王寧，李志堅，劉平，蘇勝

(哈爾濱醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院眼科醫(yī)院三病房，哈爾濱 150001)

糖尿病視網(wǎng)膜病變(diabetic retinopathy，DR)是糖尿病重要的眼部并發(fā)癥。首次診斷出糖尿病時，約15%的患者患有一定程度的DR，且大多數(shù)患者將在20年后出現(xiàn)這種微血管并發(fā)癥。這一并發(fā)癥是勞動年齡(20～65歲)人群視力下降的主要原因。雖然DR不是一種致命性疾病，但會造成患者心理上的困擾、降低日常生活能力，從而顯著影響其生活質(zhì)量[1]。DR的早期診斷可以預(yù)防或延緩視力喪失并減少相關(guān)治療成本，然而DR早期無癥狀，通常發(fā)展到晚期才被發(fā)現(xiàn)，因此治療的有效性大大降低。目前，DR的治療策略旨在控制微血管并發(fā)癥，包括玻璃體內(nèi)注射藥物、激光光凝和玻璃體手術(shù)。但現(xiàn)有的治療方法存在一定的局限性，如治療周期長、費用昂貴以及治療效果欠佳。因此，尋找新的、有效的治療藥物迫在眉睫。

微血管細(xì)胞損害是DR的早期病理改變，而視網(wǎng)膜缺血缺氧引起新生血管出現(xiàn)則是DR增殖期的重要標(biāo)志。在DR的發(fā)病機制中，視網(wǎng)膜毛細(xì)血管細(xì)胞(周細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞)的氧化應(yīng)激——線粒體功能障礙和凋亡早于微血管組織病理學(xué)特征出現(xiàn)[2]，提示早期細(xì)胞凋亡加速可以引發(fā)微血管結(jié)構(gòu)受損。而基質(zhì)金屬蛋白酶(matrix metalloproteinase，MMP)2參與細(xì)胞凋亡及新生血管產(chǎn)生的過程[3]，因此MMP-2可能被高糖環(huán)境激活進(jìn)而參與DR的發(fā)生和發(fā)展?，F(xiàn)就MMP-2在DR中的作用予以綜述，以開發(fā)出新的治療藥物早期干預(yù)DR的發(fā)生或減緩疾病的發(fā)展。

1 MMP-2的生物學(xué)特性

MMP是鋅和鈣依賴性內(nèi)肽酶，根據(jù)MMP是分泌到細(xì)胞外基質(zhì)還是錨定在細(xì)胞表面分為分泌型和膜結(jié)合型兩種。而根據(jù)優(yōu)先選擇的底物MMP可以分為5類：膠原酶(MMP-1、8、13、18)，明膠酶(MMP-2、9)，溶血素(MMP-3、10、11)，膜型MMP(MMP-14、15、16、17、24、25)和其他(MMP-7、12、19、20、21、22、23)[3]。MMP的一級結(jié)構(gòu)各不相同，但它們均與活性部位的鋅離子、信號肽和丙肽共享一個保守的催化結(jié)構(gòu)域。除基質(zhì)溶血素和MMP-23外，大多數(shù)MMP均有一個血紅素樣結(jié)構(gòu)域，該結(jié)構(gòu)域在底物識別、誘導(dǎo)自身活化以及與抑制劑和細(xì)胞表面受體結(jié)合方面發(fā)揮重要作用[4]。MMP的活性受內(nèi)源性組織金屬蛋白酶抑制劑(tissue inhibitor of metalloproteinase，TIMP)調(diào)節(jié)。

MMP-2是分泌到細(xì)胞外基質(zhì)的明膠酶，其分解Ⅳ型膠原，保持基質(zhì)的合成和降解平衡。而在未激活時，MMP-2表達(dá)為無活性的酶原形式(ProMMP-2)。ProMMP-2丙肽中的自由鋅連接硫醇基，以保持酶原的穩(wěn)定，直到通過“半胱氨酸開關(guān)”激活[5]。MMP-2與骨關(guān)節(jié)[6]、心臟、眼等部位疾病和腫瘤的發(fā)生有關(guān)?；贛MP-2的蛋白水解活性，其在細(xì)胞增殖、侵襲和凋亡以及細(xì)胞外基質(zhì)產(chǎn)生與降解的平衡等過程中發(fā)揮重要作用。此外，活化的MMP-2還可以通過促進(jìn)新生血管的形成和調(diào)節(jié)細(xì)胞間黏附等過程促進(jìn)腫瘤的侵襲和轉(zhuǎn)移[7]。Wang等[8]發(fā)現(xiàn)，主動脈瓣二瓣化患者的血漿MMP-2表達(dá)水平異常升高，其破壞包括彈性纖維和膠原纖維在內(nèi)的細(xì)胞外基質(zhì)各種成分，且升主動脈內(nèi)皮細(xì)胞凋亡亦增多，導(dǎo)致升主動脈體積增大和彈性功能受損，最終導(dǎo)致動脈重構(gòu)。同時，MMP-2還能使老年主動脈瓣細(xì)胞凋亡明顯增多，分解明膠活性增強，降解細(xì)胞外基質(zhì)和基膜成分，降解產(chǎn)物的聚集使得瓣膜增厚，鈣鹽易于沉積。另有研究顯示，MMP-2的激活參與了DR的發(fā)病[9]。

2 MMP-2參與DR發(fā)生發(fā)展的調(diào)控機制

DR的進(jìn)展與視網(wǎng)膜微脈管系統(tǒng)異常有關(guān)，包括血視網(wǎng)膜屏障通透性增加，血管內(nèi)皮細(xì)胞和周細(xì)胞丟失，血管基膜增厚，毛細(xì)血管閉塞，視網(wǎng)膜神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)異常增生以及新生血管生成[1]。MMP-2在DR的發(fā)展中起雙重作用。在早期階段(新生血管發(fā)生之前)，MMP可能具有細(xì)胞內(nèi)作用，它們促進(jìn)視網(wǎng)膜毛細(xì)血管細(xì)胞凋亡，導(dǎo)致周細(xì)胞和內(nèi)皮細(xì)胞喪失，這是早期DR的特征[10-11]。然而在疾病后期，MMP可能起到細(xì)胞外蛋白酶的作用，從而促進(jìn)新生血管在增殖期DR(proliferative diabetic retinopathy，PDR)中的發(fā)展[12]。

2.1早期介導(dǎo)線粒體損傷-細(xì)胞凋亡 在DR發(fā)病過程中，氧化應(yīng)激引起的線粒體活性氧類(reactive oxygen species，ROS)是調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡的活性介質(zhì)[12-13]。在生理條件下，以活性氮、ROS、羥基自由基和過氧化氫為主的自由基產(chǎn)生是正常的。事實上，中低水平的自由基是生理活動所必需，因為它們作為氧化還原信號的信使，促進(jìn)細(xì)胞代謝、增殖、分化、免疫系統(tǒng)調(diào)節(jié)和血管重構(gòu)。正常生理狀態(tài)下，細(xì)胞使用酶和非酶抗氧化防御系統(tǒng)維持它們的正常水平。然而，過量ROS擾亂氧化還原穩(wěn)態(tài)會引起氧化應(yīng)激，從而破壞蛋白質(zhì)、脂質(zhì)、糖類和核酸等生物大分子[1]。臨床和試驗研究已證實，糖尿病患者的MMP-2表達(dá)增加[14]，MMP-2在DR發(fā)病過程中發(fā)揮重要作用，而MMP-2的激活受到超氧化物的控制[15]。在高糖培養(yǎng)視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞的實驗中，學(xué)者發(fā)現(xiàn)MMP-2明膠酶活性較正常葡萄糖濃度培養(yǎng)的細(xì)胞升高30%～40%；MMP-2的細(xì)胞膜激活子膜型基質(zhì)金屬蛋白酶1(membrane type 1 matrix metalloproteinase，MT1-MMP)基因表達(dá)增加25%，而細(xì)胞內(nèi)抑制子TIMP-2下調(diào)70%[11]。通過轉(zhuǎn)染MMP-2小干擾RNA，可以明顯改善高糖引起的線粒體超氧化物增多以及線粒體腫脹[11]。線粒體是細(xì)胞能量的主要來源，其主要作用是產(chǎn)生ATP、控制細(xì)胞代謝及調(diào)節(jié)細(xì)胞凋亡，故線粒體功能障礙嚴(yán)重影響細(xì)胞穩(wěn)態(tài)。因此，視網(wǎng)膜毛細(xì)血管細(xì)胞的線粒體功能障礙可以激活細(xì)胞凋亡通路，從而在DR的發(fā)病機制中發(fā)揮重要作用[14]。

熱激蛋白(heat shock protein，HSP)60是一種線粒體蛋白，其在促進(jìn)蛋白質(zhì)折疊和維持線粒體完整性方面發(fā)揮重要作用，如在成年小鼠心肌細(xì)胞中HSP60的缺失導(dǎo)致心力衰竭，并顯著干擾線粒體蛋白穩(wěn)態(tài)和線粒體功能；在血管平滑肌細(xì)胞中可以觀察到HSP60活化激活，阻止細(xì)胞凋亡并促進(jìn)受損血管的新內(nèi)膜增厚[16]。在應(yīng)激狀態(tài)下，HSP60在胞質(zhì)中累積[17]。在高糖條件下，視網(wǎng)膜HSP60在線粒體內(nèi)的積累顯著減少，在細(xì)胞質(zhì)內(nèi)積累顯著增加，HSP60與MMP-2之間的相互作用增加。同時，高糖環(huán)境亦增加了視網(wǎng)膜線粒體促凋亡基因Bcl-2相關(guān)X蛋白(Bcl-2 associated X protein，Bax)的表達(dá)[11-12]。此外，HSP60還可與HSP家族的另一成員HSP70相互作用[18]，這與Bax的構(gòu)象變化和線粒體釋放細(xì)胞色素C的調(diào)節(jié)有關(guān)[19]。Bax和細(xì)胞色素C在線粒體上的轉(zhuǎn)移受MMP-2與HSP60相互作用的控制，進(jìn)一步證實了HSP60在線粒體損傷中的作用。間隙連接蛋白(connexin，Cx)43是Cx中的一員，有助于細(xì)胞間的通訊和離子的轉(zhuǎn)移，在糖尿病患者的視網(wǎng)膜中表達(dá)下調(diào)，且MMP-2與Cx43之間的相互作用減弱[14]。在正常大鼠玻璃體內(nèi)注射MMP-2后，視網(wǎng)膜線粒體被破壞，線粒體中的HSP60和Cx43水平降低，同時毛細(xì)血管細(xì)胞凋亡增加[14]。因此高血糖激活線粒體中的MMP-2，繼而可能通過調(diào)節(jié)HSP60和Cx43破壞線粒體的完整性，致線粒體膜電位丟失、運輸通道受損，Bax進(jìn)入線粒體，釋放細(xì)胞色素C，激活細(xì)胞凋亡機制，從而使視網(wǎng)膜毛細(xì)血管細(xì)胞凋亡加速，進(jìn)而導(dǎo)致微血管通透性增加、滲漏等一系列病理過程。

此外，視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞中葡萄糖誘導(dǎo)的聚腺苷二磷酸核糖聚合酶[poly-(ADP-ribose) polymerase，PARP]激活也受MMP-2的調(diào)控。MMP-2的激活可裂解細(xì)胞核PARP[20]，且由于細(xì)胞核與線粒體之間存在明顯的串?dāng)_，PARP的裂解可通過線粒體途徑，即通過線粒體釋放凋亡誘導(dǎo)因子引起細(xì)胞凋亡，最終促進(jìn)細(xì)胞色素C的釋放[21-22]。Mohammad和Kowluru[11]的體內(nèi)試驗表明，通過過表達(dá)線粒體超氧化物歧化酶，調(diào)節(jié)糖尿病患者視網(wǎng)膜中線粒體超氧化物的積累，也可以抑制MMP-2的活性及其調(diào)節(jié)劑表達(dá)水平升高，且此結(jié)果與體外實驗結(jié)果一致。

2.2增殖期促進(jìn)新生血管產(chǎn)生 在DR發(fā)展的晚期，隨著毛細(xì)血管基膜的增厚和周細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞的丟失，開始出現(xiàn)新生血管和側(cè)支血管，這是PDR的顯著特征。缺氧時，新生血管通常起源于視網(wǎng)膜循環(huán)的靜脈側(cè)，最初在視盤上可見細(xì)小的血管簇。這些新血管在玻璃體中三維生長。由于這些新血管易碎，容易出血，玻璃體內(nèi)可見小出血。當(dāng)出現(xiàn)明顯出血和黃斑模糊時，會突然發(fā)生嚴(yán)重的視力喪失。當(dāng)新生血管成熟時，結(jié)締組織發(fā)育，纖維化(瘢痕)使玻璃體對視網(wǎng)膜產(chǎn)生牽引力，這可能導(dǎo)致牽引力性視網(wǎng)膜脫離[23]。

MMP-2有助于血管生成，并涉及多種機制。如MMP降解毛細(xì)血管基膜，這是內(nèi)皮細(xì)胞穿透內(nèi)皮下基質(zhì)和形成新管腔的必要條件；血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)被認(rèn)為是DR發(fā)展的主要生長因子之一[24]，維持視網(wǎng)膜細(xì)胞的結(jié)構(gòu)和功能穩(wěn)態(tài)依賴于VEGF的正常表達(dá)，但在缺氧和高血糖等病理因素的作用下，其過表達(dá)可導(dǎo)致血管內(nèi)皮通透性增加，凋亡蛋白的抑制作用減弱，血管穩(wěn)態(tài)的破壞以及視網(wǎng)膜新生血管的形成[25]。MMP是VEGF介導(dǎo)的細(xì)胞增殖和新血管形成的活躍分子[26]，VEGF能夠誘導(dǎo)MMP表達(dá)并促進(jìn)視網(wǎng)膜新血管形成[25]。同時，MMP還促進(jìn)了結(jié)合VEGF的組織可用性[23]。研究顯示，PDR患者視網(wǎng)膜新生血管膜MMP-2活性升高[27]。此外，PDR患者存在激活的ProMMP-2，纖維血管組織中ProMMP-2的激活被認(rèn)為是其與MT1-MMP和TIMP-2的相互作用介導(dǎo)[28]。

細(xì)胞外基質(zhì)蛋白水解被認(rèn)為是病理性血管生成所必需的最早和最持久的活動之一。MMP-2(明膠酶A)和MMP-9(明膠酶B)在細(xì)胞外基質(zhì)降解中起重要作用，是新生血管從視網(wǎng)膜逃逸并侵入玻璃體腔的必要步驟，是PDR的標(biāo)志。MMP-2在神經(jīng)節(jié)細(xì)胞層、內(nèi)叢狀層、內(nèi)核層和突破內(nèi)界膜的新生血管中均有表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，PDR組患者房水、玻璃體和血漿中的MMP-2水平顯著升高，由此推測MMP-2可能參與調(diào)節(jié)PDR患者視網(wǎng)膜血管生成過程[29]。

缺氧性米勒細(xì)胞分泌的VEGF增加了血管內(nèi)皮細(xì)胞MMP-2的表達(dá)及活性，從而促進(jìn)PDR視網(wǎng)膜新生血管形成。Rodrigues等[29]研究發(fā)現(xiàn)：缺氧誘導(dǎo)因子1α在視網(wǎng)膜血管內(nèi)皮細(xì)胞中的表達(dá)增加可以直接促進(jìn)MMP-2的表達(dá)；缺氧誘導(dǎo)因子1α在米勒細(xì)胞中表達(dá)增加可以誘導(dǎo)VEGF分泌，進(jìn)而引起鄰近內(nèi)皮細(xì)胞中MMP-2表達(dá)的增加和活性提高；缺氧誘導(dǎo)的內(nèi)皮細(xì)胞中MMP-2的表達(dá)可通過TIMP-2的上調(diào)來平衡，而VEGF誘導(dǎo)的MMP-2表達(dá)不能通過TIMP-2水平的升高來平衡。低氧環(huán)境中米勒細(xì)胞分泌的VEGF和鄰近內(nèi)皮細(xì)胞在視網(wǎng)膜新生血管的MMP-2調(diào)控中存在復(fù)雜的相互作用，并確定MMP-2是治療PDR的靶標(biāo)[30]。因此，VEGF處理內(nèi)皮細(xì)胞后，MMP-2活性明顯升高，從而促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞端部MMP-2的表達(dá)。值得注意的是，TIMP-2在MT1-MMP激活MMP-2中也發(fā)揮了一定作用[31]。此外，MT1-MMP本身也是一種膠原酶，其在PDR中可能獨立于MMP-2在纖維血管增殖的發(fā)展中發(fā)揮直接作用[32]。

以上研究結(jié)果表明，缺氧誘導(dǎo)因子的穩(wěn)定對于促進(jìn)缺氧內(nèi)皮細(xì)胞中MMP-2的表達(dá)是必要和充分的。而MMP-2的表達(dá)是由米勒細(xì)胞分泌因子誘導(dǎo)。研究顯示，采用缺氧永生化人米勒細(xì)胞的條件培養(yǎng)液處理永生化人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞后，其MMP-2信使RNA水平顯著高于正常永生化人米勒細(xì)胞條件培養(yǎng)液處理的永生化人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞，提示缺氧米勒細(xì)胞分泌的因子促進(jìn)了內(nèi)皮細(xì)胞中MMP-2的表達(dá)。

3 MMP-2抑制劑治療DR的潛在應(yīng)用

MMP在PDR患者視網(wǎng)膜新生血管組織和水溶液中表達(dá)水平升高[33]。研究證明，與對照者相比，無論是否接受過全視網(wǎng)膜光凝治療，PDR患者M(jìn)MP-2水平均升高，表明MMP-2在接受過PDR治療的患者中也是一個治療靶點[33]。在動物模型中，MMP的廣譜藥理抑制可以防止視網(wǎng)膜新生血管[34]。因此，以MMP-2為靶點的治療可以成為PDR患者預(yù)防或治療新生血管的一個重要而有效的部分。

隨著以MMP-2為靶點的DR治療進(jìn)入科學(xué)家的視野，MMP-2抑制劑成為DR治療藥物研發(fā)的焦點。廣譜抑制劑(如GM6001)和許多選擇性小分子抑制劑因毒性、選擇性差或治療效果不佳等缺點阻礙了其發(fā)展。而針對特定MMP(如MMP-2)抑制性抗體的開發(fā)有望成為未來的治療方法。雖然這一領(lǐng)域尚未引起人們的廣泛關(guān)注，但個別針對單個MMP抑制性抗體的研發(fā)已經(jīng)取得了顯著成果[35-37]。研究發(fā)現(xiàn)，高效、高選擇性抗MMP-9單克隆抗體GS-5745(Andecaliximab)在潰瘍性結(jié)腸炎和胃癌的治療中顯示出良好療效；GS-5745單獨以及與mFOLFOX6聯(lián)合應(yīng)用對未經(jīng)治療的胃癌和胃食管交界腺癌患者的療效和安全性目前正在進(jìn)行Ⅲ期臨床試驗[38]。MMPI-1154和MMPI-1260是一種新型心肌細(xì)胞保護(hù)性小分子MMP-2抑制劑，可用于治療急性心肌梗死[39]。MMP-2抑制劑ARP100在缺血再灌注損傷的心肌細(xì)胞中具有改善心臟收縮功能的作用[40]。此外，在視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤的Weri-1細(xì)胞中，ARP100可顯著降低VEGF的表達(dá)和細(xì)胞活力[41]。隨著這一領(lǐng)域不斷取得新成果，開發(fā)一種針對MMP-2的藥物并用于DR治療的可能性顯著增加。

4 小 結(jié)

目前，DR的治療專注于疾病后期，通過暫時防止異常視網(wǎng)膜血管的形成來延緩視力喪失。但當(dāng)前的治療方法無法恢復(fù)受損的神經(jīng)組織或100%恢復(fù)視力。DR中的視網(wǎng)膜損傷和新血管形成過程與糖尿病患者的高血糖環(huán)境密切相關(guān)。而保護(hù)視網(wǎng)膜和避免這種疾病發(fā)展主要針對細(xì)胞凋亡、超氧化物蓄積和新生血管生成。而體外和體內(nèi)試驗研究提供了MMP-2抑制劑作為潛在藥物預(yù)防上述病理學(xué)進(jìn)展的證據(jù)。因此，特異性靶向MMP-2抑制性抗體有望成為未來的治療方法。