郭笑瀟 陳明泉

膿毒癥(Sepsis)是機(jī)體抗感染反應(yīng)失調(diào)而導(dǎo)致的危及生命的器官功能障礙[1]，臨床表現(xiàn)復(fù)雜，其發(fā)病率和病死率居高不下。肝臟作為人體最大的腺器官，血運(yùn)豐富，參與維持代謝和免疫穩(wěn)態(tài)，但也是膿毒癥最常受累的器官之一[2]。肝損傷能夠影響機(jī)體對細(xì)菌或脂多糖(LPS)的清除能力，是多器官衰竭和死亡的獨(dú)立預(yù)測因素，需盡早發(fā)現(xiàn)及干預(yù)[3]。

細(xì)胞焦亡(Pyroptosis)是一種細(xì)胞自發(fā)的程序性死亡，協(xié)助固有免疫系統(tǒng)清除病原體，同時激活強(qiáng)烈的炎性反應(yīng)[4]。已有研究表明，焦亡在調(diào)節(jié)膿毒癥的發(fā)展和預(yù)后中起重要作用[5]，焦亡的適度激活有助于及時清除感染細(xì)胞，但過強(qiáng)的反應(yīng)會造成大量細(xì)胞死亡、器官損傷甚至衰竭。

目前，細(xì)胞焦亡在膿毒癥肝損傷中的作用機(jī)制尚不明晰。因此，本文總結(jié)了近年來細(xì)胞焦亡分子機(jī)制的研究進(jìn)展，以及焦亡在膿毒癥肝損傷中起到的作用，旨在為膿毒癥肝損傷的臨床診治提供新思路。

一、細(xì)胞焦亡的概念與分子機(jī)制

與凋亡相似，焦亡也依賴程序性死亡關(guān)鍵蛋白半胱氨酸-天冬氨酸水解酶(Caspase，又稱胱天蛋白酶)，產(chǎn)生細(xì)胞核固縮和DNA斷裂。不同的是，焦亡依賴Caspase-1/4/5/11，下游事件由打孔蛋白消皮素(Gasdermin)家族蛋白執(zhí)行，特征表現(xiàn)為細(xì)胞腫脹、胞膜微孔形成、細(xì)胞破裂和胞內(nèi)容物釋放，膜聯(lián)蛋白V(Annexin V)染色陽性，TUNEL染色結(jié)果較凋亡細(xì)胞淺[6]。焦亡的激活途徑主要分為依賴Caspase-1的經(jīng)典途徑和不依賴Caspase-1的非經(jīng)典途徑。非經(jīng)典途徑在人類中由Caspase4/5介導(dǎo)，在嚙齒動物中由Caspase-11介導(dǎo)。

(一) 經(jīng)典途徑 細(xì)胞焦亡經(jīng)典途徑的啟動需要胞內(nèi)多聚蛋白復(fù)合物炎癥小體(Inflammasome)參與識別多種炎癥激活因子。當(dāng)機(jī)體遭受病原體、毒素等刺激時，胞膜上的模式識別受體(PRR)識別PAMPs或DAMPs，啟動下游炎癥小體合成。炎癥小體復(fù)合物包含受體蛋白、Caspase前體和含有Caspase蛋白活化和募集結(jié)構(gòu)域的凋亡相關(guān)斑點(diǎn)樣蛋白(Apoptosis-associated speck-like protein containing a caspase recruitment domain，ASC)。目前已知參與形成炎癥小體的受體蛋白有：含pyrin結(jié)構(gòu)域NOD樣受體家族1(NLR family pyrin domain containing 1，NLRP1)、NLRP3、含CARD結(jié)構(gòu)域NOD樣受體家族4(NLRC4)、黑素瘤缺乏因子2(Absent in melanoma 2，AIM2)和Pyrin蛋白等[7]。這些受體蛋白均通過死亡折疊域(Death fold domains)PYD或CARD募集接頭蛋白ASC放大信號后，與Caspase蛋白前體結(jié)合，組成炎癥小體[8]。

NLRP3是目前研究最廣泛及深入的炎癥小體，能夠接受病原體、毒素、細(xì)胞損傷釋放的DAMPs等多種刺激信號的激活。NLRP3活化需要雙信號介導(dǎo)——啟動信號與活化信號。啟動信號(Priming signal，signal 1)由胞外的PAMPs或細(xì)胞因子與細(xì)胞膜上的PRR結(jié)合發(fā)起，上調(diào)細(xì)胞核NLRP3、白介素(Interleukin，IL)-1β前體和Caspase-1蛋白轉(zhuǎn)錄水平。活化信號(Activation signal，signal 2)由未活化的NLRP3單體識別PAMPs和DAMPs發(fā)起，激活NLRP3單體發(fā)生寡聚并通過PYD招募集結(jié)ASC，進(jìn)而誘導(dǎo)ASC的CARD域募集Pro-caspase-1，組成完整的NLRP3炎癥小體[9]。在病原體感染時，炎癥小體激活的Caspase-1剪切IL-1β、IL-18前體并切割Gasdermin D(GSDMD)蛋白N端。成熟的IL-1β和IL-18釋放至胞外增強(qiáng)炎癥反應(yīng)并趨化更多固有或適應(yīng)性免疫細(xì)胞，活化的GSDMD轉(zhuǎn)位至細(xì)胞膜磷脂層，形成孔洞，造成胞外鈉離子、鈣離子內(nèi)流，破壞了胞內(nèi)外滲透壓，最終導(dǎo)致細(xì)胞吸水腫脹，胞膜破裂并釋放胞內(nèi)容物[10]。因此，炎癥小體能引發(fā)強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)并介導(dǎo)細(xì)胞焦亡，在膿毒癥中起重要作用。

(二) 非經(jīng)典途徑 脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的重要組成成分，致病菌中的LPS是導(dǎo)致膿毒癥的重要原因。已有研究發(fā)現(xiàn)，LPS與TLR4結(jié)合后激活MyD88/TRIF/NF-κB和IFNR/JAK/STAT通路促進(jìn)Caspase-4/5/11水解活化，通過非經(jīng)典途徑剪切GSDMD啟動焦亡[11]。同時，活化的GSDMD也可在胞內(nèi)直接促進(jìn)NLRP3小體中Caspase-1激活，協(xié)同啟動焦亡的經(jīng)典途徑[12]。然而，非經(jīng)典途徑的焦亡還存在其他可能的機(jī)制，LPS可不依賴TLR4受體激活Caspase-11，但具體的受體及通路仍在研究中[13]。

二、焦亡通路在肝損傷微環(huán)境中的作用

肝臟是抵抗病原體血流入侵的重要防線，已有研究表明，肝細(xì)胞、庫普弗細(xì)胞、星狀細(xì)胞等均存在焦亡反應(yīng)通路，可通過識別PAMPs或DAMPs啟動細(xì)胞焦亡，或通過細(xì)胞間交聯(lián)參與肝損傷。

(一) 肝細(xì)胞 肝細(xì)胞中炎癥小體激活和焦亡對于肝損傷的作用不容小覷。一項(xiàng)近期的研究中，Li等[14]發(fā)現(xiàn)了在膿毒癥急性肝損傷患者中焦亡通路相關(guān)蛋白顯著上調(diào)，而敲除GSDMD的小鼠肝損傷減少且生存率得到明顯提高。

動物感染模型為研究肝細(xì)胞焦亡通路在膿毒癥肝損傷的作用提供了依據(jù)。在盲腸結(jié)扎穿孔術(shù)(CLP)誘導(dǎo)的小鼠膿毒癥模型中，肝細(xì)胞焦亡相關(guān)蛋白Caspase-1和NLRP3表達(dá)增加，且與肝損傷程度正相關(guān)，而體外提前給予NLRP3或Caspase-1抑制劑能有效減少LPS對肝細(xì)胞造成的損傷[15]。大腸桿菌血流感染模型中，敲除NLRP3的小鼠生存率較野生型高，組織炎癥細(xì)胞浸潤更少，而NLRP3促進(jìn)播散性細(xì)菌感染的病死率不依賴IL-1β和IL-18。作者認(rèn)為，NLRP3的過度激活可能通過焦亡途徑釋放內(nèi)花生酸(Eicosanoid)，最終導(dǎo)致膿毒癥加重[16]。除經(jīng)典途徑外，感染后的肝細(xì)胞也可發(fā)揮細(xì)胞交聯(lián)作用，協(xié)助LPS通過非經(jīng)典途徑激活巨噬細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞的Caspase-11。肝細(xì)胞釋放的高遷移率族蛋白B1(High mobility group box 1，HMGB1)可以在胞外與LPS結(jié)合，通過晚期糖基化終產(chǎn)物受體(Receptor for advanced glycation end-products，RAGE)內(nèi)吞入巨噬細(xì)胞或內(nèi)皮細(xì)胞中的溶酶體。HMGB1溶解溶酶體的磷脂雙分子層，協(xié)助LPS釋放至胞內(nèi)，激活caspase-11和下游的焦亡[17]。

(二) 庫普弗細(xì)胞 庫普弗細(xì)胞(Kupffer cell)指位于肝臟中的特殊巨噬細(xì)胞，具備自我更新能力，通過吞噬清除內(nèi)毒素和釋放炎癥因子維持肝臟中的免疫穩(wěn)態(tài)，是肝臟微環(huán)境中主要的免疫細(xì)胞，也是肝臟中IL-1β、IL-18和NLRs的重要來源[18]。體內(nèi)外研究表明，LPS誘導(dǎo)的膿毒癥模型中庫普弗細(xì)胞NLRP3和IL-1β表達(dá)量顯著上調(diào)，提示庫普弗細(xì)胞具有較強(qiáng)的焦亡通路反應(yīng)能力[19]。同時，Chen等[20]的研究發(fā)現(xiàn)，大量LPS可以導(dǎo)致庫普弗細(xì)胞釋放組織蛋白酶B，促進(jìn)Caspase-11介導(dǎo)的非經(jīng)典途徑炎癥小體激活與細(xì)胞焦亡，降低小鼠生存率。

(三) 肝星狀細(xì)胞 肝星狀細(xì)胞(Hepatic stellate cell，HSC)是位于肝臟竇周間隙的內(nèi)皮周細(xì)胞，肝損傷時活化為肌成纖維細(xì)胞并分泌細(xì)胞外基質(zhì)參與損傷后修復(fù)，同時HSC的激活也是肝纖維化發(fā)生、發(fā)展的中心環(huán)節(jié)[21]。已有研究發(fā)現(xiàn)，膿毒癥患者長期肝硬化的風(fēng)險(xiǎn)增加，且與不良預(yù)后相關(guān)[22]。小鼠模型中也觀察到，膿毒癥會增加慢性肝硬化風(fēng)險(xiǎn)[23]，HSC中的炎癥小體激活后能夠上調(diào)結(jié)締組織生長因子(Connective tissue growth factor，CTGF)和基質(zhì)金屬蛋白酶組織抑制劑1(Tissue inhibitor of matrix metalloproteinase 1，TIMP1)表達(dá)，增加肝組織中膠原蛋白沉積和肝纖維化[24]。

三、針對焦亡肝損傷的靶向治療

目前臨床上針對膿毒癥肝損傷以支持性治療為主，尚無特效方法。膿毒癥中細(xì)胞焦亡的過度激活與不良預(yù)后相關(guān)，許多靶向肝臟內(nèi)細(xì)胞焦亡的體內(nèi)外實(shí)驗(yàn)正在進(jìn)行當(dāng)中，顯示出了應(yīng)用前景。

生物制劑因其較好的靶向性和安全性，近年來得到了廣泛使用，許多研究發(fā)現(xiàn)其在緩解膿毒癥肝細(xì)胞焦亡中也顯示出了一定效果。谷氨酰胺(Glutamine)是體內(nèi)含量豐富的游離氨基酸，有抗炎和免疫調(diào)節(jié)功能。Pai等實(shí)驗(yàn)表明[25]，給小鼠預(yù)防性補(bǔ)充含有谷氨酰胺的飲食能夠減少膿毒癥72 h后肝臟內(nèi)的細(xì)胞焦亡，減輕器官功能障礙和損傷，提示谷氨酰胺預(yù)防性使用可能對膿毒癥高危患者有器官保護(hù)作用。雌激素在體內(nèi)兼具抗炎和抗氧化的作用，而肝臟中焦亡信號顯示與雌激素存在相關(guān)性。雌激素可以降低膿毒癥小鼠血清AST、ALT水平，減輕肝臟中線粒體超氧化反應(yīng)，降低NLRP3-Caspase-1-GSDMD通路表達(dá)，從而減輕肝臟的炎癥損傷[26]。類似地，促紅細(xì)胞生成素也可通過抑制NLRP3信號減輕LPS膿毒癥大鼠肝細(xì)胞線粒體受損和肝損傷[27]。

一些體內(nèi)新發(fā)現(xiàn)的分子或蛋白質(zhì)顯示出了調(diào)節(jié)細(xì)胞焦亡的作用。STAT蛋白是調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、分化和死亡的胞內(nèi)信號分子和轉(zhuǎn)錄蛋白。Wang等[28]研究發(fā)現(xiàn)，STAT5a蛋白能夠阻斷庫普弗細(xì)胞NF-κB通路，下調(diào)Nlrp3基因表達(dá)并減少細(xì)胞焦亡，為機(jī)體抵抗膿毒癥提供保護(hù)。熱休克蛋白A12A(HSPA12A)是熱休克蛋白70家族的成員，能夠在非酒精性脂肪性肝病中調(diào)節(jié)肝臟穩(wěn)態(tài)。Liu等[29]研究表明，膿毒癥時HSPA12A能夠進(jìn)入肝細(xì)胞核，通過PGC-1α上調(diào)AOAH蛋白，抑制LPS激活Caspase-11介導(dǎo)的肝細(xì)胞焦亡，保護(hù)肝損傷。非編碼RNA為人類和小鼠基因組重要的轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，且參與調(diào)節(jié)多種生理和病理過程。

多種中草藥成分因其抗炎功效而在調(diào)節(jié)膿毒癥肝損傷中表現(xiàn)出良好的效果。野黃芩苷(Scutellarin)是從黃芩中分離出的黃酮類物質(zhì)，能抑制大腸桿菌感染小鼠巨噬細(xì)胞中NLRP3激活與細(xì)胞焦亡，減少肝臟中炎癥細(xì)胞浸潤和IL-1β水平[30]。6-姜酚是生姜中具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤和神經(jīng)保護(hù)功能的化學(xué)物質(zhì)，能夠抑制NLRP3介導(dǎo)的IL-1β分泌，Hong等的研究發(fā)現(xiàn)，6-姜酚能在體內(nèi)外激活Nrf2/HO-1通路抑制巨噬細(xì)胞炎癥小體激活，阻礙焦亡通路，減輕肝損傷[31]。

四、總結(jié)與展望

膿毒癥仍是臨床上棘手的疑難重癥，肝損傷是多器官衰竭和死亡的獨(dú)立預(yù)測因素，但有時臨床醫(yī)生會忽視其對于預(yù)后的重要性。細(xì)胞焦亡的過度激活會造成大量細(xì)胞死亡并促進(jìn)肝損傷甚至衰竭，靶向焦亡的研究正逐漸增多，但仍存在許多未知。例如，目前人們對于焦亡在肝損傷中的研究以基礎(chǔ)研究為主，多集中于炎癥小體和Caspase，而對于下游效應(yīng)分子打孔蛋白的探索較少，細(xì)胞焦亡在肝損傷中的信號通路也有待進(jìn)一步探索；且膿毒癥肝臟中焦亡信號的臨床證據(jù)尚不充足，靶向焦亡的治療研究不夠深入，現(xiàn)有的體內(nèi)外研究與臨床應(yīng)用仍有較長距離。因此，未來應(yīng)進(jìn)一步深入研究膿毒癥肝損傷的發(fā)病機(jī)制，開發(fā)針對焦亡的治療方法，以期降低膿毒癥病死率。