宋超群，楊巖，李鳳，劉國(guó)玉，高曉冬，中西秀樹(shù)

(江南大學(xué) 生物工程學(xué)院，江蘇 無(wú)錫，214122)

釀酒酵母(Saccharomycescerevisiae)在營(yíng)養(yǎng)缺陷或極端情況下，雙倍體的酵母會(huì)進(jìn)入減數(shù)分裂過(guò)程，最終在二倍體細(xì)胞中產(chǎn)生4個(gè)單倍體孢子，從而對(duì)抗外部環(huán)境[1]。單個(gè)釀酒酵母孢子的直徑在2 μm左右，可用作大分子生物材料[2-4]。然而現(xiàn)有報(bào)道中，尚未成功解析釀酒酵母孢子壁的結(jié)構(gòu)[5-8]。本實(shí)驗(yàn)室主要對(duì)釀酒酵母孢子進(jìn)行研究，并且通過(guò)高濃度鹽洗脫釀酒酵母孢子表面，在洗脫液中發(fā)現(xiàn)了RNA[9]。

HEK293T細(xì)胞來(lái)源于人胚胎腎細(xì)胞HEK293細(xì)胞的優(yōu)化，是生物分子研究中常用到的細(xì)胞之一，由于HEK293T細(xì)胞的轉(zhuǎn)染效率高，已成為廣大研究者研究基因功能的一個(gè)首選細(xì)胞株[10]。HEK293T細(xì)胞不同于巨噬細(xì)胞，沒(méi)有明顯的吞噬作用[11-13]。實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)HEK293T可以吞噬釀酒酵母孢子，且內(nèi)化效率較高[9]。本研究使用購(gòu)自Sigma公司的聚苯乙烯乳膠顆粒(latex beads amine-modified polystyrene, beads)，其直徑為2 μm。HEK293T細(xì)胞不能內(nèi)化beads，但是beads通過(guò)靜電結(jié)合釀酒酵母孢子表面分子后，可以被HEK293T細(xì)胞內(nèi)化。

因此，本文著力研究釀酒酵母孢子表面分子與beads交聯(lián)后，能否出現(xiàn)吞噬作用，以及影響吞噬效率的因素[14-15]。本研究為誘導(dǎo)非巨噬細(xì)胞內(nèi)化大顆粒機(jī)制研究、釀酒酵母孢子表面的特性研究奠定了基礎(chǔ)[16-17]，也為未來(lái)釀酒酵母孢子的醫(yī)用提供了理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

1.1.1 菌株

釀酒酵母菌株是以SK-1背景下的二倍體菌株AN120作為野生型(wild type，WT)菌株；大腸桿菌DH5α。本研究所用菌株均為本實(shí)驗(yàn)室保存。

1.1.2 酶及試劑

Lyso-Tracker Red，碧云天生物技術(shù)公司；RNase、Protease、Loading buffer，寶生物工程(大連)有限公司(TaKaRa)；PBS緩沖液、Agrose M、酵母提取物、胰蛋白胨、腺嘌呤、乙酸鉀、葡萄糖、氯化鈉、山梨醇，生工生物工程有限公司；Liticase溶菌酶、山梨醇、RNAiso Plus、beads，Sigma；DNA marker 1kb plus，北京全式金生物技術(shù)有限公司；氯仿、異丙醇、戊二醛，中國(guó)醫(yī)藥集團(tuán)有限公司。

1.1.3 培養(yǎng)基及其他溶液配制

LB培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物5，胰蛋白胨10， NaCl 5，瓊脂粉20(固體培養(yǎng)基)。

YPAD液體培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物10，胰蛋白胨20，腺嘌呤3，葡萄糖20。

YPACe培養(yǎng)基(g/L)：酵母提取物10,胰蛋白胨20，腺嘌呤3，乙酸鉀20。

KACe培養(yǎng)基(g/L)：乙酸鉀20。

1.4 mol/L 山梨醇：255 g山梨醇溶解于1 L 0.5% PBS緩沖液。

1.1.4 儀器與設(shè)備

DS-Ri2共聚焦熒光顯微鏡，Nikon公司；TY7622振蕩混合器，易擴(kuò)中國(guó)有限公司；QB-128旋轉(zhuǎn)培養(yǎng)器，其林貝爾儀器制造有限公司；HYL-A電熱恒溫?fù)u床，上海三發(fā)科學(xué)儀器有限公司；MX 150高速冷凍離心機(jī)，日本日立 HITACHI公司；DYY-6C凝膠電泳儀，北京六一儀器廠；Universal Hood II凝膠成像儀，Bio-Rad(美國(guó))公司；JY92-IIN超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)，寧波新芝生物科技有限公司；NanoDrop2000，賽默飛世爾科技有限公司公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 酵母培養(yǎng)與產(chǎn)孢

本文用到的酵母為AN120(野生型，二倍體)。酵母營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞使用YPAD培養(yǎng)基，酵母產(chǎn)孢使用YPACe培養(yǎng)基和KACe培養(yǎng)基。

先將釀酒酵母接入5 mL的YPAD培養(yǎng)基于試管中，放入30 ℃，220 r/min的搖床上培養(yǎng)24 h；將5 mL培養(yǎng)物轉(zhuǎn)入100 mL的YPACe培養(yǎng)基于搖瓶中，放入30 ℃，220 r/min的搖床上培養(yǎng)24 h；離心收集菌體，再將菌體轉(zhuǎn)入100 mL的KACe培養(yǎng)基于搖瓶中，放入30 ℃，220 r/min的搖床上培養(yǎng)24 h；取5 μL在顯微鏡下觀察產(chǎn)孢率，統(tǒng)計(jì)釀酒酵母和孢子的數(shù)量，再用孢子數(shù)量除以總數(shù)即為產(chǎn)孢率，實(shí)驗(yàn)中的產(chǎn)孢率要達(dá)到90%；最后離心收集孢子。

1.2.2 孢子的純化

將收集的細(xì)胞重懸于5 mL 1.4 mol/L山梨醇中，向其中加入20 μL的1 mg/mL溶菌酶充分混勻，37 ℃孵育2 h后棄上清液。向孢子中加入5 mL水，超聲破碎20 min，將子囊膜破碎，在顯微鏡下觀察，90%以上的孢子處于游離狀態(tài)。以3 000×g，2 min離心收集菌體。用0.5% TritonX-100洗滌3～6次，每次均以3 000×g，2 min離心收集菌體，隨后用水洗滌3次，每次均以3 000×g，2 min，最后離心收集孢子。

1.2.3 釀酒酵母孢子表面RNA的提取

將純化好的孢子進(jìn)行稱重，加入適量水，使孢子終質(zhì)量濃度為0.1 g/mL，取500 μL，9 000×g離心1 min， 去除水；加入500 μL 0.6 mol/L NaCl溶液，放入振蕩器振蕩3 min；15 000 r/min 離心，取上清液500 μL， 加入RNAiso Plus(TaKaRa)500 μL[18]。充分混勻，冰上放置5 min；加入200 μL氯仿(國(guó)藥)，迅速混勻，冰上靜置15 min；12 000×g4 ℃ 離心15 min； 取600 μL上清液轉(zhuǎn)入新的1.5 mL 離心管，加入 600 μL 異丙醇，冰上靜置30 min，隨后12 000×g4 ℃ 離心10 min，棄上清液；加入500 μL 75%乙醇清洗沉淀，7 500×g4 ℃ 離心5 min；去除上清液，冰上靜置10 min， 加入50 μL DEPC水。最后用Nano Drop檢測(cè) RNA的濃度。

1.2.4 釀酒酵母營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞與大腸桿菌RNA提取

酵母細(xì)胞于5 mL YPAD過(guò)夜培養(yǎng)，取1 mL于1.5 mL 離心管中，9 000×g離心1 min，加入適量玻璃珠，加入RNAiso Plus(TaKaRa)1 mL 于振蕩器上振蕩1 min，破碎細(xì)胞，放置冰上5 min；加入200 μL氯仿，迅速混勻，冰上靜置15 min；12 000×g4 ℃ 離心15 min；取600 μL上清液轉(zhuǎn)入新的1.5 mL 離心管，加入 600 μL異丙醇，冰上靜置30 min，12 000×g4 ℃ 離心10 min，倒去上清液；加入500 μL 75%乙醇清洗沉淀，7 500×g4 ℃ 離心5 min；去除上清液，冰上靜置10 min，加入50 μL DEPC水。最后在Nano Drop檢測(cè) RNA的濃度。

大腸桿菌于5 mL LB培養(yǎng)基過(guò)夜培養(yǎng)，操作步驟同上。

1.2.5 釀酒酵母孢子表面分子的提取

將純化好的孢子進(jìn)行稱重，加入適量水，控制孢子終質(zhì)量濃度為0.1 g/mL，取500 μL，9 000×g離心1 min， 棄上清液；加入500 μL 0.6 mol/L NaCl溶液，放入振蕩器振蕩3 min；15 000 r/min 離心，取上清液500 μL。 考慮到NaCl的濃度對(duì)于吞噬效率以及表面分子的影響，對(duì)0.6 mol/L NaCl進(jìn)行10倍稀釋，具體稀釋比例可根據(jù)后期需要的RNA的量，計(jì)算得出對(duì)應(yīng)的 0.6 mol/L NaCl的量，再進(jìn)行10倍稀釋。

1.2.6 beads的交聯(lián)

不加入戊二醛交聯(lián)：將beads置于2 mL離心管中，RNA組(加入定量的RNA)，釀酒酵母表面分子組(按照RNA的量，計(jì)算出加入釀酒酵母表面分子的量)，加入DEPC水，定容至2 mL。最后置于旋轉(zhuǎn)儀上(4 ℃，24 h)，充分交聯(lián)[19]。

戊二醛交聯(lián)：將beads置于2 mL離心管中，向離心管中加入200 μL 2%戊二醛預(yù)處理beads，置于30 ℃ 培養(yǎng)箱1 h；離心(5 000×g， 1 min)，并用去離子水洗滌，再離心，重復(fù)3次；RNA組(加入定量的RNA)，釀酒酵母表面分子組(按照RNA的量，計(jì)算出加入釀酒酵母表面分子的量)，加入DEPC水，定容至2 mL。最后置于旋轉(zhuǎn)儀上(4 ℃，24 h)，充分交聯(lián)。

1.2.7 RNA的檢測(cè)

對(duì)于釀酒酵母孢子表面分子，分別用RNase(0.5 U) 進(jìn)行處理，37 ℃，1 h，再進(jìn)行1.2.6中的交聯(lián)。

1.2.8 HEK293T細(xì)胞的培養(yǎng)

在長(zhǎng)滿HEK293T細(xì)胞的培養(yǎng)皿中，去除培養(yǎng)液，加入10 mL新的培養(yǎng)液充分懸浮，并取適量轉(zhuǎn)入新的24孔培養(yǎng)板中，計(jì)數(shù)，數(shù)量約為2.5×106個(gè)，37 ℃培養(yǎng)。

1.2.9 beads的吞噬與顯微鏡觀察計(jì)數(shù)

將1.2.6中的終產(chǎn)物，3 000×g2 min 離心，去除上清液，加入10 μL 水，混勻，取10 μL加入1.2.8中的HEK293T細(xì)胞培養(yǎng)液中，加入30 μL lysosome tracker，37 ℃ 放置1 h。取出培養(yǎng)板，除去培養(yǎng)液，加入100 μL PBS。在顯微鏡下觀察吞噬現(xiàn)象，并計(jì)數(shù)，計(jì)算吞噬的數(shù)量，從而得出吞噬效率。

2 結(jié)果與分析

2.1 HEK293T細(xì)胞對(duì)beads的吞噬

首先，在本研究室前期的研究工作中，發(fā)現(xiàn)釀酒酵母孢子能夠被HEK293T細(xì)胞吞噬，孢子直徑2 μm左右，所以HEK293T細(xì)胞對(duì)于微米級(jí)的顆粒也有著吞噬的作用。為此，研究中購(gòu)買來(lái)自Sigma公司的聚苯乙烯乳膠珠可用于創(chuàng)建乳膠凝集系統(tǒng)，稱為beads，beads表面帶有氨基基團(tuán)，呈正電荷，直徑2 μm。用beads來(lái)進(jìn)行吞噬研究。研究中將beads和HEK293T細(xì)胞共同培養(yǎng)1 h，然后共聚焦顯微鏡下觀察beads內(nèi)化現(xiàn)象。如圖1所示， beads本身具有藍(lán)色熒光，在顯微鏡DAPI下能明顯觀察到；lysosome tracker顯示的紅色即為被吞噬的beads，所以在TRAIC下能觀察到紅色的圓圈即為被吞噬；BF為拍到的beads和HEK293T細(xì)胞；MERGE為前3張圖的重疊圖。結(jié)果顯示beads能被HEK293T細(xì)胞吞噬。考慮到研究中加入的beads的數(shù)量是否會(huì)改變吞噬效率，因此研究了不同的beads量對(duì)于吞噬效率的影響，如圖2所示，100個(gè)HEK293T細(xì)胞吞噬的beads的數(shù)目即為吞噬百分比，進(jìn)而來(lái)表示吞噬的效率，吞噬百分比越高即為100個(gè)HEK293T細(xì)胞吞噬的beads數(shù)目越多。在加入不同量的beads條件下，100個(gè)HEK293T細(xì)胞吞噬的beads數(shù)目在1～2個(gè)左右，且差距不大，在后續(xù)的研究中使用8×107個(gè)beads做吞噬研究。

A-BF; B-TRAIC; C-DAPI; D-MERGE

圖2 不同beads量的吞噬效率

2.2 RNA對(duì)于吞噬的影響

本研究用0.6 mol/L NaCl溶液洗脫釀酒酵母孢子表面，從NaCl洗脫液中提取RNA再進(jìn)行純化，然后將RNA和beads一起孵育綁定，RNA帶負(fù)電荷，氨基修飾的beads帶正電荷，通過(guò)正負(fù)電荷作用力進(jìn)行綁定，形成RNA-beads后再進(jìn)行吞噬實(shí)驗(yàn)。研究猜測(cè)不同的RNA量對(duì)于吞噬效率有影響，所以用不同濃度的RNA綁定beads。為了探究不同來(lái)源的RNA是否對(duì)beads的吞噬有影響，分別從大腸桿菌、釀酒酵母營(yíng)養(yǎng)細(xì)胞中提取了RNA，并與釀酒酵母孢子壁RNA以及購(gòu)買的tRNA作了比較，不同RNA的凝膠電泳如圖3所示。如圖4-A所示,50 000 ng的RNA效果最優(yōu)，因此后續(xù)的研究都選用50 000 ng的RNA進(jìn)行反應(yīng)；吞噬效率的結(jié)果如圖4-B所示，結(jié)果表明所有RNA對(duì)于吞噬都有促進(jìn)作用，但是來(lái)自釀酒酵母孢子表面的RNA和tRNA有更明顯的促進(jìn)作用，同時(shí)由圖3看出，釀酒酵母孢子表面RNA和tRNA 都是長(zhǎng)度非常短的RNA，猜測(cè)短鏈RNA更能影響beads的吞噬效率。

圖3 不同RNA純化后的凝膠電泳圖

A-不同RNA的量；B-不同來(lái)源RNA

2.3 RNase對(duì)beads和RNA-beads吞噬作用影響

為了進(jìn)一步確認(rèn)RNA對(duì)于beads的吞噬有著促進(jìn)作用，因此有必要在體系中分別用RNase處理beads和RNA-beads，再和HEK293T細(xì)胞共同孵育，進(jìn)行吞噬實(shí)驗(yàn)。如圖5所示，結(jié)果顯示RNase不會(huì)對(duì)beads的吞噬產(chǎn)生影響。對(duì)于從釀酒孢子表面的RNA進(jìn)行純化，并對(duì)樣品分別加入RNase(0.5 U)，37 ℃， 1 h，再進(jìn)行綁定然后觀察吞噬結(jié)果。研究發(fā)現(xiàn)RNase可以明顯的降低吞噬效率。因此研究中純化的RNA確實(shí)對(duì)吞噬有促進(jìn)作用。

圖5 RNase對(duì)只有beads吞噬效率的影響和對(duì)加入RNA的beads吞噬效率的影響

2.4 釀酒酵母孢子表面分子和戊二醛交聯(lián)作用促進(jìn)吞噬作用

本研究選擇用0.6 mol/L NaCl進(jìn)行洗脫釀酒酵母孢子表面的分子，由于RNA也是從NaCl洗脫液中提取純化獲得，研究猜想是否洗脫液也會(huì)影響beads的內(nèi)化，所以用beads直接綁定孢子表面洗脫液，對(duì)洗脫液進(jìn)行了10倍稀釋以防高濃度的NaCl影響beads對(duì)分子的綁定。如圖6所示，NaCl的洗脫液相對(duì)于對(duì)照組、純化后的RNA都有明顯提升?？紤]到釀酒酵母表面分子的洗脫液中可能還有其他物質(zhì)，所以使用交聯(lián)劑戊二醛去研究是否其他分子也影響了beads的吞噬，戊二醛能夠作為交聯(lián)劑，對(duì)于氨基、羧基等有著交聯(lián)作用。結(jié)果見(jiàn)圖6，戊二醛的加入，使吞噬作用有了顯著提升，這說(shuō)明孢子洗脫液中除RNA外還有其他分子也可以影響beads的吞噬。研究中對(duì)戊二醛的影響做了猜測(cè)，戊二醛可能交聯(lián)了釀酒孢子表面除RNA外的其他分子，對(duì)于該分子需要進(jìn)一步研究。

圖6 戊二醛的加入對(duì)不同分子對(duì)于吞噬效率的影響

2.5 釀酒酵母孢子表面分子洗脫液中NaCl濃度對(duì)吞噬作用影響

本研究選擇用0.6 mol/L NaCl進(jìn)行洗脫釀酒酵母孢子表面的分子，考慮到NaCl濃度影響，先前實(shí)驗(yàn)在洗脫后進(jìn)行了稀釋。在此實(shí)驗(yàn)中，加入了不稀釋組，并在稀釋組與不稀釋組2組的最后體系中測(cè)量RNA和蛋白質(zhì)的量，如表1所示，沒(méi)有明顯差異。在吞噬作用實(shí)驗(yàn)中，如圖7所示，2組也不存在差異，因此NaCl濃度對(duì)于beads綁定分子吞噬沒(méi)有影響。

表1 不同濃度NaCl洗脫液中蛋白濃度和RNA總量

圖7 不同濃度NaCl對(duì)于吞噬效率的影響

2.6 RNase對(duì)釀酒酵母孢子表面分子促吞噬作用的影響

研究發(fā)現(xiàn)高鹽洗脫液也可以誘導(dǎo)beads內(nèi)化，是否高鹽洗脫液中誘導(dǎo)內(nèi)化的關(guān)鍵分子是RNA，為此用RNase處理了高鹽洗脫液。研究中加入了RNase(0.5 U)，在37 ℃放置1 h，再進(jìn)行綁定交聯(lián)然后吞噬觀察結(jié)果，如圖8所示，研究發(fā)現(xiàn)RNase的處理可以使吞噬數(shù)量大幅降低。因此釀酒酵母孢子表面洗脫液中RNA是調(diào)節(jié)內(nèi)化的關(guān)鍵分子。

圖8 RNase對(duì)釀酒酵母表面分子和beads吞噬效率的影響

3 討論

首先，本研究發(fā)現(xiàn)釀酒酵母孢子表面的分子可以誘導(dǎo)2 μm顆粒被HEK293T細(xì)胞內(nèi)吞，并對(duì)HEK293T細(xì)胞內(nèi)化beads數(shù)量做了評(píng)估。進(jìn)一步分析顯示釀酒酵母孢子表面的RNA可顯著影響beads的吞噬，并發(fā)現(xiàn)其他物種的RNA也具有誘導(dǎo)beads內(nèi)化的功能，這說(shuō)明RNA誘導(dǎo)beads內(nèi)化具有普遍性。同時(shí)研究發(fā)現(xiàn)高鹽洗脫液誘導(dǎo)beads內(nèi)化的效率要比純化后的RNA更為顯著，這說(shuō)明孢子表面的其他分子也具有調(diào)節(jié)beads內(nèi)化的能力，對(duì)于該分子有待進(jìn)一步研究和探討。

釀酒酵母孢子表面結(jié)構(gòu)復(fù)雜，由內(nèi)到外依次是甘露糖層，葡聚糖層，殼聚糖層和二酪氨酸層，最新研究發(fā)現(xiàn)孢子表面具有脂滴等結(jié)構(gòu)。0.6 mol/L NaCl 洗脫液中包含了除RNA以外的其他分子促進(jìn)beads的吞噬，到底是什么分子促進(jìn)了這一過(guò)程需要進(jìn)一步的探索。在研究中，使用洗脫液孵育戊二醛處理過(guò)的beads的吞噬效率最高。對(duì)釀酒酵母孢子表面分子和非巨噬細(xì)胞的吞噬研究，將為未來(lái)藥物運(yùn)輸?shù)牟牧虾蛡鬟f提供新思路。