張彥坤，楊兵坤，李航宇，胡林勇，趙新全，徐世曉，孫平*

(1.河南科技大學(xué)動(dòng)物科技學(xué)院，河南洛陽(yáng)471003；2.中國(guó)科學(xué)院西北高原生物研究所，西寧810008)

魚(yú)類除了在胚胎時(shí)期能夠依靠卵黃或者母體提供的營(yíng)養(yǎng)生存之外，其余各生活階段都必須從外界環(huán)境中獲取食物或能量，當(dāng)無(wú)法從外界獲取足夠的食物時(shí)，其生存、生長(zhǎng)、繁殖、甚至后代都會(huì)受到影響(宋昭彬，何學(xué)福，1998)。自然界中因季節(jié)變化、洄游、生存環(huán)境惡化，甚至在人工養(yǎng)殖中飼料投喂不均勻?qū)е碌聂~(yú)類短期饑餓現(xiàn)象十分普遍(Hungetal.，1997；Barcellosetal.，2010；Bar，2014)，更是導(dǎo)致幼、稚魚(yú)高死亡率的重要因素之一。因此，魚(yú)類通過(guò)組織學(xué)、行為和生理生化活動(dòng)的改變，如激素的分泌、與能量維持相關(guān)的基因表達(dá)以及酶激活等方式以降低代謝、延長(zhǎng)能量?jī)?chǔ)備滿足新陳代謝需要的時(shí)間應(yīng)對(duì)饑餓脅迫(Parketal.，2012；覃川杰等，2015)。

饑餓脅迫會(huì)對(duì)魚(yú)類的腸道、肝臟等組織產(chǎn)生諸多不利影響，譬如減少腸道長(zhǎng)度(Riosetal.，2004)和細(xì)胞數(shù)量、腸褶和刷狀邊界長(zhǎng)度，導(dǎo)致腸道肌纖維排列松散、腸道絨毛受損等(Sire & Vernier，1992)；肝臟組織喪失連續(xù)性和致密性、肝細(xì)胞和細(xì)胞核變小，核仁丟失，線粒體增大，胞間層空隙變大，細(xì)胞質(zhì)嚴(yán)重崩潰；降低胃黏膜皺褶高度、黏膜下層厚度、上皮細(xì)胞高度及胃腺厚度(付世建等，1999；Huretal.，2006；Zengetal.，2012；Sakyietal.，2020；Fanetal.，2021)。另外，饑餓會(huì)引起魚(yú)類生理顯著變化，造成肝臟氧化應(yīng)激，同時(shí)腸道中關(guān)于超氧化物歧化酶和過(guò)氧化氫酶含量發(fā)生變化導(dǎo)致組織損傷(Bhattacharyyaetal.，2014；Peteretal.，2020)，為了應(yīng)對(duì)饑餓環(huán)境和產(chǎn)生的氧化應(yīng)激，魚(yú)類細(xì)胞會(huì)通過(guò)自噬產(chǎn)生氨基酸、核苷酸和脂肪酸產(chǎn)物來(lái)維持正常的代謝，從而適應(yīng)饑餓脅迫(Talloczyetal.，2002)。在腸道微生物方面，饑餓會(huì)導(dǎo)致魚(yú)類腸道中微生物菌群大量死亡(Kohletal.，2014)，進(jìn)而影響消化酶的活性(Lietal.，2019)，也會(huì)導(dǎo)致免疫屏障受到影響(Alonsoetal.，2019)，這種現(xiàn)象在大西洋鮭Salmosalar(Martinetal.，2010)、草魚(yú)Ctenopharyngodonidellus(Tranetal.，2018)、虹鱒Oncorhynchusmykiss(Soltanian & Gholamhosseini，2019)和雜交石斑Epinephelusfuscoguttatus×E.lanceolatus(Liuetal.，2020)中都存在。

劍尾魚(yú)Xiphophorushelleri是一種小型、強(qiáng)壯、易喂養(yǎng)的卵胎生花鳉科Cyprinodontidae魚(yú)類，具備繁殖世代時(shí)間短(1～1.5個(gè)月)、雌雄易區(qū)分、對(duì)環(huán)境變化敏感、性情溫順、顏色靚麗、便于在實(shí)驗(yàn)室條件下進(jìn)行純化培養(yǎng)等特點(diǎn)，已被用作水生實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的模式生物，具有廣闊的發(fā)展前景，近年來(lái)養(yǎng)殖規(guī)模逐漸擴(kuò)大(吳淑勤等，2005；Han & Fang，2010)。饑餓脅迫過(guò)去已被研究，但是隨著組學(xué)技術(shù)的發(fā)展，其對(duì)魚(yú)類的影響有待進(jìn)一步發(fā)掘，代謝組學(xué)技術(shù)可以檢測(cè)饑餓對(duì)魚(yú)類肝臟中小分子代謝物的影響，隨后利用生物信息學(xué)探討?zhàn)囸I對(duì)魚(yú)類肝臟的影響。本實(shí)驗(yàn)旨在通過(guò)代謝組學(xué)技術(shù)，研究劍尾魚(yú)在面對(duì)饑餓脅迫時(shí)，肝臟中受影響較大的代謝物與相關(guān)的代謝通路，闡明饑餓脅迫對(duì)魚(yú)類肝臟代謝物層面的影響，為了解饑餓脅迫對(duì)魚(yú)類肝臟代謝組的影響及其小分子代謝物調(diào)節(jié)機(jī)制提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)儀器與試劑

實(shí)驗(yàn)儀器：Triple TOF 5600+質(zhì)譜儀(AB SCIEX)，色譜：Agilent 1290 Infinity LC超高壓液相色譜儀(Agilent)。色譜柱：Waters，ACQUITY UPLC BEH Amide 1.7 μm，2.1 mm×100 mm column。

試劑：乙腈(Merck，1499230-935)、乙酸銨(Sigma，70221)、甲醇(Merck，144282)、氨水(Merck，105426)，所有實(shí)驗(yàn)試劑均為分析級(jí)或HPLC級(jí)。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

本次實(shí)驗(yàn)動(dòng)物為雄性紅劍尾魚(yú)，購(gòu)于陜西紅劍尾魚(yú)養(yǎng)殖基地。選擇5月齡、規(guī)格相近、體表無(wú)傷痕、鱗片完整、體色鮮艷且體質(zhì)健壯的紅劍尾魚(yú)作為實(shí)驗(yàn)魚(yú)。在正式實(shí)驗(yàn)前，將劍尾魚(yú)進(jìn)行為期2周的馴化，水溫(26±0.5)℃，溶解氧≥5 mg·L-1，24 h曝氣，14 h光/10 h暗周期，每天投喂2次(09∶00和 17∶00)，投喂寸金牌商品飼料，每天投喂量為魚(yú)體質(zhì)量的3%，每3天更換1次水。

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

2周馴化結(jié)束后，將體長(zhǎng)和體質(zhì)量相近的劍尾魚(yú)隨機(jī)分為對(duì)照組和饑餓組，每組24尾，稱量初始體質(zhì)量。每3天換1次水，為避免個(gè)體間攻擊行為的影響，每條魚(yú)單獨(dú)飼養(yǎng)，每個(gè)養(yǎng)殖單元長(zhǎng)10 cm×寬15 cm×高10 cm，水深8 cm(圖1)。對(duì)照組在實(shí)驗(yàn)期間正常喂養(yǎng)，投喂量和投喂時(shí)間與馴化期相同，饑餓組在實(shí)驗(yàn)期間連續(xù)14 d禁食。實(shí)驗(yàn)環(huán)境水溫、光周期等環(huán)境與馴化環(huán)境相同。14 d后，再次稱量實(shí)驗(yàn)魚(yú)的體質(zhì)量，然后使用MS-222魚(yú)用麻醉劑麻醉，在超凈工作臺(tái)內(nèi)用蒸餾水沖洗魚(yú)體 3次后置于冰上解剖，取肝臟置于液氮中保存，實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，組內(nèi)隨機(jī)選取4尾魚(yú)的肝臟樣品混合為1個(gè)肝臟樣本，每組6個(gè)肝臟樣本。

1.4 代謝物提取與液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(LC-MS)分析

取肝臟樣本在液氮中研磨，每樣稱取100 mg，加入200 μL預(yù)冷水和800 μL預(yù)冷的甲醛/乙腈(1∶1，v/v)，混勻，冰浴中超聲60 min，-20 ℃孵育1 h沉淀蛋白，16 000 r·min-14 ℃離心20 min，取上清。上清在高速真空濃縮離心機(jī)揮發(fā)干。質(zhì)譜檢測(cè)時(shí)加入100 μL乙腈-水溶液(1∶1，v/v)復(fù)溶，14 000 r·min-14 ℃離心15 min，取上清液進(jìn)樣分析。

整個(gè)分析過(guò)程中樣品置于4 ℃自動(dòng)進(jìn)樣器中，樣品采用Agilent 1290 Infinity LC超高效液相色譜系統(tǒng)(UHPLC)使用HILIC色譜柱進(jìn)行分離，進(jìn)樣量為5 μL，柱溫為25 ℃，流速0.3 mL·min-1；色譜流動(dòng)相A：水+25 mmol·L-1乙酸銨+25 mmol·L-1氨水，B：乙腈；色譜梯度洗脫程序如下：0～0.5 min，95%乙腈；0.5～7 min，乙腈從95%線性變化至65%；7～9 min，乙腈從65%線性變化至40%；9～10 min，乙腈維持在40%；10～11.1 min，乙腈從40%線性變化至95%；11.1～16 min，乙腈維持在95%。樣本隊(duì)列中插入QC樣品，用于監(jiān)測(cè)和評(píng)價(jià)系統(tǒng)的穩(wěn)定性及實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)的可靠性。每例樣品分別采用電噴霧電離(ESI)進(jìn)行正離子和負(fù)離子模式檢測(cè)。樣品經(jīng)UPLC分離后用Triple-TOF 5600質(zhì)譜儀(AB SCIEX)進(jìn)行質(zhì)譜分析。

1.5 數(shù)據(jù)預(yù)處理與代謝物識(shí)別

原始數(shù)據(jù)經(jīng)Abf Converter轉(zhuǎn)換成abf格式，然后采用MSDIAL程序中的XCMS進(jìn)行峰對(duì)齊、保留時(shí)間校正和提取峰面積。代謝物結(jié)構(gòu)鑒定采用精確質(zhì)量數(shù)匹配(<25 ppm)和二級(jí)譜圖匹配的方式，檢索MassBank公共數(shù)據(jù)庫(kù)。對(duì)提取得到的數(shù)據(jù)，刪除組內(nèi)缺失值>50%的離子峰，整合正負(fù)離子峰并應(yīng)用SIMCA-P14.1進(jìn)行模式識(shí)別，數(shù)據(jù)經(jīng)歸一化預(yù)處理后，進(jìn)行多維統(tǒng)計(jì)分析，包括無(wú)監(jiān)督主成分分析(PCA)和正交偏最小二乘法判別分析(OPLS-DA)。

2 結(jié)果

2.1 饑餓前后劍尾魚(yú)體質(zhì)量變化

重復(fù)測(cè)量方差分析結(jié)果表明，實(shí)驗(yàn)前后對(duì)照組體質(zhì)量的差異極顯著(F1，10=321.448，P<0.001)；實(shí)驗(yàn)前后饑餓組體質(zhì)量的差異極顯著(F1，11=490.797，P<0.001)；實(shí)驗(yàn)后2組之間的差異極顯著(F1，10=843.779，P<0.001)(圖2)。

2.2 樣本原始數(shù)據(jù)處理與主成分分析

PCA分析結(jié)果顯示，對(duì)照組與饑餓組在空間中均完全分開(kāi)，說(shuō)明在代謝水平上可以發(fā)現(xiàn)饑餓對(duì)肝臟代謝物的代謝模式產(chǎn)生了影響(圖3:a)。對(duì)照組與饑餓組之間的OPLS-DA分析結(jié)果顯示，OPLS-DA的具體模型參數(shù)為R2=0.945，Q2=0.735，R2、Q2>0.5表明模型穩(wěn)定可靠，未發(fā)生過(guò)擬合現(xiàn)象(圖3:b)，表明2組之間的代謝物具有明顯差異，可進(jìn)行下一步分析。實(shí)驗(yàn)中所有數(shù)據(jù)均處于95%置信區(qū)間內(nèi)。

2.3 差異代謝物的篩選

利用LC-MS分析對(duì)照組與饑餓組樣品在正離子和負(fù)離子模式下的代謝物組成，共采集到 13 842個(gè)代謝峰，其中正離子模式采集到10 317個(gè)，負(fù)離子模式采集到3 525個(gè)，基于OPLS-DA模型中的VIP值進(jìn)行差異代謝物的篩選，選取VIP>1的代謝物作為差異的代謝物，共篩選出 5 558種差異代謝物，3 119種上調(diào)，2 439種下調(diào)，通過(guò)單變量分析方法繪制2組肝臟樣本間差異代謝物的火山圖(圖4)，隨后選擇FC>2或FC<0.5，且P<0.05作為篩選標(biāo)準(zhǔn)選出具有明顯差異的代謝物，共篩選出103種代謝物擁有具體的代謝通路，在此基礎(chǔ)上構(gòu)建差異代謝物并進(jìn)行聚類分析(圖5)，結(jié)果表明，共有40種代謝物表達(dá)上調(diào)，63種代謝物表達(dá)下調(diào)。

2.4 差異代謝物的代謝通路分析

為了確定受到饑餓脅迫干擾的生物途徑，使用KEGG數(shù)據(jù)庫(kù)(https://www.kegg.jp/)將饑餓組與對(duì)照組比較后得到的顯著性差異代謝物進(jìn)行KEGG代謝通路富集(圖6)。挑選10條顯著性差異代謝物富集最多的代謝通路制成氣泡圖，分別是?；撬岷蛠喤；撬岽x(3種代謝物)、淀粉和蔗糖代謝(6種代謝物)、嘌呤代謝(5種代謝物)、半乳糖代謝(6種代謝物)、FoxO信號(hào)通路(2種代謝物)、不飽和脂肪酸的生物合成(5種代謝物)、氨基酸的生物合成(6種代謝物)、氨基?；?核糖核酸的生物合成(4種代謝物)、氨基糖和核苷酸糖代謝(6種代謝物)和ABC轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白(13種代謝物)。

2.5 顯著性差異代謝物與代謝通路

根據(jù)參與富集排名前10的代謝通路的代謝物篩選出8種代謝物：D-甘露糖、α-D-半乳糖、蔗糖、亞油酸、L-精氨酸、D-葡萄糖、?；撬岷兔撗跫≤眨謩e參與8條代謝通路(表1)。

表1 饑餓后劍尾魚(yú)肝臟中的顯著性差異代謝物

2.6 代謝通路分析

在篩選出具體的顯著性差異代謝物之后，通過(guò)KEGG網(wǎng)站代謝通路中物質(zhì)的變化來(lái)尋找代謝通路間的關(guān)系，可以看出饑餓后的劍尾魚(yú)肝臟半乳糖代謝中半乳糖表達(dá)下調(diào)后影響了氨基糖和核苷酸糖代謝中的α-D-半乳糖，進(jìn)而導(dǎo)致UDP-D-葡萄糖表達(dá)的下調(diào)影響到淀粉和蔗糖代謝(圖7)。

3 討論

本實(shí)驗(yàn)選擇劍尾魚(yú)作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物，通過(guò)代謝組學(xué)技術(shù)研究饑餓對(duì)其肝臟代謝的影響。因?yàn)榭梢宰R(shí)別特定代謝通路的紊亂與否，代謝組學(xué)方法比傳統(tǒng)參數(shù)(如魚(yú)類健康的生理參數(shù)或生化標(biāo)記)更敏感，反應(yīng)比傳統(tǒng)生物標(biāo)記更具生物學(xué)意義(Longetal.，2020)。從篩選出的重要差異代謝物和KEGG通路富集分析的結(jié)果看，饑餓脅迫影響了劍尾魚(yú)肝臟中的FoxO通路、糖代謝、脂肪代謝和氨基酸代謝。

劍尾魚(yú)遭受饑餓脅迫后，肝臟中糖類物質(zhì)如D-甘露糖、α-D-半乳糖、D-葡萄糖以及蔗糖顯著下調(diào)，這個(gè)結(jié)果與其他學(xué)者的結(jié)果相同(Jiaoetal.，2020)。此外，在通路富集結(jié)果中發(fā)現(xiàn)饑餓影響了FoxO信號(hào)通路，F(xiàn)oxO信號(hào)通路與多種生物學(xué)過(guò)程有關(guān)，包括細(xì)胞代謝(Halletal.，2000)、免疫和抗氧化應(yīng)激(van Der Heideetal.，2004；Balabanetal.，2005)。在饑餓脅迫下，F(xiàn)oxO對(duì)促進(jìn)糖異生酶的表達(dá)具有關(guān)鍵作用，同時(shí)參與促進(jìn)碳水化合物向脂肪酸的轉(zhuǎn)變，據(jù)此推測(cè)持續(xù)14 d的饑餓過(guò)程中，劍尾魚(yú)依靠肝臟中糖異生提供能量。在氧化應(yīng)激方面FoxO信號(hào)通路可以驅(qū)動(dòng)參與對(duì)抗氧化應(yīng)激的基因的表達(dá)，從而保護(hù)細(xì)胞功能(Grossetal.，2008)，Gao等(2019)在對(duì)斑點(diǎn)叉尾Ictaluruspunctatus的研究表明，F(xiàn)oxO在對(duì)細(xì)菌感染的免疫應(yīng)答中發(fā)揮重要作用。肝臟內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)涉及多種物質(zhì)和細(xì)胞共同調(diào)節(jié)，糖類代謝物D-甘露糖作為免疫蛋白的合成物質(zhì)之一，對(duì)生物體的健康和免疫功能具有重要的意義(van Immerseeletal.，2002；Berge & Wierup，2012；Jenne & Kubes，2013)。饑餓脅迫導(dǎo)致劍尾魚(yú)肝臟中的D-甘露糖表達(dá)極顯著下調(diào)，可能會(huì)導(dǎo)致機(jī)體對(duì)環(huán)境中其他的脅迫如炎癥、受傷、免疫以及對(duì)不良病菌的適應(yīng)性和抵抗性降低，其中肝臟炎癥和免疫被視為一個(gè)高度復(fù)雜的動(dòng)態(tài)反應(yīng)網(wǎng)絡(luò)，營(yíng)養(yǎng)代謝物的變化會(huì)影響適應(yīng)性免疫(Humphrey & Klasing，2004；Robinsonetal.，2016)。有研究表明，在面對(duì)環(huán)境脅迫導(dǎo)致的免疫力降低時(shí)，魚(yú)類會(huì)增加自身的免疫物質(zhì)來(lái)應(yīng)對(duì)環(huán)境脅迫，如鯽魚(yú)Carassiusauratus在面對(duì)重金屬錳污染時(shí)，會(huì)增加體內(nèi)的皮質(zhì)醇來(lái)增加自身的適應(yīng)性(Alikoetal.，2018)，類似的情況在大西洋鮭Salmosalar中也有出現(xiàn)(Fastetal.，2008)。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，饑餓后的劍尾魚(yú)肝臟中亞油酸的表達(dá)顯著上調(diào)。推測(cè)可能是饑餓脅迫發(fā)生后，魚(yú)體肝臟細(xì)胞通過(guò)自噬來(lái)獲取營(yíng)養(yǎng)，而亞油酸是組成細(xì)胞膜磷脂的重要成分(馬宏峰，2007)，膜的分解最終導(dǎo)致了亞油酸表達(dá)上調(diào)。饑餓后亞油酸在肝臟中的顯著上調(diào)是為了彌補(bǔ)與免疫相關(guān)的糖類物質(zhì)的顯著下調(diào)，維持機(jī)體的正常免疫與抗炎癥系統(tǒng)，但饑餓脅迫后魚(yú)類的免疫能力是否下降仍需要進(jìn)一步驗(yàn)證。

饑餓脅迫后，劍尾魚(yú)肝臟中的L-精氨酸和牛磺酸表達(dá)顯著下調(diào)。精氨酸作為魚(yú)類機(jī)體細(xì)胞內(nèi)功能最多的必需氨基酸之一，其代謝產(chǎn)物在動(dòng)物機(jī)體能量與脂肪代謝具有重要作用，同時(shí)精氨酸可在魚(yú)體內(nèi)生成NO，參與魚(yú)類免疫功能調(diào)節(jié)(萬(wàn)軍利等，2006；韓鳳祿等，2016；王瑩等，2017)。牛磺酸是魚(yú)類生長(zhǎng)發(fā)育必不可少的物質(zhì)(石立冬等，2020)，具有增強(qiáng)免疫力和抗氧化能力(田芊芊等，2016)。劍尾魚(yú)肝臟中精氨酸和?；撬犸@著下調(diào)，可能是經(jīng)過(guò)14 d饑餓脅迫并消耗大量糖類和脂肪之后開(kāi)始消耗氨基酸進(jìn)行供能，這些氨基酸代謝物的下調(diào)和與免疫相關(guān)的糖類下調(diào)均會(huì)影響魚(yú)類的免疫和抗氧化能力，但是亞油酸的上調(diào)說(shuō)明魚(yú)類的免疫調(diào)節(jié)系統(tǒng)并未因?yàn)轲囸I脅迫完全喪失。營(yíng)養(yǎng)和免疫之間的作用是多種多樣的，無(wú)法獲得營(yíng)養(yǎng)會(huì)損害肝臟的保護(hù)性免疫(Humphrey & Klasing，2004)，因此，推測(cè)饑餓脅迫會(huì)損害劍尾魚(yú)肝臟的免疫功能。但仍需要進(jìn)一步通過(guò)免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)觀察肝臟內(nèi)相關(guān)的免疫因子或免疫細(xì)胞的變化來(lái)驗(yàn)證饑餓脅迫對(duì)魚(yú)類的免疫影響。

本實(shí)驗(yàn)采用LC-MS技術(shù)對(duì)饑餓脅迫后的劍尾魚(yú)肝臟代謝物進(jìn)行研究，對(duì)提取的差異代謝物經(jīng)過(guò)KEGG網(wǎng)站分析代謝通路得出，饑餓脅迫主要對(duì)劍尾魚(yú)肝臟的糖代謝、脂代謝、氨基酸代謝與FoxO信號(hào)通路造成影響，在這些代謝通路中，共篩選出8種具有顯著差異的重要代謝物：D-甘露糖、α-D-半乳糖、蔗糖、亞油酸、L-精氨酸、D-葡萄糖、?；撬岷兔撗跫≤?。這些差異代謝物的生理功能顯示，饑餓脅迫會(huì)對(duì)魚(yú)類的免疫、抗炎癥以及受傷后機(jī)體的修復(fù)能力產(chǎn)生影響。