王 潔,龔國利,閔建紅,李 慧

(陜西科技大學(xué) 食品與生物工程學(xué)院，陜西 西安 710021)

0 引言

蠟樣芽孢桿菌(Bacilluscereus)是一種常見的食源性致病菌，其自身可以產(chǎn)生腹瀉毒素和嘔吐毒素(Cereulide)，誤食B.cereus污染的食品后，人們會(huì)出現(xiàn)嘔吐型或腹瀉型的食物中毒癥狀[1-3].在我國生物性食物中毒事件中，由B.cereus引起的細(xì)菌性食物中毒事件發(fā)生率比較高，僅在沙門氏菌(Salmonellaspp)之下，威脅著公共食品安全[4-6].早些年，人們?yōu)榉乐笲.cereus以及各種食源性致病菌的污染，將與此相關(guān)的抗生素或半合成抗生素添加到食品中以抑制病原菌生長.但抗生素的濫用使細(xì)菌對其產(chǎn)生了耐藥性，出現(xiàn)了超級細(xì)菌，且對人的身體造成了嚴(yán)重危害.因此，在現(xiàn)階段，尋找一種既能有效預(yù)防病原菌生長又不產(chǎn)生耐藥性的新型抗菌物質(zhì)，已成為眾多研究者關(guān)注的焦點(diǎn).而天然抗菌物質(zhì)因具有抗菌性強(qiáng)和抗菌譜廣等優(yōu)勢，受到越來越多人的關(guān)注[7].黃現(xiàn)青等[8]研究了常見的抗生素和天然活性物質(zhì)對B.cereus的抑制效果，結(jié)果表明天然活性物質(zhì)乳酸鏈球菌素的抑菌效果最好.

青海湖位于我國的西北部,所處環(huán)境復(fù)雜，生態(tài)系統(tǒng)較脆弱，且該區(qū)域土壤具有沙漠化和鹽堿化現(xiàn)象，是研究極端環(huán)境微生物的理想對象[9-11].本研究以青海湖淤泥土壤為實(shí)驗(yàn)樣品，從中篩選分離出一株對蠟樣芽孢桿菌有較強(qiáng)抑制活性的短短芽孢桿菌菌株JH3，并進(jìn)一步測定了該菌株抗菌物質(zhì)對熱、紫外線、pH和蛋白酶的穩(wěn)定性.

1 材料和方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 主要試劑與設(shè)備

土壤樣品隨機(jī)取自中國青海湖淤泥土壤，于4 ℃保存.

蛋白胨、牛肉膏、瓊脂粉(北京奧博星生物技術(shù)有限公司)；DNA marker、Taq DNA聚合酶(北京天根生化科技有限公司)；細(xì)菌基因組快速提取試劑盒、胰蛋白酶、胃蛋白酶、木瓜蛋白酶、蛋白酶k(上海捷瑞生物工程有限公司).

DYY-11核酸電泳儀(北京市八一儀器廠)；TGL-16M高速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開發(fā)有限公司)；BIS-910凝膠成像儀(北京東勝創(chuàng)新生物有限公司)；PTC-200TM PCR儀(美國Bio-rad公司).

1.1.2 指示菌與培養(yǎng)基

(1)指示菌：蠟樣芽孢桿菌(B.cereus)、大腸桿菌(Escherichiacoli)、藤黃微球菌(Mirococcusluteus)、金黃色葡萄球菌(Staphylococcusaureus)、耐甲氧西林金黃色葡萄球菌(MRSA)和銅綠假單胞菌(Pseudomonasaeruginosa)，由陜西科技大學(xué)食品與生物工程學(xué)院微生物實(shí)驗(yàn)室提供.

(2)培養(yǎng)基：NA培養(yǎng)基：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，瓊脂15 g/L，pH7.2；NB培養(yǎng)基：牛肉膏5 g/L，蛋白胨10 g/L，NaCl 5 g/L，pH7.2.

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 菌株的分離與純化

取5 g土壤樣品添加到100 mL生理鹽水中后，進(jìn)行10倍梯度稀釋，取稀釋度為10-5、10-6、10-7、10-8的溶液涂布于NA培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h.隨機(jī)挑取菌落特征不同的單菌落劃線分離，挑取單菌落貯存?zhèn)溆?

1.2.2 拮抗菌株的初篩

按照Chahad等[12]的方法，在NB培養(yǎng)基中接入蠟樣芽孢桿菌，37 ℃，200 rpm培養(yǎng)12 h后，將菌體培養(yǎng)液稀釋到1×108cfu/mL，均勻涂布于NA培養(yǎng)基上，再用點(diǎn)種法將分離到的全部菌株點(diǎn)種于NA培養(yǎng)基上.37 ℃培養(yǎng)24 h,測定抑菌活性.

1.2.3 拮抗菌株的復(fù)篩

挑選抑菌性狀穩(wěn)定的單菌落，接種于NB培養(yǎng)基，37 ℃，200 rpm發(fā)酵培養(yǎng)36 h后，4 ℃、11 000 rpm離心15 min，得發(fā)酵上清液.過濾除菌后，采用瓊脂擴(kuò)散法測定其對各指示菌的抑菌活性.選取抑菌活性最顯著且最廣的菌株貯存?zhèn)溆?

1.2.4 形態(tài)學(xué)特征

將復(fù)篩后的菌株接種于NA培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)24 h，觀察菌株的外觀形態(tài)，同時(shí)進(jìn)行革蘭氏染色，并用光學(xué)顯微鏡觀察菌體的細(xì)胞特征.

1.2.5 基于16S rDNA基因的分子生物學(xué)鑒定

目標(biāo)菌株基因組DNA提?。簩⒕杲臃N于NB培養(yǎng)基中搖瓶培養(yǎng)后，取5 mL菌液8 000 rpm離心5 min，收集菌體細(xì)胞，用TE緩沖液重懸，用細(xì)菌基因組試劑盒提取菌株的DNA.后進(jìn)行16S rDNA基因的PCR擴(kuò)增：16S rDNA擴(kuò)增通用引物是：正向引物(27F)：5′-AGTTTGATCMTGGCTCAG-3′；反向引物(1492R)：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′，PCR的反應(yīng)體系：引物F ，0.5μL；引物R ，0.5μL；2×San Taq PCR Mix，10μL；模板DNA ，2μL；dd H2O，7μL；總反應(yīng)體系20μL.擴(kuò)增的各階段條件為：預(yù)變性：94 ℃下處理3 min；變性：94 ℃下處理30 s；退火：60 ℃下處理30 s；延伸：72 ℃下處理1.5 min.30個(gè)循環(huán)(變性-退火-延伸)后，在72 ℃下再延伸5 min.

PCR擴(kuò)增結(jié)束后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，將電泳結(jié)束后的凝膠拍照，觀察PCR產(chǎn)物有無非特異性條帶，以及產(chǎn)物的純度和DNA片段大小，無誤后，將PCR產(chǎn)物送公司(上海生工生物工程有限公司)測定16S rDNA序列.將測得的序列在NCBI上的Gen Bank序列數(shù)據(jù)庫進(jìn)行Blast比對分析，在基因數(shù)據(jù)庫中進(jìn)行同源性搜索比對.

1.2.6 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

找到同源性較高的細(xì)菌后，挑出模式菌株，并下載這些菌株的基因序列，利用MEGA(Ver.6.06)軟件進(jìn)行系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建，進(jìn)而確定此菌株的種屬信息[13-15].

1.2.7 生理生化鑒定

通過硝酸鹽還原、明膠液化、淀粉水解、接觸酶、檸檬酸鹽利用、產(chǎn)硫化氫、葡萄糖發(fā)酵產(chǎn)酸、吲哚和V-P試驗(yàn)，以及5% NaCl下和溫度50 ℃時(shí)菌株生長情況的試驗(yàn)等對菌株進(jìn)行生理生化鑒定.具體方法參照《伯杰細(xì)菌鑒定手冊》[16]和《常見細(xì)菌系統(tǒng)鑒定手冊》[17].

1.2.8 抗菌物質(zhì)的制備

采用飽和硫酸銨沉淀菌株發(fā)酵上清液，得到抗菌粗提物后，再經(jīng)離子交換層析(DEAE-52)與凝膠過濾層析(Sephadex G-100)分離純化，得到抗菌物質(zhì)[18,19].

1.2.9 抗菌物質(zhì)的熱穩(wěn)定性試驗(yàn)

將抗菌物質(zhì)純化物分別在30 ℃、50 ℃、70 ℃、90 ℃和100 ℃水浴中放置20 min，冷卻后，檢測其對蠟樣芽孢桿菌的抑菌活性.

1.2.10 抗菌物質(zhì)的紫外照射敏感性試驗(yàn)

將抗菌物質(zhì)純化物在距離30 W紫外燈30 cm處各照射30、60、90、150、180和240 min后[20]，檢測其對蠟樣芽孢桿菌的抑菌活性.

1.2.11 抗菌物質(zhì)的蛋白酶穩(wěn)定性試驗(yàn)

將抗菌物質(zhì)純化物分別以5 mg/mL的木瓜蛋白酶、胰蛋白酶、蛋白酶k、胃蛋白酶37 ℃處理2 h后，檢測其對蠟樣芽孢桿菌的抑菌活性.

1.2.12 抗菌物質(zhì)的酸堿穩(wěn)定性試驗(yàn)

用1 mol/L HCl和NaOH溶液將抗菌物質(zhì)稀釋液的pH值分別調(diào)到3～11的范圍，靜置一段時(shí)間后，將各個(gè)溶液的pH值調(diào)回中性且保證體積相同，檢測樣品對蠟樣芽孢桿菌的抑菌活性.

2 結(jié)果與討論

2.1 拮抗菌株的分離篩選結(jié)果

從青海湖的淤泥土壤中初步分離到3株抑制蠟樣芽孢桿菌生長的拮抗菌株.用點(diǎn)種法進(jìn)行初篩，發(fā)現(xiàn)a菌株的抑菌活性時(shí)有時(shí)無,不穩(wěn)定,b、c兩菌株抑菌效果較好(圖1).用瓊脂擴(kuò)散法進(jìn)行復(fù)篩發(fā)現(xiàn)，菌株c抑菌活性較菌株b更好(表1)，對大腸桿菌和銅綠假單胞菌的抑菌活性顯著強(qiáng)于b(P<0.01)，且對表中所有指示菌均有較強(qiáng)的抑制作用，抑制蠟樣芽孢桿菌生長的能力最強(qiáng)(圖2).把菌株c作為接下來的實(shí)驗(yàn)用菌，并命名為“JH3”.

圖1 拮抗菌株的篩選及其抑菌活性測定

表1 菌株發(fā)酵液對指示菌的抑菌作用

圖2 菌株JH3發(fā)酵液對蠟樣芽孢桿菌的抑菌效果

2.2 拮抗菌株JH3的鑒定結(jié)果

2.2.1 形態(tài)學(xué)特征

由圖3可知，在NA培養(yǎng)基上生長的菌株JH3形成的單菌落是亮白色，接近圓形，不透明且有光澤，沒有色素產(chǎn)生；通過革蘭氏染色后，菌體細(xì)胞是藍(lán)紫色的，為革蘭氏陽性菌.細(xì)胞呈短桿狀.

(a)菌落形態(tài)

2.2.2 基于16S rDNA基因的分子生物學(xué)鑒定

對菌株JH3的基因進(jìn)行PCR擴(kuò)增后，進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)在1 500 bp附近出現(xiàn)單一的PCR條帶，條帶明亮且清晰，說明PCR擴(kuò)增得到的目的DNA片段純度較高，可送至公司對菌株JH3的16S rDNA進(jìn)行測序.

2.2.3 系統(tǒng)發(fā)育樹的構(gòu)建

將菌株JH3的16S rDNA基因序列(登錄號MF787615.1)和NCBI數(shù)據(jù)庫中已知細(xì)菌比較，發(fā)現(xiàn)菌株JH3的基因序列和短芽孢桿菌屬(Brevibacillus)的短短芽孢桿菌(B.brevis)同源性為100%.以與菌株JH3同源性較高的細(xì)菌的基因序列為基礎(chǔ)，采用MEGA6.06繪制菌株JH3的系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹(圖4).從圖可以看出，和菌株JH3基因序列同源性最高的是短短芽孢桿菌(Brevibacillusbrevisstrsin NBRC100599).按照Wu等[21]的研究，基因序列同源性高于99%的兩株菌，可把它們歸屬為同一種，由此初步確定菌株JH3為短短芽孢桿菌.

圖4 菌株JH3的系統(tǒng)進(jìn)化發(fā)育樹

2.2.4 生理生化鑒定

為進(jìn)一步確定JH3菌株具體的種，用生化試驗(yàn)對其進(jìn)行驗(yàn)證(表2).對照細(xì)菌鑒定手冊，并結(jié)合上述形態(tài)學(xué)觀察、革蘭氏染色、16S rDNA分子生物學(xué)鑒定實(shí)驗(yàn)結(jié)果，最終確定菌株JH3是短芽孢桿菌屬的短短芽孢桿菌.

表2 菌株JH3生理生化鑒定結(jié)果

2.3 抗菌物質(zhì)穩(wěn)定性分析

2.3.1 抗菌物質(zhì)的熱穩(wěn)定性試驗(yàn)

不同溫度處理20 min后，測定抗菌物質(zhì)對蠟樣芽孢桿菌的抑菌活性.在30 ℃～90 ℃之間，與對照組相比，各溫度對抗菌物質(zhì)抑菌活性的影響較??；溫度為100 ℃時(shí)，抑菌活性顯著降低(P<0.05)，是對照組的76.03%(圖5)，說明該抗菌物質(zhì)熱穩(wěn)定性較好.

圖5 溫度對抗菌物質(zhì)抑菌活性的影響

2.3.2 抗菌物質(zhì)的紫外照射敏感性試驗(yàn)

探究該抗菌物質(zhì)的紫外線照射敏感性發(fā)現(xiàn)，在紫外燈下照射30～150 min，與對照組相比，抗菌物質(zhì)的抑菌活性變化很?。徽丈?50～240 min，抑菌活性顯著降低(P<0.05)(圖6)，說明該抗菌物質(zhì)可在150 min內(nèi)耐受紫外線照射.

圖6 紫外線照射對抗菌物質(zhì)抑菌活性的影響

2.3.3 抗菌物質(zhì)的酸堿穩(wěn)定性試驗(yàn)

探究該抗菌物質(zhì)的酸堿穩(wěn)定性發(fā)現(xiàn)，在不同pH(3～11)條件下，抗菌物質(zhì)對蠟樣芽孢桿菌仍有較強(qiáng)的抑菌活性.在pH為3時(shí)，抑菌活性最低，pH在3～5時(shí)，與對照組相比，抑菌活性顯著降低(P<0.05)；當(dāng)pH為6～11時(shí)，與對照組相比，抗菌物質(zhì)的抑菌活性略微下降(圖7)，說明該抗菌物質(zhì)對酸堿具有一定的耐受性.

圖7 pH對抗菌物質(zhì)抑菌活性的影響

2.3.4 抗菌物質(zhì)的蛋白酶穩(wěn)定性試驗(yàn)

研究常見的蛋白酶對抗菌物質(zhì)的穩(wěn)定性影響發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，胰蛋白酶處理后的抗菌物質(zhì)對蠟樣芽孢桿菌的拮抗作用顯著變小(P<0.05).而木瓜蛋白酶、蛋白酶k和胃蛋白酶對抗菌物質(zhì)的穩(wěn)定性影響較小(圖8).

圖8 蛋白酶對抗菌物質(zhì)抑菌活性的影響

3 結(jié)論

本研究從青海湖的淤泥土壤中初步分離到3株抑制蠟樣芽孢桿菌生長的拮抗菌株，將其中一株拮抗效果最好的菌株JH3鑒定為短短芽孢桿菌(B.brevis).對其抗菌物質(zhì)理化性質(zhì)的研究結(jié)果表明，該物質(zhì)有較好的熱穩(wěn)定性，對紫外線照射不敏感，對酸堿有一定的耐受性.胰蛋白酶對該抗菌物質(zhì)的穩(wěn)定性影響較大，而木瓜蛋白酶、蛋白酶k和胃蛋白酶影響較小.本實(shí)驗(yàn)可為該抗菌物質(zhì)后續(xù)在食品工業(yè)中的應(yīng)用研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)和參考.