田小榮，宋紅麗（. 天津醫(yī)科大學一中心臨床學院，天津 3009 ；. 天津市第一中心醫(yī)院器官移植科，天津市器官移植重點實驗室，天津市器官移植臨床醫(yī)學研究中心，衛(wèi)生部危重病急救醫(yī)學重點實驗室，中國醫(yī)學科學院移植醫(yī)學重點實驗室，天津3009）

1970 年，F(xiàn)riedenstein 教授第一次從骨髓中分離出具有在體外以克隆集落形式快速生長能力的貼壁的成纖維樣細胞［1］。1991 年，Caplan 提出“間充質(zhì)干細胞”這個術(shù)語［2］。而2006 年，國際細胞治療學會才正式提出了定義人類間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）的基本標準：① 在標準培養(yǎng)條件下，必須具有塑料黏附性；② 表面分子CD73、CD90 和CD105 陽性；并缺乏表面分子CD45、CD34、CD14、CD11b、CD79α 或CD19 和HLA-DR；③ 在體外具有分化為成骨細胞、成脂肪細胞、成軟骨細胞的能力［3］。其被廣泛應用于再生醫(yī)學、腫瘤學、移植學等領(lǐng)域，用于治療移植物抗宿主病、克羅恩病、多發(fā)性硬化癥、肝臟移植、肌腱愈合等多種疾病。MSCs 可以來源于骨髓、脂肪組織、牙髓、臍帶等多種組織。骨髓是第一個分離出MSCs 的組織［1］，與臍帶源性MSCs 和脂肪組織源性MSCs 相比，骨髓間充質(zhì)干細胞（bone marrow derived mesenchymal stem cells，BMMSCs）具有更高的移植物移植率［4-6］。BMMSCs 的分離技術(shù)以及研究較為成熟，故本篇綜述主要闡述對象為BMMSCs。BMMSCs 生物學特性包括其形態(tài)學、免疫表型、增殖能力、多向分化潛能及免疫調(diào)節(jié)能力等，選擇什么狀態(tài)的BMMSCs 在醫(yī)學應用上能最大程度地發(fā)揮其特性成為人們關(guān)注的問題。研究表明，衰老會影響細胞的生物學特性，骨髓中所含的MSCs 數(shù)量極低，約為0.001% ～ 0.01%［7］，獲得足量的BMMSCs，體外擴增是必不可少的。供體的年齡、BMMSCs 連續(xù)體外擴增均會導致細胞的衰老，使其生物學特性發(fā)生變化，進而影響其應用。

1 供體年齡和體外擴增對BMMSCs 生物學特性的影響

1.1 供體年齡和體外擴增對BMMSCs 細胞形態(tài)、衰老標志物、細胞免疫表型、細胞周期、增殖能力的影響：當BMMSCs 衰老時，其形態(tài)、表型、細胞周期、增殖能力等都會發(fā)生變化。從骨髓中分離出來的MSCs 的生物學特性與供者的年齡密切相關(guān)。在老年個體中發(fā)現(xiàn)BMMSCs 數(shù)量和功能隨年齡而下降［8］。衰老供體相比于年輕供體來源的BMMSCs，其形態(tài)扁平、增大，胞質(zhì)顆粒狀［9］。Ma 等［10］觀察到老年（16 月齡）小鼠比年輕（3 月齡）小鼠來源的BMMSCs 的衰老相關(guān)的β 半乳糖苷酶（Senescence-associated β-galactosidase，SA-β-gal）陽性細胞的數(shù)量更多，p53、p21 和p16 在蛋白水平上也顯著升高。Chen 等［11］觀察到隨著年齡的增長（15 ～ 85 歲），人骨髓間充質(zhì)干細胞（human bone marrow MSCs，hBMSCs）SA-β-gal陽性細胞數(shù)量明顯增加，細胞周期分布阻滯在G0/G1 期, S 期所占比例隨著年齡的增長而減少。隨著年齡的增長BMMSCs 的增殖能力也會下降［11］。

BMMSCs 體外連續(xù)擴增會發(fā)生衰老［9］。Izadpanah 等［12］研究表明，在早期傳代中，hBMSC的細胞增殖率約為48 h。在第10 代（10 passages，P10）后，細胞的增殖效率穩(wěn)步下降。至少在P10之前hBMSC 保留了其高水平的端粒酶活性和長端粒長度。hBMSCs 在P15 顯示出擴大、扁平的細胞形態(tài)，此后他們停止進行細胞分裂，但仍保持存活。在P20， hBMSCs 經(jīng)歷了周期阻滯，端粒酶活性顯著降低。大鼠的BMMSCs 成纖維細胞樣形態(tài)維持了7 ～ 10 代。漸漸地，衰老細胞的增殖速度明顯減緩，凋亡率增加，最終失去對底物的黏附［13］。hBMSCs早期傳代的表面抗原檢測水平比晚期傳代要高得多，如CD146+的細胞數(shù)量隨著體外擴增而下降［9］。大鼠BMMSCs 連續(xù)傳代后細胞的表面抗原如CD90、CD44 和CD29 表達水平逐漸降低（P3 ＞P6 ＞P9）［13］。這些結(jié)果表明，BMMSCs 的誘導能力降低了。在hBMSCs P4、P7 和P14 中，SA -β- gal 活性逐漸增高，而端粒長度逐漸減少，表明hBMSCs 在傳代過程中衰老細胞的比例逐漸增加［14］。有研究表明大鼠BMMSCs P2 至P4 的BMMSCs 增殖潛能最高［13］。Konala 等［15］觀察到hBMSC 晚期傳代（P9）比早期傳代（P3）克隆集落形成單位數(shù)目降低，即增殖能力下降。P9 比P3 的G0/G1 期的細胞比例略有下降而SA -β- gal 陽性的細胞比例增加，說明衰老細胞的百分比隨著傳代次數(shù)的增加而增加。這些結(jié)果證實了晚期傳代的BMMSCs 活躍性和增殖能力下降。

1.2 供體年齡和體外擴增對BMMSCs 分化潛能的影響：隨著供體年齡增長，BMMSCs 向成骨細胞、軟骨細胞分化的能力越低，向成脂細胞分化的能力越強。老年小鼠來源的BMMSCs 比年輕小鼠來源的BMMSCs 成骨、成軟骨能力降低，而成脂能力增強［10，16］。但有研究也發(fā)現(xiàn)來自老年供體小鼠的BMMSCs 成脂潛能下降［16］。這與多數(shù)文獻結(jié)果不同，可能與供體、實驗室條件、培養(yǎng)方法等不同有關(guān)。Li 等［13］發(fā)現(xiàn)誘導2、6 和12 周齡，以及10 月齡SD 大鼠的BMMSCs 成骨分化，2 周齡組BMMSCs礦化結(jié)節(jié)明顯，骨鈣素濃度顯著高于其他各組，但與6 周齡組骨鈣素水平差異無統(tǒng)計學意義。10 月齡組BMMSCs 骨含量明顯減少，礦化結(jié)節(jié)明顯減少，其骨鈣素整體水平明顯低于其他各組。2 周齡和6 周齡供體SD 大鼠的細胞顯示出明顯增加的堿性磷酸酶（alkaline phosphatase，ALP）活性，這與12 周齡和10 月齡動物的細胞相比，與骨含量增加和礦化結(jié)節(jié)強陽性染色相一致。10 月齡供體的BMMSCs 的ALP 活性最低，骨含量和礦化結(jié)節(jié)形成減少，表明這些細胞喪失了成骨分化能力。

Kara?z 等［17］對大鼠BMMSCs 的P3、P50、P100進行研究，發(fā)現(xiàn)在傳代后期，成脂標志物——重組人過氧化物酶體增殖物激活受體γ 的表達顯著降低，這表明在長期培養(yǎng)過程中大鼠BMMSCs 的成脂分化能力降低。BMP-2、Coll1、Coll2、骨連接素、骨鈣素和Runx2、神經(jīng)標記物TUBB3 水平、軟骨形成標記物SOX9 水平在長期傳代中均被檢測到降低，有些指標在P100 中降低最為明顯。hBMSCs 在早期傳代中，成骨分化的菌落比例為50%～65 %。然而，這一頻率在P30 時下降至30% ～ 35%。在P10及以上培養(yǎng)時，hBMSCs 的脂肪生成頻率顯著降低。隨著傳代數(shù)的增加，成脂肪分化的集落占整個細胞群的比例下降。hBMSCs 在P1 均表現(xiàn)出向軟骨細胞分化的潛能。在P5 及更高代時，hBMSCs 迅速喪失了軟骨分化潛能［18］，而有研究則表明hBMSCs 至少在P10 之前保留了其多譜系分化的潛能［12］。大鼠BMMSCs體外培養(yǎng)時P3與P7均具有成骨、成脂能力，但是P7 的分化潛能比P3 小，到P9 時可能已失去多向分化潛能［19］。

1.3 供體年齡和體外擴增對BMMSCs 免疫調(diào)節(jié)的影響：BMMSCs 對T 淋巴細胞、B 淋巴細胞、NK 細胞、DC 細胞的增殖均有調(diào)節(jié)作用［20-23］。其免疫抑制功能通過Notch 信號和HLA-G 等介導與免疫細胞直接接觸，或通過分泌白介素-10（interleukin-10，IL-10）、肝細胞生長因子、IL-6、前列腺素E2、吲哚胺2，3 -雙加氧酶等相關(guān)免疫調(diào)節(jié)因子發(fā)揮作用。

BMMSCs 可抑制T 細胞的激活和增殖。與T 細胞共培養(yǎng)后BMMSCs 的IL-10 和轉(zhuǎn)化生長因子-β（transforming growth factor-β，TGF-β）基因表達顯著增強。BMMSCs 抑制T 細胞可通過接觸依賴誘導T 細胞抑制特性的調(diào)節(jié)性抗原提呈細胞間接抑制T細胞［24］、通過HLA 作用于原發(fā)性和繼發(fā)性反應及外泌體作用抑制T 細胞［22］。

BMMCs 抑制脂多糖活化的B 淋巴細胞增殖并抑制活化的B 淋巴細胞分泌IgG、IgM 和IgA。但BMMCs 不能誘導B 淋巴細胞凋亡［25-26］。

BMMSCs 抑制DC 分化過程中CD1a、CD40、CD80、CD86 和HLA-DR 的上調(diào)，并阻止DC 成熟過程中CD40、CD86 和CD83 表達的增加。BMMSCs上清液對DC 的分化沒有影響，但在成熟過程中抑制了CD83 的上調(diào)。BMMSCs 及其上清液均干擾了DC 的內(nèi)吞作用，降低了其分泌IL-12 和激活異反應性T 細胞的能力［23，27］。在接觸和Transwell 系統(tǒng)中，BMMSCs 抑制NK 細胞增殖，也抑制NK 細胞分泌γ-干擾素（interferoninterferon，IFN-γ）、IL-10、以及TNF-α，但不誘導細胞死亡［28］。

來自老年供體的BMMSCs 抑制T 細胞增殖的能力降低，而Siegel 等［29］分析了53 例年齡在13 ～80 歲的捐贈者，結(jié)果表明年齡和T 細胞抑制能力之間沒有顯著的相關(guān)性，這與供者年齡對BMMSCs 抑制T 細胞增殖有負面影響的論斷相矛盾［30］。

BMMSCs 在所有傳代中均高分泌TGF-β1，IL-4 水平略有升高，但不顯著； P6 中IL-6 水平比P4 明顯升高。隨著不斷的傳代，腫瘤壞死因子誘導蛋白6、HLA-G 的表達均降低。半乳糖凝集素-1 和半乳糖凝集素-3 的表達均增加。在所有傳代中，TNF-α、IFN-γ、IL-1β 和IL-4 的水平都很低，IL-10 水平相似，TGF-β1 水平都很高［29］。El-Sayed 等［32］對小鼠來源的BMMSCs 研究表明，BMMSCs 抑制CD8 的表達。與早期傳代的BMMSCs（P1）相比，晚期傳代的BMMSCs（P6）釋放的TGF-β 較少。然而，在早期和晚期傳代的BMMSCs中，IL-6 的表達水平相當。其他研究也表明，臍帶MSCs 隨體外擴增代數(shù)增加而逐漸衰老，但免疫抑制能力逐漸加強［33］,也有研究表明BMMSCs 隨體外擴增代數(shù)增加其免疫抑制能力降低［34］。

1.4 推薦使用的供體年齡及體外擴增代數(shù)：供體年齡的增長限制BMMSCs 更好地應用，根據(jù)前面所述在選擇供體來源時盡量選擇年輕的供體。綜合BMMSCs 不同生物學特點的分析，我們建議最好選6 周齡之內(nèi)的鼠類作為BMMSCs 的供體來源；于hBMSCs 而言則盡量選擇成年之前的供體作為BMMSCs 的來源。

連續(xù)體外擴增，BMMSCs 會發(fā)生衰老，進而影響其形態(tài)、增殖能力、分化潛能、免疫調(diào)節(jié)等特性，所以選擇合適傳代數(shù)是非常重要的。對于hBMSCs，我們建議選擇P2-P6 或P8 的BMMSCs［35-36］；而鼠源性的BMMSCs，我們建議選擇P2-P6 的BMMSCs。但是關(guān)于MSCs 是否在傳代過程中保持免疫調(diào)節(jié)特性的信息較少［31］，如何平衡其他生物學特性與免疫調(diào)節(jié)特性進而選擇合適的傳代數(shù)仍有待進一步研究。

2 抗BMMSCs 衰老方法初探尋

BMMSCs 的應用廣泛，但是其衰老問題成為大家關(guān)注的焦點。如何延緩或者改善BMMSCs 衰老也成為了這些年研究的熱點。巨噬細胞遷移抑制因子，是一種促炎細胞因子，可調(diào)節(jié)年齡相關(guān)信號通路。其通過與CD74 相互作用，進而激活AMPKFOXO3a 信號通路，使BMMSCs 從年齡誘導的衰老狀態(tài)恢復活力［37］。褪黑激素對P1、P4 BMMSCs 的集落形成、增殖和成骨分化沒有影響，但在很大程度上阻止了P15 BMMSCs 的自我更新和分化能力的下降。褪黑素通過激活抗氧化防御系統(tǒng)，抑制細胞衰老途徑，保留控制干細胞特性基因的表達，能有效地預防BMMSCs 長期傳代后的功能障礙和治療失?。?8］。Fei 等［39］研究表明，老年BMMSCs 乙?；胶蚄AT6A 表達降低，下調(diào)KAT6A 導致老年BMMSCs 增殖、集落形成和成骨分化減少。發(fā)現(xiàn)KAT6A 可以調(diào)節(jié)Nrf2/ARE 信號通路，抑制骨髓間充質(zhì)干細胞中活性氧的積累，從而促進老年BMMSCs 增殖、集落形成、成骨及成骨分化。

研究者們從細胞因子、作用因素及信號通路等多個方面探尋抗BMMSCs 衰老的方法，其仍有待于我們進一步探索，這將非常有利于BMMSCs 的治療和研究應用。

3 結(jié) 語

隨著供體年齡及體外擴增代數(shù)的增加，BMMSCs的形態(tài)、分化能力、增殖速度和免疫調(diào)節(jié)特性等生物學特性均發(fā)生了變化，BMMSCs 的衰老限制了其在治療及研究方面的應用。所以選擇合適的供體及適合的體外擴增代數(shù)是非常必要的。為了延緩或逆轉(zhuǎn)BMMSCs 的衰老，探尋抗衰老的方法成為新的研究方向。