羅浩銘，白欽欽，王金晶，賈軍，馬印東，黃國寶

(1.濰坊醫(yī)學(xué)院研究生院，山東 濰坊 261053； 2.貴州醫(yī)科大學(xué)研究生院，貴陽 550025；3.山東大學(xué)附屬濟南市中心醫(yī)院燒傷整復(fù)外科，濟南 250013)

目前我國糖尿病患者數(shù)量龐大，根據(jù)流行病學(xué)統(tǒng)計，我國18歲及以上人群糖尿病患病率為11.2%[1]，患病人數(shù)約1.14億，居世界首位[2]，且呈逐年上升趨勢。糖尿病足潰瘍是糖尿病的嚴(yán)重并發(fā)癥之一，患病率占糖尿病患者的15%～25%[3]。在非創(chuàng)傷性下肢截肢的患者中約85%患有糖尿病足潰瘍[4]，膝蓋以上截肢患者的術(shù)后死亡率與結(jié)腸癌術(shù)后5年死亡率相同，僅次于肺癌[5]。目前糖尿病足潰瘍的整體治療效果不容樂觀。傳統(tǒng)的治療方法包括控制血糖、預(yù)防感染以及足部潰瘍手術(shù)清創(chuàng)。近年來，大量新型技術(shù)被應(yīng)用于臨床，如生長因子及雙層人工真皮的應(yīng)用、負壓吸引術(shù)、高壓氧療法、超聲輔助清創(chuàng)術(shù)等均取得了較好的療效[6-10]。因糖尿病足潰瘍發(fā)病機制復(fù)雜多樣，上述方法也存在一定的局限性。近年來，應(yīng)激耐受多系分化細胞(multilineage differentiating stress enduring cell，Muse細胞)的發(fā)現(xiàn)為糖尿病足潰瘍等慢性創(chuàng)面的診療提供了新思路。Muse細胞是存在于間充質(zhì)干細胞中的一類特殊細胞，具有三系分化潛能和多能標(biāo)志物，在組織修復(fù)中具有獨特的優(yōu)勢。Muse細胞在各種動物實驗中均取得了良好的治療效果[11-13]，且避免了傳統(tǒng)手術(shù)的高風(fēng)險，成為治療糖尿病足潰瘍等慢性難愈性創(chuàng)面的研究熱點?，F(xiàn)就Muse細胞治療糖尿病足潰瘍機制的研究進展予以綜述。

1 Muse細胞

1.1Muse細胞的來源與特性 干細胞在現(xiàn)代醫(yī)學(xué)中具有重要地位，可能用于治療各種疑難病癥。但干細胞可能具有致瘤和致畸性，且在缺氧、營養(yǎng)物質(zhì)缺乏、促炎因子和活性氧類的局部微環(huán)境中存活率極低，所以臨床應(yīng)用受限。2010年Kuroda等[14]首次報道了Muse細胞，他們發(fā)現(xiàn)人類間充質(zhì)干細胞中含有一小部分獨特的多能干細胞子集，在體內(nèi)或體外可分化為內(nèi)胚層、中胚層和外胚層3個胚層。該多能干細胞子集在經(jīng)過胰蛋白酶處理8 h或16 h后，直徑>25 μm的大部分細胞表達多能性標(biāo)記(Nanog基因、Oct3/4基因、特異性胚胎抗原-3和蛋白酶活化受體-4等)。Muse細胞不僅可以自我更新分化，而且高分化率比例可達80%～95%。Ogura等[15]通過動物實驗發(fā)現(xiàn)，Muse細胞具有低端粒酶活性，且在體內(nèi)不具有致瘤性，這使其能相對安全的用于臨床。研究表明，多能干細胞僅由Muse細胞產(chǎn)生，它扮演著間充質(zhì)干細胞和多能干細胞的角色，并且成為多能干細胞的理想來源[16-18]。值得注意的是，Muse細胞通過局部或靜脈注入損傷部位后，在壓力、缺氧和營養(yǎng)物質(zhì)缺乏的微環(huán)境中自發(fā)分化為特異性細胞，在體內(nèi)補充缺損丟失的細胞，有助于組織再生和修復(fù)。Muse細胞的分離可能對再生醫(yī)學(xué)和細胞治療產(chǎn)生重要影響。

1.2Muse細胞的分離 Muse細胞位于除基底膜外幾乎所有器官的結(jié)締組織中，可從間充質(zhì)干細胞、脂肪組織、皮膚纖維細胞和骨髓基質(zhì)細胞中分離，占間充質(zhì)干細胞的1%～6%[14-15]。非Muse細胞不能表達特異性胚胎抗原-3，因此特異性胚胎抗原-3可用于Muse細胞的分離。目前Muse細胞的分離多使用胰蛋白酶分離、磁珠分離或流式分選。此外，Heneidi等[19]利用脂肪抽吸的方法，在細胞嚴(yán)重應(yīng)激(長時間蛋白水解酶消化、低溫、血漿缺乏和缺氧)環(huán)境中分離得到脂肪組織來源的Muse細胞，且特異性胚胎抗原-3陽性表達率高達60%[20]。脂肪來源Muse細胞在特異性誘導(dǎo)分化培養(yǎng)基中均能向3種生殖系細胞分化，其中間質(zhì)分化率為82%，內(nèi)胚層分化率為75%，外胚層分化率為78%[19]。與其他幾種方法相比，脂肪抽吸法更快捷、有效，并且在丙烯酸酯/丙烯酰胺聚合物中成簇生長，同時該聚合物能促進未分化狀態(tài)的Muse細胞的黏附、增殖和維持，提高Muse細胞的分離效率[21]。

2 Muse細胞治療糖尿病足潰瘍的機制

目前已有Muse細胞藥物制劑進行臨床藥物試驗，用于觀察治療糖尿病足潰瘍的臨床療效。Muse細胞藥物制劑是通過從活生物體的間充質(zhì)組織或培養(yǎng)的間充質(zhì)干細胞中分離特異性胚胎抗原-3陽性多能干細胞制成的細胞制劑。基于皮膚組織的再生機制，將Muse細胞藥物制劑用于糖尿病足潰瘍受試者足部創(chuàng)面時，Muse細胞可分化為表皮細胞、角質(zhì)形成細胞和成纖維細胞等構(gòu)成皮膚組織的細胞。Muse細胞恢復(fù)組織功能的能力表明其在細胞應(yīng)激和急性損傷有關(guān)的細胞機制中有一定的積極作用[22]。

2.1增加低氧微環(huán)境中生長因子的分泌 糖尿病足潰瘍的愈合是一個復(fù)雜的生物學(xué)過程，包括一系列交叉級聯(lián)反應(yīng)，如炎癥反應(yīng)、細胞增殖遷移和傷口重塑，且需要各種修復(fù)細胞、生長因子和細胞外基質(zhì)的相互協(xié)調(diào)[23]。生長因子是組織修復(fù)再生的關(guān)鍵分子，目前已經(jīng)發(fā)現(xiàn)了10余種生長因子，涉及并調(diào)節(jié)傷口愈合的各個階段[24]。生長因子具有廣泛的生物學(xué)活性，能刺激中胚層和外胚層中的細胞生長和增殖，從而促進毛細血管和神經(jīng)組織再生，同時其還能刺激上皮細胞和內(nèi)皮細胞增殖，以及促進潰瘍?nèi)庋拷M織增生[25]。糖尿病足潰瘍由于血管病變，長期處于低灌注狀態(tài)而導(dǎo)致組織嚴(yán)重缺氧。生長因子在組織修復(fù)中起重要作用，但在缺血缺氧的潰瘍創(chuàng)面中含量較低。從糖尿病足潰瘍組織中分離出的角質(zhì)形成細胞和成纖維細胞增殖潛能較低，且生長因子水平低于正常組織[26]。Bauer等[11]研究發(fā)現(xiàn)在干細胞治療肢端缺血過程中，僅有極少部分干細胞能夠遷移至缺血性創(chuàng)面，這部分干細胞極有可能是Muse細胞。有動物實驗將鏈脲佐菌素注射于小鼠腹腔內(nèi)破壞胰島β細胞，制作糖尿病小鼠模型。小鼠血糖達標(biāo)后，在背部用打孔器打孔并將Muse細胞注射在傷口周圍的四個點，此后連續(xù)記錄傷口的愈合情況。結(jié)果顯示，在相同氧含量下Muse細胞組的傷口愈合時間短于對照組，在低氧環(huán)境(1% O2)中表皮生長因子、血小板源性生長因子、神經(jīng)生長因子、干細胞生長因子、堿性成纖維細胞生長因子和轉(zhuǎn)化生長因子-β表達上調(diào)，表明血小板源性生長因子、轉(zhuǎn)化生長因子-β和堿性成纖維細胞生長因子參與傷口愈合的初始凝結(jié)階段[27]。同時，轉(zhuǎn)化生長因子和堿性成纖維細胞生長因子對干細胞的增殖有促進作用，這形成了一個良性循環(huán)，可更好地促進傷口愈合。Muse細胞促進傷口愈合的機制尚待進一步闡明，在低氧條件下分泌大量生長因子可能是其加速皮膚修復(fù)過程的重要原因之一。

2.2促進上皮和肉芽組織生成 在糖尿病足潰瘍的修復(fù)過程中，成纖維細胞遷移至創(chuàng)面，與創(chuàng)面新生的毛細血管形成肉芽組織來修補缺失的組織。同時，角質(zhì)形成細胞和成纖維細胞從創(chuàng)面邊緣通過遷移、增殖和分化三個階段逐步封閉創(chuàng)面。Muse細胞可在肉芽組織生成和再上皮化中發(fā)揮獨特優(yōu)勢。Rogers等[13]將骨髓源性干細胞應(yīng)用于3例糖尿病足潰瘍患者的足部創(chuàng)面，13 d后所有患者創(chuàng)面均長出了肉芽組織，再配合使用皮膚移植物，傷口愈合時間明顯縮短。Muse細胞在整合到糖尿病小鼠的缺損皮膚后，可分化為真皮成纖維細胞和毛細血管，在骨形態(tài)發(fā)生蛋白4因子的作用下還能分化為角質(zhì)形成細胞，從而修復(fù)皮膚組織[28-29]。Takeshi等[30]用轉(zhuǎn)化生長因子-β2和抗壞血酸將Muse細胞培養(yǎng)2周后，觀察到成纖維細胞標(biāo)志物，如Ⅰ型和Ⅳ型膠原復(fù)合物。Ⅳ型膠原復(fù)合物的端粒酶活性低于人原代成纖維細胞，表明Muse細胞可生成功能性成纖維細胞，而無需任何外部基因轉(zhuǎn)導(dǎo)。Muse細胞還可產(chǎn)生細胞外基質(zhì)蛋白，保護細胞免受有害環(huán)境的侵害，以幫助傷口愈合，并增強新組織的再生。在促進上皮再生的同時，Muse細胞可根據(jù)其抗炎和免疫調(diào)節(jié)功能對上皮細胞發(fā)揮保護作用[31]。深度創(chuàng)面的愈合周期較長，面積大于3 cm×3 cm且傷及皮膚全層的深度創(chuàng)面通常無法自愈，需手術(shù)覆蓋創(chuàng)面。Muse細胞的應(yīng)用則可加快角質(zhì)形成細胞和成纖維細胞的遷移速度，最大限度地減輕患者的痛苦。

2.3抗炎和免疫調(diào)節(jié)作用 糖尿病足潰瘍創(chuàng)面覆蓋大量壞死組織，同時還伴隨著巨噬細胞、淋巴細胞、漿細胞及各種炎癥因子的浸潤。足部破潰創(chuàng)面長期不愈合，炎癥由急性轉(zhuǎn)為慢性，細菌也可從局部定植進展為全身感染。慢性炎癥的發(fā)生大大延長了糖尿病足潰瘍的愈合時間，增加了治療難度和患者風(fēng)險。1型糖尿病是一種自身免疫性疾病，研究發(fā)現(xiàn)，當(dāng)受損的胰島β細胞產(chǎn)生的自身抗原被抗原呈遞細胞識別并激活促炎反應(yīng)時，Muse細胞可調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)從而維持胰島β細胞的功能，使胰島β細胞能夠相對穩(wěn)定地分泌胰島素來控制血糖[32]。Muse細胞可通過激活蛋白激酶A信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路、法尼醇X受體/視黃醇X受體和肝X受體/視黃醇X受體途徑的蛋白質(zhì)受體來調(diào)節(jié)局部炎癥反應(yīng)和免疫反應(yīng)[33]。此外，Muse細胞還能產(chǎn)生多種免疫調(diào)節(jié)的介質(zhì)，包括血紅素加氧酶-1、吲哚胺-2，3-雙加氧酶、基質(zhì)金屬蛋白酶和一氧化氮。T細胞和巨噬細胞分泌的γ干擾素和腫瘤壞死因子-α可加重局部炎癥反應(yīng)，而Muse細胞可通過減少T細胞和巨噬細胞的分泌而減少促炎因子的產(chǎn)生。Perone等[32]在脂多糖刺激實驗中發(fā)現(xiàn)，脂多糖可顯著誘導(dǎo)RAW264.7細胞分泌腫瘤壞死因子-α，然而在Muse細胞培養(yǎng)基中腫瘤壞死因子-α分泌減少。Sun等[31]研究證實，Muse細胞具有分泌抗炎細胞因子(如轉(zhuǎn)化生長因子-β、白細胞介素-10和補體C3)并拮抗其免疫調(diào)節(jié)的功能，還能減少促炎因子(白細胞介素-6、γ干擾素)的分泌[34-35]。另有研究發(fā)現(xiàn)，Muse細胞能直接減輕炎癥反應(yīng)[23]。由此可見，Muse細胞可最大限度地調(diào)節(jié)局部炎癥因子的分泌、抑制炎癥反應(yīng)及調(diào)節(jié)免疫功能，進而加速潰瘍愈合。

2.4定向分化潛能 再生醫(yī)學(xué)的目標(biāo)是通過補充丟失的細胞來恢復(fù)缺損組織結(jié)構(gòu)和功能。糖尿病足潰瘍患者常并發(fā)周圍神經(jīng)血管病變，可發(fā)生皮膚淺表潰瘍、脂肪肌肉壞死、深部潰瘍甚至發(fā)生骨髓炎及全足壞疽而導(dǎo)致截肢。臨床上通常需要對糖尿病足患者進行無創(chuàng)動脈評估(如經(jīng)皮氧分壓測定、踝/肱指數(shù)、階段性多普勒測壓)和下肢感覺的評估來判斷嚴(yán)重程度，足部潰瘍組織缺損的程度也被作為糖尿病足潰瘍分級的標(biāo)準(zhǔn)之一[36]。Muse細胞能較敏感地接收受損組織的信號，并在損傷部位定向分化為相應(yīng)缺損的細胞促進組織修復(fù)。在不同動物疾病模型(如急性重型肝炎、肌肉變性、皮膚潰瘍、肝硬化、腦卒中、白癜風(fēng)和局灶性節(jié)段性腎小球硬化)中，Muse細胞能有效地進入受損組織并分化為特定的細胞，促進組織再生和功能恢復(fù)[37]。如在急性重型肝炎動物模型中，將帶有熒光標(biāo)記的Muse細胞注射到急性重型肝炎小鼠的肝和肌肉中，這些Muse細胞可整合和自發(fā)分化為肝細胞和骨骼肌細胞來修復(fù)缺失組織；同時，可觀察到Muse細胞迅速分化為真皮成纖維細胞、血管內(nèi)皮細胞和角質(zhì)形成細胞等，在微濕微酸等適宜的微環(huán)境下其修復(fù)皮膚組織缺損的效果更佳[17]。Muse細胞作為多能干細胞的理想來源，可在糖尿病足潰瘍處分化為多種缺失細胞以修復(fù)缺損組織。

2.5其他機制 Muse細胞還有多種機制協(xié)同促進糖尿病足潰瘍的愈合。在分子層面上，如通過堿基對切除修復(fù)和核苷酸切除修復(fù)來修復(fù)DNA[38]，在過氧化氫和紫外線照射的環(huán)境下，Muse細胞的衰老和凋亡水平均低于非Muse細胞，這與損傷后DNA損傷修復(fù)系統(tǒng)被激活有關(guān)[29]。在細胞層面上，Muse細胞可修復(fù)成纖維細胞的表觀遺傳特征和細胞功能，使成纖維細胞加速遷移、增生，從而加速潰瘍愈合[39]。在一項糖尿病小鼠實驗中，Muse細胞組小鼠腹腔內(nèi)注射Muse細胞，對照組小鼠腹腔內(nèi)注射等量0.9%氯化鈉溶液，1周后生理鹽水組平均血糖>27.8 mmol/L，而Muse細胞組在觀察的7周內(nèi)血糖水平為11.2～27.8 mmol/L，且Muse細胞組7周內(nèi)體重保持穩(wěn)定[31]。由此可見，全身用藥不僅可修復(fù)局部潰瘍創(chuàng)面，穩(wěn)定胰島素功能，還能保持體重，降低并發(fā)癥的發(fā)生風(fēng)險。

3 小 結(jié)

Muse細胞可通過多種機制實現(xiàn)組織再生，具有較好的應(yīng)用前景。Muse細胞除用于糖尿病足潰瘍等慢性創(chuàng)面的愈合外，還可用于脊髓損傷、燒傷、慢性腎臟病等疾病的治療。盡管大量證據(jù)表明Muse細胞是一種獨特的具有再生潛能的多能非致瘤性干細胞，但臨床研究較少，仍以動物實驗為主。目前用于研究的Muse細胞多源于幾種間充質(zhì)干細胞，這些間充質(zhì)干細胞可以在不同的小鼠動物模型中促進受損組織再生。Muse細胞在組織修復(fù)中具有獨特優(yōu)勢，但應(yīng)用于臨床仍面臨巨大挑戰(zhàn)。如何獲得大量純化的Muse細胞以及提高細胞存活率有待進一步研究，此外，其安全性尚需臨床觀察證實。