(wěn)定，可用于川芎定痛膠囊四種典型成分綠原酸、阿魏酸、延胡索乙素、歐前胡素的含量測定，可為其質(zhì)量控制研究提供實驗性依據(jù)，進(jìn)一步為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的完善提供科學(xué)依據(jù)，進(jìn)而提高其臨床用藥的安全性和有效性。