俞萍，張慶賀，姜虹延，張宇杰，馬玉玲，翟歡

(長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)，吉林 長(zhǎng)春，130117)

免疫力是指人對(duì)外界病毒的抵抗能力，主要來(lái)自人體自身的免疫系統(tǒng)。免疫系統(tǒng)為人體在復(fù)雜多變的內(nèi)外環(huán)境中處于平衡狀態(tài)提供可靠的保證，是人體健康的基石[1-2]。2019年底爆發(fā)的全球性公共衛(wèi)生事件“COVID-19”，截至2021年1月4日，全球確診病例數(shù)已超過(guò)8 000萬(wàn)，死亡病例數(shù)超過(guò)180萬(wàn)，相關(guān)病例病死率達(dá)到了2.22%[3]，其中患者大多為免疫力低下的中老年人[4]，這更讓人們深刻意識(shí)到增強(qiáng)免疫力的重要性。為滿足臨床需要，有必要開發(fā)新的功能食品或治療藥物來(lái)提高免疫功能，而天然產(chǎn)物尤其是藥食同源中藥被認(rèn)為是發(fā)掘潛在的免疫調(diào)節(jié)作用成分的重要來(lái)源。

人參為五加科植物人參(PanaxginsengC.A.Meyer)的干燥根和根莖[5]，以人參為代表的中藥由于其安全性和多靶點(diǎn)的優(yōu)勢(shì)[6]，在提高免疫力方面有著重要的作用[7]，通過(guò)人參的免疫刺激作用可有助于治療病理依賴于降低吞噬能力的疾病[8-9]。近年來(lái)，隨著人參被列為新資源食品[10]，其食用價(jià)值深受人們的信賴及喜愛，人參系列產(chǎn)品應(yīng)運(yùn)而生，如人參保健酒、人參多糖發(fā)酵乳飲料與人參紅景天片等[11-13]。具有提高免疫力功能的人參功能因子及相應(yīng)產(chǎn)品有待進(jìn)一步的開發(fā)與研究。人參發(fā)揮多重藥理作用的物質(zhì)基礎(chǔ)主要有皂苷、糖肽、多糖、多肽、蛋白質(zhì)、揮發(fā)油等成分[14-16]。人參糖肽復(fù)合物(ginseng glycopeptides，Ggp)是由多糖、肽和糖肽組成的一類非皂苷類大分子化合物的混合物，同時(shí)具備糖類和肽類的雙重特性，現(xiàn)代藥理學(xué)研究表明其具有多種生物活性，如降血糖、降血脂、保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞、抗炎鎮(zhèn)痛、改善認(rèn)知障礙、增強(qiáng)記憶力、鎮(zhèn)靜、降膽固醇等[17]，目前，對(duì)于其提高機(jī)體免疫力功能的研究較少。此外，糖肽類物質(zhì)的生物活性一方面受本身糖蛋白性質(zhì)的影響，另一方面與其自身的復(fù)雜結(jié)構(gòu)有關(guān)，其結(jié)構(gòu)的復(fù)雜性主要是由糖肽的單糖組成及連接方式、氨基酸組成及連接方式、糖-肽結(jié)合位點(diǎn)的多樣性決定的，而這些因素都與其分子質(zhì)量息息相關(guān)，分子質(zhì)量不同，結(jié)構(gòu)組成不同，其相應(yīng)的生物學(xué)活性也不同。隨著各種天然生物活性糖蛋白的不斷發(fā)現(xiàn)和研究，對(duì)糖肽的開發(fā)也成為了一大研究熱點(diǎn)[18]。因此，本研究擬通過(guò)水提醇沉法、酶解法與透析法相結(jié)合制備不同分子質(zhì)量的人參糖肽復(fù)合物，采用建立環(huán)磷酰胺致免疫低下動(dòng)物模型研究其免疫調(diào)節(jié)活性，旨在挖掘人參提高免疫力的物質(zhì)基礎(chǔ)，探討不同分子質(zhì)量的人參糖肽對(duì)免疫活性的影響，擴(kuò)展人參糖肽的潛在臨床價(jià)值。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

5年生人參，由吉林省怡生對(duì)外貿(mào)易有限公司提供，經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)陳長(zhǎng)寶教授鑒定為五加科植物人參的干燥根和根莖；BALB/c小鼠，SPF級(jí)，體重18～21 g，雌性，許可證號(hào)為SCXK(遼)2020—0001，遼寧長(zhǎng)生生物技術(shù)有限公司；風(fēng)味蛋白酶(食品級(jí))，河南萬(wàn)邦實(shí)業(yè)有限公司；木瓜蛋白酶(食品級(jí))，浙江一諾生物科技有限公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒(增強(qiáng)型)，碧云天生物技術(shù)有限公司；環(huán)磷酰胺注射液，規(guī)格200 mg/支，Baxter Oncilogy Gat；香菇菌多糖片，規(guī)格15 mg/片(批號(hào)：20010104)，開封制藥(基團(tuán))有限公司生產(chǎn)；2,4-二硝基氟苯(2,4-dinitrofluorobenzene，DNFB)，Macklin；RPM1I640完全培養(yǎng)液，Gibco；YAC-1，中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)；乙二胺四乙酸二鉀、印度墨汁、Na2CO3，上海源葉生物科技有限公司；Hank′s液、硝基氯化四氮唑、吩嗪二甲酯硫酸鹽、氧化型輔酶Ⅰ、0.2 mol/L的Tris-HCl緩沖液、2.5%Triton， Solarbio；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

IH-H208C型富士寶電磁爐，佛山市富士寶電器科技股份有限公司；JJ-1型增力電動(dòng)攪拌器，江蘇金壇市江南儀器廠制造證；EYELA N-1100型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、EYELA-FDU2100型凍干機(jī)，東京理化器械株式會(huì)社；M200 pro型酶標(biāo)儀，瑞士TECAN集團(tuán)公司；ZQZY-85CNS型振蕩培養(yǎng)箱，上海知楚儀器有限公司；XT200i型動(dòng)物全血細(xì)胞分析儀，Sysmex；LSCO150 型CO2培養(yǎng)箱，Themo Fisher Scientific；LC20A 型高效液相色譜儀，SHIMADZU。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 不同分子質(zhì)量人參糖肽的制備

人參糖肽制備工藝流程如下：

取適量人參粗粉→浸泡30 min→14倍蒸餾水煎煮提取1 h、 提取3次、過(guò)濾→合并濾液、濃縮→使用70%乙醇醇沉→抽濾得沉淀→人參糖蛋白粗提物(純度>90.1%)→加入蒸餾水使底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為13%→加入風(fēng)味蛋白酶∶木瓜蛋白酶(質(zhì)量比1∶1) 使加酶量為1%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))→用1 mol/L NaOH或HCl調(diào)節(jié)pH至6→置50 ℃水浴鍋水浴4 h→100 ℃滅酶10 min→酶解液離心→上清液冷凍干燥→人參糖肽粗提物(純度>88.4%)→加水溶解→使用截留分子質(zhì)量為14～8 kDa、 7 kDa和1 kDa透析袋進(jìn)行透析→透析內(nèi)外液冷凍干燥→對(duì)樣品進(jìn)行分子質(zhì)量分布的測(cè)定，得到14 kDa(純度>85.1%)、11kDa(純度>89.8%)和<1 kDa(purity>86.4%)的3組人參糖肽。

分子質(zhì)量分布的測(cè)定：通過(guò)高效液相色譜分析系統(tǒng)，以分子質(zhì)量為12 000、 5 000、1 000、180 Da的葡聚糖與葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，利用GPC軟件計(jì)算分子質(zhì)量的分布，選用Sepax Technologies SRT SEC-100色譜柱(7.8 mm×300 mm，5 μm)，流動(dòng)相為0.7% Na2SO4，流速0.5 mL/min，柱溫35 ℃。

1.3.2 人參糖肽增強(qiáng)免疫力功能實(shí)驗(yàn)

1.3.2.1 動(dòng)物造模、分組及給藥

將適應(yīng)性飼養(yǎng)1周的270只BALB/c小鼠，分為3批，每批90只，每批小鼠隨機(jī)分9組(n=10)：空白對(duì)照組(Blank)、陽(yáng)性對(duì)照組[香菇菌多糖片，20 mg/(kg·d)，PC]、模型對(duì)照組[環(huán)磷酰胺，50 mg/(kg·d)， Model]、人參糖肽總提取物低劑量組[70 mg/(kg·d)，Ggp-L]、人參糖肽總提取物中劑量組[140 mg/(kg·d)，Ggp-M]、人參糖肽總提取物高劑量組[210 mg/(kg·d)，Ggp-H]、14 kDa人參糖肽[93.4 mg/(kg·d)，Ggp-1]、11 kDa人參糖肽[33.6 mg/(kg·d)， Ggp-2]、<1 kDa人參糖肽[29.4 mg/(kg·d)， Ggp-3]，其中，3個(gè)不同分子質(zhì)量組的給藥劑量根據(jù)各自的提取率等同于人參糖肽總提取物高劑量組，各組連續(xù)灌胃給予受試物30 d，空白對(duì)照組與模型組給予等體積生理鹽水。在第3周后開始以50 mg/(kg·d)的劑量隔天腹腔注射環(huán)磷酰胺，共注射5次，建立小鼠免疫力低下模型。實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，頸椎脫臼法處死小鼠，分別進(jìn)行免疫器官指數(shù)、小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)、遲發(fā)型變態(tài)反應(yīng)(delayed type hypersensitivity，DTH)、外周血白細(xì)胞總數(shù)及NK細(xì)胞活性測(cè)定實(shí)驗(yàn)。

1.3.2.2 外周白細(xì)胞總數(shù)測(cè)定

以摘除小鼠眼球的方法采集全血，24 h內(nèi)以全血細(xì)胞分析儀檢測(cè)白細(xì)胞總數(shù)。

1.3.2.3 小鼠碳廓清實(shí)驗(yàn)

稱量小鼠體重，以0.1 mL/10g的注射量將生理鹽水稀釋4倍的印度墨汁注入小鼠尾靜脈。注入墨汁后，立刻計(jì)時(shí)，在2和10 min分別從內(nèi)眥靜脈叢取血20 μL，立即加至2 mL Na2CO3溶液中，在酶標(biāo)儀600 nm處測(cè)吸光度，以Na2CO3溶液為空白對(duì)照。用頸椎脫臼法處死小鼠，取肝臟、脾臟和胸腺，用濾紙吸干臟器表面血污，稱重。一般以校正的吞噬指數(shù)a表示小鼠碳廓清能力。計(jì)算如公式(1)、公式(2)所示：

(1)

(2)

式中：a，吞噬指數(shù)；K，廓清指數(shù)；A1，2 min的吸光度；A2，10 min的吸光度；t1=2 min；t2=10 min。

1.3.2.4 小鼠DTH

用脫毛膏將每只小鼠腹部皮膚脫毛約1 cm×1 cm， 用DNFB溶液50 μL均勻涂抹致敏，5 d后用DNFB溶液10 μL均勻涂抹于小鼠右耳(2面)進(jìn)行攻擊，放回籠子，24 h后用頸椎脫臼法處死小鼠，以左右耳重的差值作為遲發(fā)型超敏反應(yīng)值。

1.3.2.5 NK細(xì)胞活性測(cè)定

實(shí)驗(yàn)前24 h將新鮮的且存活率大于95%的靶細(xì)胞(YAC-1細(xì)胞)進(jìn)行傳代培養(yǎng)。應(yīng)用前以Hank′s液洗清3次，用RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為4 ×105個(gè)/mL。將每只小鼠頸椎脫臼處死，無(wú)菌取脾，置于盛有適量無(wú)菌Hank′s液的小平皿中，用鑷子輕輕將脾磨碎，制成單細(xì)胞懸液。用Hank′s液清洗 2次， 1 000 r/min離心10 min棄上清液。細(xì)胞沉淀加入紅細(xì)胞裂解液，再加入Hank′s液，1 000 r/min離心10 min，用1 mL含10%小牛血清的RPMI1640完全培養(yǎng)液重懸，最后用RPMI1640完全培養(yǎng)液調(diào)整細(xì)胞濃度為2×107個(gè)/mL。取靶細(xì)胞和效應(yīng)細(xì)胞各100 μL(效靶比50 ∶1)，加入U(xiǎn)型96孔培養(yǎng)板中；靶細(xì)胞自然釋放孔加靶細(xì)胞和培養(yǎng)液各100 μL，靶細(xì)胞最大釋放孔加靶細(xì)胞和2.5%Triton各100 μL；上述各項(xiàng)均設(shè)3個(gè)復(fù)孔，于37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng) 4 h， 然后將96孔培養(yǎng)板1 500 r/min離心5 min，每孔吸取上清液100 μL置平底96孔培養(yǎng)板中，同時(shí)加入LDH基質(zhì)液100 μL，反應(yīng)3 min，每孔加入30 μL 1 mol/L 的HCl溶液，在酶標(biāo)儀490 nm處測(cè)定吸光度。計(jì)算如公式(3)所示：

(3)

式中：A0,自然釋放孔吸度光；A1，反應(yīng)孔吸光度；A2，最大釋放孔吸光度。

1.3.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

2 結(jié)果與分析

2.1 分子質(zhì)量分布測(cè)定

HPLC及GPC軟件分析得到人參糖肽的平均分子質(zhì)量及分子質(zhì)量分布，按照試驗(yàn)條件通過(guò)截留分子質(zhì)量為14～8 kDa、7 kDa和1 kDa透析袋透析后，得到的人參糖肽平均分子質(zhì)量為13 867、11 086、446 Da，能夠較好地滿足14、11 kDa和<1 kDa人參糖肽的要求。人參糖肽的分子質(zhì)量分布見表1。

表1 人參糖肽的分子質(zhì)量分布 單位：%

2.2 人參糖肽增強(qiáng)免疫力功能測(cè)定

2.2.1 外周血白細(xì)胞總數(shù)測(cè)定

白細(xì)胞是參與免疫應(yīng)答的血細(xì)胞，白細(xì)胞總數(shù)及各種白細(xì)胞百分比會(huì)因產(chǎn)生炎癥或疾病而變化，因此白細(xì)胞數(shù)是評(píng)價(jià)免疫作用的重要標(biāo)準(zhǔn)之一[19]。Model組白細(xì)胞計(jì)數(shù)明顯低于Blank組(圖1-a，P<0.01)。與Model組相比，PC組的小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)極顯著增加(P<0.01)；人參糖肽復(fù)合物3個(gè)劑量組的Ggp-L組的小鼠外周血白細(xì)胞顯著提高(P<0.05)，Ggp-M與Ggp-H組的小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)均極顯著提高(P<0.01)； Ggp-1與Ggp-3組的小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)均極顯著提高(P<0.01)，Ggp-2組的小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)顯著提高(P<0.05)。與Ggp-H組相比，Ggp-1組無(wú)明顯變化(P>0.05)，Ggp-2組的小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)極顯著降低(P<0.01)，而Ggp-3組的小鼠外周血白細(xì)胞數(shù)顯著提高(P<0.05)。結(jié)果表明，環(huán)磷酰胺可使小鼠的白細(xì)胞計(jì)數(shù)顯著降低，使小鼠免疫功能下降。人參糖肽復(fù)合物能促進(jìn)環(huán)磷酰胺引起的免疫抑制小鼠白細(xì)胞的形成，提高機(jī)體免疫力作用，且具有劑量依賴性，低分子質(zhì)量的人參糖肽效果更明顯。

2.2.2 小鼠體重及免疫器官指數(shù)

如表2所示，灌胃給予不同劑量和不同分子質(zhì)量的人參糖肽復(fù)合物30 d，不會(huì)導(dǎo)致小鼠死亡，與Blank組相比體重?zé)o顯著降低，表明人參糖肽復(fù)合物不會(huì)對(duì)小鼠產(chǎn)生毒性作用；脾臟和胸腺作為外周免疫器官和中樞免疫器官，是參與免疫反應(yīng)的主要場(chǎng)所，免疫器官指數(shù)的變化可以初步反映藥物對(duì)免疫器官以及免疫調(diào)節(jié)是否具有影響[20]。與Blank組相比，Model組脾臟和胸腺指數(shù)均有顯著下降(P<0.05)； 給藥組與Model組相比，免疫器官指數(shù)均有明顯的提高(P<0.05)。結(jié)果表明，人參糖肽復(fù)合物與不同分子質(zhì)量的人參糖肽復(fù)合物均能夠在一定程度上逆轉(zhuǎn)環(huán)磷酰胺所致的小鼠的免疫器官指數(shù)的下降，可逆轉(zhuǎn)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫器官萎縮，說(shuō)明人參糖肽復(fù)合物對(duì)兩大免疫器官具有保護(hù)作用。

表2 小鼠體重及免疫器官指數(shù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.2.3 碳廓清實(shí)驗(yàn)

巨噬細(xì)胞對(duì)先天性免疫具有重要作用，可以通過(guò)分泌各種細(xì)胞因子來(lái)調(diào)節(jié)機(jī)體免疫能力，血液中的單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)具有對(duì)進(jìn)入體內(nèi)的異物吞噬清除的功能，因此可通過(guò)吞噬率來(lái)反映單核-巨噬細(xì)胞系統(tǒng)的功能[21-22]。從圖1-b可以看出，與Blank組相比，Model組免疫抑制小鼠碳廓清吞噬指數(shù)顯著降低(P<0.05)。與Model組相比，PC組的小鼠碳廓清的吞噬指數(shù)極顯著提高(P<0.01)；人參糖肽復(fù)合物3個(gè)劑量組的Ggp-L組的小鼠碳廓清的吞噬指數(shù)顯著提高(P<0.05)，Ggp-M與Ggp-H組的小鼠碳廓清的吞噬指數(shù)均極顯著提高(P<0.01)，且隨著給藥劑量的增大吞噬指數(shù)呈現(xiàn)一定的劑量依賴性；Ggp-1組小鼠碳廓清的吞噬指數(shù)極顯著提高(P<0.01)，Ggp-2與Ggp-3組小鼠碳廓清的吞噬指數(shù)均顯著提高(P<0.05)。與Ggp-H組相比，Ggp-1組無(wú)顯著性差異(P>0.05)， Ggp-2、Ggp-3組小鼠碳廓清的吞噬指數(shù)均極顯著降低(P<0.01)。結(jié)果表明，人參糖肽復(fù)合物與不同分子質(zhì)量的人參糖肽復(fù)合物能夠一定程度上增強(qiáng)小鼠單核-巨噬細(xì)胞功能，提高小鼠的非特異性免疫應(yīng)答水平。且人參糖肽復(fù)合物的吞噬能力與人參糖肽復(fù)合物的劑量和分子質(zhì)量有關(guān)，高劑量和高分子質(zhì)量的人參糖肽復(fù)合物對(duì)改善巨噬細(xì)胞吞噬功能有較好的作用。

2.2.4 DTH實(shí)驗(yàn)

DTH是一種由T細(xì)胞介導(dǎo)的炎癥免疫反應(yīng)，DTH需要被激活的T淋巴細(xì)胞特異性識(shí)別特定抗原，從而增殖并釋放細(xì)胞因子[23-24]。在本研究中，我們使用DNFB作為抗原誘導(dǎo)的耳部DTH來(lái)評(píng)估人參糖肽復(fù)合物在機(jī)體細(xì)胞免疫功能的狀況。根據(jù)DTH耳腫脹試驗(yàn)的結(jié)果(圖1-c)，Model組與Blank組相比，Model組DTH程度極顯著降低(P<0.01)。與Model組相比，PC組小鼠DTH程度極顯著提高(P<0.01)；人參糖肽復(fù)合物3個(gè)劑量組的Ggp-L組的小鼠DTH程度顯著增加(P<0.05)，Ggp-M與Ggp-H組的小鼠DTH程度均極顯著增加(P<0.01)，且呈一定的劑量依賴性；Ggp-1、Ggp-2、Ggp-3組小鼠DTH程度均極顯著提高(P<0.01)。與Ggp-H組相比，Ggp-1組DTH程度極顯著降低(P<0.01)，Ggp-2、Ggp-3組小鼠DTH程度均極顯著提高(P<0.01)。結(jié)果表明，人參糖肽復(fù)合物與不同分子質(zhì)量的人參糖肽復(fù)合物能夠在一定程度上改善環(huán)磷酰胺對(duì)DTH的抑制作用，增強(qiáng)環(huán)磷酰胺處理的小鼠細(xì)胞介導(dǎo)的免疫功能，說(shuō)明低分子質(zhì)量的人參糖肽復(fù)合物可能對(duì)增強(qiáng)細(xì)胞免疫效果更好。

2.2.5 NK細(xì)胞活性測(cè)定

NK細(xì)胞是天然免疫系統(tǒng)中的重要組成部分，是機(jī)體抗腫瘤、抗感染的一種重要免疫細(xì)胞[25]。本文采用LDH法測(cè)定環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)的免疫抑制小鼠NK細(xì)胞活性。如圖1-d所示，與Blank組相比，Model組NK細(xì)胞活性極顯著降低(P<0.01)。與Model組相比，Ggp-L組無(wú)顯著性差異(P>0.05)，Ggp-M、Ggp-H組的小鼠NK細(xì)胞活性均極顯著增加(P<0.01)， 且呈一定的劑量依賴性；PC組、Ggp-1、Ggp-2、Ggp-3組小鼠NK細(xì)胞活均極顯著提高(P<0.01)。與Ggp-H組相比，Ggp-1組NK細(xì)胞活性極顯著降低(P<0.01)， Ggp-2、Ggp-3組無(wú)明顯變化(P>0.05)。結(jié)果表明，人參糖肽復(fù)合物與不同分子質(zhì)量的人參糖肽復(fù)合物能夠在一定程度上增加NK細(xì)胞的活力，且效果與臨床常用免疫促進(jìn)劑藥香菇菌多糖相似。因此，人參糖肽復(fù)合物可能通過(guò)促進(jìn)環(huán)磷酰胺誘導(dǎo)免疫低下小鼠體內(nèi)NK細(xì)胞活性來(lái)調(diào)節(jié)免疫反應(yīng)，且其作用效果隨分子質(zhì)量的降低而增強(qiáng)。

a-白細(xì)胞計(jì)數(shù)；b-碳廓清實(shí)驗(yàn)；c-DTH；d-NK細(xì)胞活性

3 結(jié)論

人參糖肽總提取物及重均分子質(zhì)量在14、11 kDa和<1 kDa的3種人參糖肽對(duì)免疫功能低下小鼠均具有升高外周血白細(xì)胞總數(shù)，促進(jìn)免疫器官生長(zhǎng)發(fā)育，增強(qiáng)小鼠DTH和吞噬細(xì)胞的吞噬能力，提高NK細(xì)胞活性的作用，且較低分子質(zhì)量的人參糖肽復(fù)合物的免疫效果相對(duì)更明顯，均具有增強(qiáng)免疫力的功能。后續(xù)將對(duì)人參糖肽的結(jié)構(gòu)以及其調(diào)節(jié)免疫活性的機(jī)理進(jìn)行研究，為開發(fā)具有提高免疫力功效的保健食品及藥品提供了潛在活性成分和應(yīng)用依據(jù)。