鄧長(zhǎng)娟 綜述，謝小兵 審校

1.湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南長(zhǎng)沙 410001；2.湖南中醫(yī)藥大學(xué)第一附屬醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)與病理中心，湖南長(zhǎng)沙 410000

根據(jù)國(guó)際癌癥研究機(jī)構(gòu)(IARC)在2020年發(fā)布的數(shù)據(jù),全球乳腺癌新發(fā)病例預(yù)計(jì)高達(dá)226萬(wàn)例，其死亡病例數(shù)約為68萬(wàn)，排名第五，但在女性中排名第一，同時(shí)乳腺癌也是中國(guó)女性最常見(jiàn)的癌癥，中國(guó)2020年的新發(fā)病例數(shù)預(yù)計(jì)為42萬(wàn)，占全世界的18.6%，死亡約為12萬(wàn)，占全世界的17.6%[1]。乳腺癌的發(fā)病原因較多，如飲食習(xí)慣、生活方式的改變、肥胖、生殖因素和長(zhǎng)期的內(nèi)源性雌激素接觸(初潮早、絕經(jīng)晚、未產(chǎn)婦或高齡首次次足月妊娠)等是女性乳腺癌的重要危險(xiǎn)因素[2-4]。同時(shí)，研究表明，乳腺癌的發(fā)生與表觀遺傳改變密切相關(guān)[5]。表觀遺傳學(xué)即DNA的堿基排列不變，但是由于某些原因使基因的表達(dá)出現(xiàn)了可以遺傳的變化。一般認(rèn)為表觀遺傳學(xué)包括DNA、RNA和組蛋白的修飾及染色質(zhì)三維結(jié)構(gòu)改變等，現(xiàn)在發(fā)現(xiàn)至少有4種DNA和16種組蛋白修飾，其中對(duì)DNA甲基化的研究最深[6]。DNA甲基化描述了DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶(DNMT)將S-腺苷甲硫氨酸(SAM)上的一個(gè)甲基與胞嘧啶-磷酸-鳥(niǎo)嘌呤二核苷酸(CpG)上胞嘧啶殘基第5位碳原子結(jié)合，生成5′-甲基胞嘧啶(5mC)的過(guò)程[7]。目前有5種與真核生物相關(guān)的DNMTs，分別為DNMT1、DNMT2、DNMT3L、DNMT3a、DNMT3b[8]。本文綜述DNA甲基化在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展中的分子機(jī)制及在早期篩查、預(yù)后和靶點(diǎn)治療等方面的研究進(jìn)展，并對(duì)未來(lái)的研究提出建議和展望。

1 DNA甲基化與腫瘤

在人體中，CpG含量較低，而在啟動(dòng)子和第一外顯子區(qū)域，富集CpG位點(diǎn)，這個(gè)富集CpG位點(diǎn)的區(qū)域被稱為CpG島(CGI)[9]。當(dāng)抑癌基因CGI過(guò)度甲基化時(shí)，DNA的轉(zhuǎn)錄過(guò)程被抑制，造成惡性腫瘤的發(fā)生，DNA甲基化可以沉默各種不同類型的基因。同時(shí)，致癌基因反常低甲基化也與惡性腫瘤密切相關(guān)[10]。啟動(dòng)子區(qū)域的低甲基化使基因處于異常活躍狀態(tài)，產(chǎn)生一些異常蛋白質(zhì)，破壞正常細(xì)胞結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞的功能紊亂并由此引發(fā)癌癥[11]。GGI的甲基化過(guò)高或過(guò)低與癌癥的發(fā)生關(guān)系密切，而全基因組低甲基化也與癌癥的發(fā)生關(guān)系密切。MOORE等[12]研究發(fā)現(xiàn)，白細(xì)胞基因組DNA低甲基化會(huì)增大膀胱癌風(fēng)險(xiǎn)，全基因組DNA低甲基化會(huì)引起染色體不穩(wěn)定并導(dǎo)致癌癥發(fā)生，此后又有學(xué)者發(fā)現(xiàn)，在中國(guó)血液白細(xì)胞DNA的特異性核基質(zhì)蛋白-4(BLCA-4)重復(fù)序列中檢測(cè)到總體甲基化不足的個(gè)體患乳腺癌的風(fēng)險(xiǎn)增加，并且表明BLCA-4低甲基化可能是乳腺癌患者預(yù)后不良的有用生物標(biāo)志物[13]。

2 DNA甲基化與乳腺癌

基因啟動(dòng)子甲基化在乳腺癌中非常普遍，超過(guò)100個(gè)基因啟動(dòng)子被報(bào)道有高甲基化現(xiàn)象[14]，包括(1)細(xì)胞周期調(diào)控基因，如細(xì)胞周期蛋白D2基因(CCND2)和細(xì)胞周期依賴性激酶抑制基因(CDKN2A)[15-16]；(2)DNA修復(fù)基因，如乳腺癌易感基因1(BRCA1)、乳腺癌易感基因2(BRCA2)[17-18]、胱甘肽S轉(zhuǎn)移酶P1基因(GSTP1)[19]；(3)組織侵襲和轉(zhuǎn)移基因，如Ras相關(guān)區(qū)域家族1A基因(RASSF1A)[20]、視黃醇受體β基因(RARβ)[21]；(4)細(xì)胞轉(zhuǎn)錄基因，如同源框基因A基因(HOXA1、HOXA5、HOXA9、HOXA10等)[22-23]；(5)細(xì)胞黏附基因，如鈣黏著蛋白1基因(CDH1)[24]；(6)激素介導(dǎo)的細(xì)胞信號(hào)傳導(dǎo)基因，如雌激素受體α基因(ERα)[25]。原癌基因啟動(dòng)子低甲基化也會(huì)導(dǎo)致癌癥發(fā)生，如三葉因子1基因(TFF1)[26]，這表明基因甲基化在乳腺癌生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移中發(fā)揮重要作用。

3 DNA甲基化在乳腺癌早期篩查中的作用

目前，大多數(shù)乳腺癌患者在確診時(shí)就已經(jīng)是晚期或者轉(zhuǎn)移階段[27]，因此，癌癥早期篩查標(biāo)志物意義重大。乳腺癌的輔助檢查手段主要有體格檢查、超聲檢查、鉬靶檢查、核磁共振檢查。超聲和鉬靶檢查具有假陽(yáng)性高、射線暴露、疼痛、焦慮和負(fù)面心理等缺點(diǎn)[28]，假陽(yáng)性會(huì)導(dǎo)致對(duì)乳腺癌的過(guò)度診療[29]，而核磁共振檢查價(jià)格昂貴。因此，尋找新的足夠靈敏和特異的經(jīng)濟(jì)型癌癥篩查預(yù)后生物標(biāo)志物意義重大。

DNA甲基化修飾參與癌癥早期過(guò)程，并且隨著癌癥進(jìn)展，其DNA甲基化出現(xiàn)了不同模式。近年來(lái)大量文獻(xiàn)研究了循環(huán)或無(wú)細(xì)胞 DNA(cfDNA)甲基化狀態(tài)在包括乳腺癌在內(nèi)的各種腫瘤診斷與預(yù)后中的作用[30-34]，cfDNA檢測(cè)具有采集方便、無(wú)創(chuàng)、可重復(fù)的優(yōu)點(diǎn)，在檢測(cè)診斷中具有廣闊前景。有研究指出，在三陰性乳腺癌中，BRCA1啟動(dòng)子在cfDNA和組織標(biāo)本中的甲基化水平差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[18]，在乳腺癌患者外周血中，APC、FOXA1、RASSF1A、BRCA1、ATM等基因啟動(dòng)子甲基化頻率相對(duì)于健康者更高[31,35-39]。因此，cfDNA作為生物標(biāo)志物在癌癥檢測(cè)中具有廣闊的應(yīng)用前景。

但是cfDNA在外周血與正常細(xì)胞DNA中同時(shí)存在，這會(huì)導(dǎo)致特異度降低；cfDNA在健康者外周血中的水平為5～20 ng/mL,并且通過(guò)檢測(cè)母體中胎兒游離DNA發(fā)現(xiàn)其半衰期平均為16.3 min，這些都導(dǎo)致cfDNA作為生物標(biāo)志物靈敏度降低。但是聯(lián)合檢測(cè)多種特異性cfDNA可以提高檢測(cè)靈敏度與特異度。

4 DNA甲基化在乳腺癌預(yù)后中的作用

DNA甲基化除了在乳腺癌早期篩查中發(fā)揮作用外，還與患者不良預(yù)后密切相關(guān)。研究人員發(fā)現(xiàn)類成對(duì)同源框轉(zhuǎn)錄因子2基因(PITX2)的甲基化使乳腺癌不良預(yù)后風(fēng)險(xiǎn)增大[40]；MEHROTRA等[41]研究發(fā)現(xiàn)，與乳腺癌遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移相關(guān)的基因CCD2、RAR-β、Twist、RASSF1A和HIN-1甲基化頻率在轉(zhuǎn)移性乳腺癌組織標(biāo)本中較原發(fā)性乳腺癌高；并且研究表明乳腺癌患者甲基化水平與生存時(shí)間密切相關(guān)[42-43]。

5 DNA甲基化轉(zhuǎn)移酶抑制劑(DNMTi)與乳腺癌治療

DNA甲基化的變化是一種動(dòng)態(tài)且可逆轉(zhuǎn)的過(guò)程，DNA去甲基化造成轉(zhuǎn)錄激活，重新表達(dá)沉默基因，這為癌癥提供了一種新思路。DNMTi下調(diào)基因甲基化水平，使由于高甲基化而沉默的基因重新表達(dá)以達(dá)到治療癌癥的目的。

目前，DNMTi主要用于治療骨髓異常增生綜合征(MDS)等血液系統(tǒng)惡性腫瘤，而在實(shí)體瘤中的臨床應(yīng)用還在研究當(dāng)中。美國(guó)食品藥品管理局(FDA)已批準(zhǔn)地西他濱(5-氮雜胞嘧啶核苷)等DNMTi藥物用于臨床治療所有亞型的MDS。DNMTi能顯著改善患者生活質(zhì)量，提高預(yù)期壽命[44-45],且DNMTi與組蛋白脫乙酰基酶抑制劑(HDACi)聯(lián)合用藥具有協(xié)同作用，治療效果更好[46-48]。

DNMTi單獨(dú)或聯(lián)合其他抗腫瘤藥物在細(xì)胞實(shí)驗(yàn)和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)中的效果明顯，如地西他濱聯(lián)合經(jīng)典抗腫瘤藥物聚ADP核糖聚合酶抑制劑(PARPi)對(duì)具有野生型或突變型BRCA甲基化導(dǎo)致的乳腺癌和卵巢癌有治療效果[49]，地西他濱可以反轉(zhuǎn)乳腺癌中蛋白激酶D1(PRKD1)啟動(dòng)子甲基化，恢復(fù)PRKD1的表達(dá)并阻斷腫瘤向肺的擴(kuò)散和轉(zhuǎn)移[50]。但是一項(xiàng)關(guān)于用于地西他濱聯(lián)合HDACi(恩替司他)用于治療晚期乳腺癌臨床試驗(yàn)未能達(dá)到預(yù)期效果的研究表明，DNMT抑制劑在乳腺癌中的臨床治療效果尚待研究，同時(shí)DNMTi治療乳腺癌的最佳劑量和方案尚未得到充分研究[51]。

6 DNA甲基化常見(jiàn)的檢測(cè)方法

6.1限制性酶切PCR法(RE-PCR) RE-PCR是最早的DNA甲基化檢測(cè)技術(shù)。其基本原理為：使用兩種專門(mén)的限制內(nèi)切酶處理DNA后，這兩種酶分別對(duì)甲基化靈敏和不靈敏。根據(jù)甲基化片段上下游的堿基排列來(lái)確定引物的PCR擴(kuò)增。DNA有甲基化現(xiàn)象，則含有甲基化位點(diǎn)的這段基因?qū)⒈粩U(kuò)增，否則無(wú)法擴(kuò)增。RE-PCR操作簡(jiǎn)單，成本低，但這個(gè)方法需要大樣本檢測(cè)且只能檢測(cè)限制性內(nèi)切酶識(shí)別的CpG島甲基化狀態(tài)，當(dāng)酶切不完全時(shí)易出現(xiàn)假陽(yáng)性。

6.2甲基化特異性PCR法(MSP) MSP是經(jīng)典的甲基化檢測(cè)方法，亞硫酸氫鈉處理DNA后，未甲基化DNA序列中的胞嘧啶變成尿嘧啶，而甲基胞嘧啶不改變。按照兩種堿基序列，分別設(shè)計(jì)甲基化引物和非甲基化引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，凝膠電泳檢測(cè)擴(kuò)增片段確認(rèn)基因是否發(fā)生甲基化。該方法操作簡(jiǎn)單、費(fèi)用較低且特異度較高，但只能對(duì)已知甲基化位點(diǎn)的序列進(jìn)行檢測(cè)，并且不能定量分析甲基化水平。

6.3重亞硫酸鹽測(cè)序法(BSP) BSP同樣先用亞硫酸氫鈉預(yù)處理DNA，接著設(shè)計(jì)兩種引物進(jìn)行PCR，再經(jīng)過(guò)克隆、測(cè)序等步驟可以得知DNA序列中單獨(dú)CpG位點(diǎn)是否發(fā)生了甲基化。該方法特異度和靈敏度都很高，但是操作復(fù)雜，成本也較高。

6.4甲基化敏感性高分辨率熔解曲線法(MS-HRM) 高分辨率熔解法(HRM)最初是用來(lái)檢測(cè)單核苷酸多態(tài)性基因分型的，后被完善用于DNA甲基化檢測(cè)。其同樣經(jīng)亞硫酸氫鹽處理，PCP擴(kuò)增得到兩種產(chǎn)物。根據(jù)兩種產(chǎn)物熔解曲線不同并以此檢測(cè)DNA甲基化水平。MS-HRM操作較簡(jiǎn)單，靈敏度高且成本較低，但是只能用來(lái)檢測(cè)DNA總體甲基化水平，無(wú)法檢測(cè)單個(gè)CpG位點(diǎn)甲基化狀態(tài)。

6.5甲基化熒光檢測(cè)法 甲基化熒光檢測(cè)法是高通量檢測(cè)，該方法同樣先用亞硫酸氫鈉處理DNA,接著設(shè)計(jì)引物和TaqMan 熒光探針來(lái)進(jìn)行PCR擴(kuò)增，根據(jù)獲得的熒光信號(hào)得知DNA甲基化狀態(tài)。甲基化熒光檢測(cè)法具有靈敏度高的特點(diǎn)，能夠在超過(guò)10 000倍未甲基化等位基因的情況下檢測(cè)甲基化等位基因。甲基化熒光檢測(cè)法過(guò)程比較簡(jiǎn)單、定量準(zhǔn)確、特異度高，能夠快速篩查腫瘤，但同時(shí)檢測(cè)成本也較高。

6.6焦磷酸測(cè)序法 焦磷酸測(cè)序法是DNA甲基化檢測(cè)結(jié)果的“金標(biāo)準(zhǔn)”，是第3代測(cè)序技術(shù)。同樣先用亞硫酸氫鈉處理DNA，隨后進(jìn)行焦磷酸測(cè)序，最后進(jìn)行甲基化分析。焦磷酸測(cè)序能夠定量精確到單個(gè)位點(diǎn)。

7 小 結(jié)

近年來(lái)大量研究均證實(shí)，DNA甲基化與乳腺癌的發(fā)生、發(fā)展、預(yù)后等密切相關(guān)，DNA甲基化是一個(gè)具有廣闊應(yīng)用前景的研究方向。cfDNA甲基化改變作為篩查手段,能夠?qū)鹘y(tǒng)乳腺癌篩查起到補(bǔ)充或者改進(jìn)的作用，并且多項(xiàng)研究表明，聯(lián)合多種特異性甲基化指標(biāo)能提高乳腺癌診斷的特異度和靈敏度。此外，腫瘤或鄰近組織或外周血中的DNA甲基化改變也可以幫助臨床醫(yī)生確定乳腺癌的預(yù)后和療效。同時(shí)DNMTi在MDS中的成功應(yīng)用也為乳腺癌治療開(kāi)拓了新思路，并且已有動(dòng)物和細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明DNMTi與其他抗腫瘤藥物聯(lián)合使用能得到更好的療效。但是，DNMTi在乳腺癌中的臨床應(yīng)用還需要廣大研究人員不斷深入研究。甲基化檢測(cè)的方法隨著測(cè)序技術(shù)的發(fā)展也越來(lái)越先進(jìn)，極大地推進(jìn)了甲基化研究進(jìn)展?？傊珼NA甲基化作為乳腺癌生物標(biāo)志物的臨床應(yīng)用及實(shí)現(xiàn)臨床治療還需要進(jìn)一步的研究。