葛育文，張寧

(1.山東中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)學(xué)院，濟(jì)南 250014； 2.山東中醫(yī)藥大學(xué)第一臨床學(xué)院，濟(jì)南 250014)

復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)(recurrent spontaneous abortion，RSA)是指孕婦在孕20周以前連續(xù)發(fā)生2次或2次以上的自然流產(chǎn)，其病因包括遺傳、解剖、感染、內(nèi)分泌、凝血等多種因素[1]。其中，約50%的RSA患者無明確的病因，這種無明確病因的RSA稱為不明原因復(fù)發(fā)性自然流產(chǎn)(unexplained recurrent spontaneous abortion，URSA)[2]。URSA嚴(yán)重影響女性的生殖健康，且發(fā)病率逐年上升，因此急需尋找其具體發(fā)病機(jī)制及有效的治療方法。近年有學(xué)者提出，母胎免疫異?？赡苁荱RSA的病因之一[3]。CD4+T細(xì)胞亞群是人體免疫環(huán)境的重要參與者，同時參與了母胎免疫耐受的建立和維持，而輔助性T細(xì)胞(helper T cell，Th)17和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells，Treg細(xì)胞)均屬于CD4+T細(xì)胞亞群，其中Th17細(xì)胞發(fā)揮促炎作用，Treg細(xì)胞發(fā)揮抑炎作用。研究認(rèn)為，成功妊娠主要與Th1/Th2平衡相關(guān)[4]，但Th17/Treg平衡在維持正常妊娠中同樣發(fā)揮重要作用，Th17/Treg失衡可能導(dǎo)致反復(fù)移植失敗、URSA、子癇等多種妊娠疾病[5]?，F(xiàn)就Th17/Treg失衡在URSA中的作用予以綜述。

1 Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞的功能及分化

Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞分化自共同的前體細(xì)胞，即CD4+T細(xì)胞[6]。Th17細(xì)胞與Treg細(xì)胞的免疫調(diào)節(jié)功能截然相反，Th17細(xì)胞具有促炎作用，Treg細(xì)胞具有抑炎作用，兩者保持微妙平衡才能維持人體免疫穩(wěn)態(tài)[7]。

1.1Th17細(xì)胞的功能及相關(guān)細(xì)胞因子 Th17細(xì)胞在人體固有免疫和炎癥中起促進(jìn)作用，尤其在自身免疫性疾病中發(fā)揮重要作用。Th17細(xì)胞主要依靠釋放白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-17A、IL-17F、IL-6、IL-22和腫瘤壞死因子-α等促炎細(xì)胞因子發(fā)揮作用[8]。IL-17家族是Th17細(xì)胞的標(biāo)志性促炎因子，也是Th17細(xì)胞發(fā)揮促炎作用的主要來源，IL-17異常增加可促進(jìn)炎癥細(xì)胞因子的產(chǎn)生及募集，從而導(dǎo)致慢性炎癥和組織損傷[9]。在多發(fā)性硬化癥、類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎、銀屑病等自身免疫性疾病中均發(fā)現(xiàn)了Th17細(xì)胞和IL-17家族的作用[10]。IL-17的促炎作用主要通過兩種途徑實(shí)現(xiàn)：①IL-17自身即可募集免疫細(xì)胞，如中性粒細(xì)胞、單核細(xì)胞等；②IL-17協(xié)同其他促炎因子發(fā)揮作用，如腫瘤壞死因子-α、IL-1、IL-22、γ干擾素、粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子等[11]。IL-21是Th17細(xì)胞發(fā)揮作用的另一重要細(xì)胞因子，其本身作為促炎因子發(fā)揮作用，同時IL-21還可誘導(dǎo)視黃酸相關(guān)孤兒核受體γt(retinoic acid related orphan receptor γt，RORγt)在Th17細(xì)胞中的表達(dá)，促進(jìn)IL-17的產(chǎn)生[12]。

1.2Treg細(xì)胞的功能及相關(guān)細(xì)胞因子 Treg細(xì)胞對于維持免疫動態(tài)平衡以及抑制機(jī)體的過度免疫至關(guān)重要，在自身免疫性疾病、腫瘤及器官移植排斥等疾病中發(fā)揮重要作用。Treg細(xì)胞可分為兩類，即來源于胸腺的自然調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(natural regulatory T cells，nTreg細(xì)胞)和來源于外周的誘導(dǎo)性調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(peripherally-induced regulatory T cells，pTreg細(xì)胞)，其中nTreg細(xì)胞占主要部分[13]。叉頭框轉(zhuǎn)錄因子3(forkhead box P3，F(xiàn)oxp3)作為成熟Treg細(xì)胞的重要標(biāo)志參與Treg細(xì)胞的分化過程，F(xiàn)oxp3轉(zhuǎn)錄因子對于Treg細(xì)胞的穩(wěn)定性和免疫抑制活性均至關(guān)重要[14]。有學(xué)者試圖通過調(diào)控Foxp3的表達(dá)控制Treg細(xì)胞的活性，以期為自身免疫性疾病和腫瘤的治療找到新思路[15]。Treg細(xì)胞主要通過抑制其他免疫細(xì)胞(包括樹突狀細(xì)胞和效應(yīng)T細(xì)胞)的活性發(fā)揮免疫抑制作用，另外，Treg細(xì)胞還可分泌轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)、IL-10等抗炎細(xì)胞因子抑制免疫應(yīng)答[16]。

1.3Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞的分化 Th17細(xì)胞分化所必需的細(xì)胞因子主要包括TGF-β、RORγt、IL-23和IL-6。RORγt是Th17細(xì)胞分化所必需的典型轉(zhuǎn)錄因子，在成熟Th17細(xì)胞中獨(dú)特表達(dá)[17]。有研究表明，RORγt的表達(dá)水平受多種轉(zhuǎn)錄因子的調(diào)節(jié)，包括缺氧誘導(dǎo)因子-1α、信號轉(zhuǎn)導(dǎo)及轉(zhuǎn)錄激活因子(signal transduction and transcription activator，STAT)1、STAT3和STAT5[18]。

TGF-β是Th17細(xì)胞和Treg細(xì)胞分化發(fā)育必需的細(xì)胞因子。低劑量的TGF-β即可誘導(dǎo)Th17細(xì)胞分化，而高劑量的TGF-β在抑制Th17細(xì)胞分化的同時還可誘導(dǎo)Treg細(xì)胞發(fā)育[19]。TGF-β的這一調(diào)節(jié)特性在Th17/Treg比值變化中發(fā)揮重要作用。另外，IL-6與IL-23可協(xié)同TGF-β促進(jìn)Th17細(xì)胞分化，但這一過程依賴于STAT3通路的激活[20]。研究表明，維生素D可通過限制IL-6的表達(dá)及其下游信號的轉(zhuǎn)導(dǎo)抑制Th17細(xì)胞分化[21]。

nTreg細(xì)胞和pTreg細(xì)胞的分化路徑不同，但最終均需表達(dá)Foxp3完成分化。nTreg細(xì)胞在胸腺中的分化主要依賴于T細(xì)胞受體與自身抗原——主要組織相容性復(fù)合物的相互作用。主要組織相容性復(fù)合物激活T細(xì)胞受體后，胸腺中的CD4+CD25+T細(xì)胞特異性表達(dá)轉(zhuǎn)錄因子Foxp3，并上調(diào)其他特征性因子的表達(dá)，如細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞相關(guān)抗原-4、糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體家族相關(guān)基因以及淋巴細(xì)胞活化基因3[22]。另外，IL-2對nTreg細(xì)胞的分化也很重要。有實(shí)驗表明，注射中和IL-2抗體正常小鼠胸腺中Treg細(xì)胞的數(shù)量減少，且小鼠出現(xiàn)自身免疫性疾病癥狀[23]。TGF-β聯(lián)合IL-2刺激外周的CD4+CD25-T細(xì)胞，可誘導(dǎo)CD4+CD25-T細(xì)胞表達(dá)Smad2和Smad3細(xì)胞因子，進(jìn)而激活CD4+CD25-T細(xì)胞表達(dá)Foxp3，從而完成初始T細(xì)胞向pTreg細(xì)胞的轉(zhuǎn)化[24]。

綜上所述，多種因素均可通過控制細(xì)胞分化打破Th17/Treg平衡。此外，在某些情況下，Treg細(xì)胞與Th17細(xì)胞也可以相互轉(zhuǎn)化[25]。有研究發(fā)現(xiàn)，表達(dá)IL-33的樹突狀細(xì)胞可促使Treg細(xì)胞轉(zhuǎn)化為Th17細(xì)胞[26]。

1.4Th17/Treg平衡在維持正常妊娠中的作用 在懷孕初期，母體的Treg細(xì)胞能夠識別精液中的男性抗原，從而抑制母體的免疫排斥反應(yīng)，增強(qiáng)胚胎發(fā)育和植入的能力，有助于成功妊娠[27]。懷孕初期母體的T細(xì)胞可識別并攻擊胎兒，因此擴(kuò)增Treg細(xì)胞、抑制免疫系統(tǒng)對于調(diào)節(jié)母胎耐受是必要的。既往研究表明，Th17/Treg平衡在成功妊娠中起重要作用[28]。具有抗炎作用的Treg細(xì)胞通過抑制具有促炎作用的Th17細(xì)胞，維持正常妊娠[29]。還有研究發(fā)現(xiàn)，只有在整個孕期進(jìn)行持續(xù)的Treg細(xì)胞擴(kuò)增才能有效抑制母體針對胎兒的免疫反應(yīng)，同時帶有妊娠印記的Treg細(xì)胞會維持母體對胎兒的保護(hù)性記憶，促進(jìn)再次妊娠時Treg細(xì)胞的快速增殖[30]。研究顯示，妊娠前3個月Treg細(xì)胞表達(dá)水平升高，妊娠中期Treg細(xì)胞水平達(dá)到峰值，隨后逐漸降低并維持在較低水平，直至分娩后回落至妊娠前水平[31]。有研究表明，精液[32]以及生理劑量的雌激素[33]均可誘導(dǎo)母體內(nèi)Treg細(xì)胞增殖，且Treg細(xì)胞增殖與血清雌激素水平升高呈正相關(guān)。此外，孕期母體子宮內(nèi)膜基底層細(xì)胞表達(dá)CC趨化因子配體(CC chemokine ligand，CCL)22、CCL3、CCL5、CCL17和CX3C趨化因子配體1等，吸引Treg細(xì)胞進(jìn)入蛻膜，誘導(dǎo)Treg細(xì)胞在子宮局部聚集，保護(hù)胎兒免受母體的免疫攻擊[34-35]。

目前Th17細(xì)胞在母胎耐受中的作用尚不明確，但Th17細(xì)胞與許多妊娠疾病相關(guān)，包括自然流產(chǎn)和先兆子癇。Xu等[36]研究發(fā)現(xiàn)，與正常妊娠小鼠相比，流產(chǎn)模型小鼠的Th17細(xì)胞及相關(guān)因子IL-17、RORγt水平均升高。在正常的妊娠中，Th17/Treg比值偏向Treg細(xì)胞優(yōu)勢以維持妊娠，Treg細(xì)胞的減少或Th17細(xì)胞的增加對正常妊娠均不利[37]。與非妊娠女性相比，正常妊娠女性體內(nèi)的Th17細(xì)胞水平較低，導(dǎo)致Th17/Treg比值降低[38]，這有利于維持妊娠。高度靈活的免疫調(diào)節(jié)對成功妊娠非常重要：在正常妊娠狀態(tài)下，Treg細(xì)胞占據(jù)主要地位，防止母體對胎兒的免疫攻擊，但在發(fā)生感染時Th17細(xì)胞則迅速增殖以增強(qiáng)免疫抗感染。

2 URSA與Th17/Treg失衡

2016年《中國復(fù)發(fā)性診療專家共識》中將RSA分為自身免疫型RSA和同種免疫型RSA，同種免疫型RSA包括固有免疫紊亂和獲得性免疫紊亂兩種免疫失調(diào)[1]。T細(xì)胞及其相關(guān)細(xì)胞因子異常即屬于獲得性免疫紊亂的范疇。研究表明，Th17/Treg失衡導(dǎo)致的母胎免疫耐受紊亂是URSA的病因之一[39-42]。

2.1URSA患者的Th17/Treg細(xì)胞表達(dá)模式 研究表明，URSA人群外周血和蛻膜中的Th17細(xì)胞表達(dá)升高，Treg細(xì)胞表達(dá)降低，Th17/Treg比例失衡[39-42]。早在2004年就有學(xué)者發(fā)現(xiàn)自然流產(chǎn)人群蛻膜中的CD4+CD25+Treg表達(dá)降低[43]，證明Treg細(xì)胞是維持妊娠的重要免疫細(xì)胞。另有研究發(fā)現(xiàn)，URSA婦女蛻膜中的Treg細(xì)胞表達(dá)降低，Th17/Treg比值顯著升高[40]，表明URSA患者子宮局部Th17細(xì)胞過度增殖，Th17/Treg免疫失衡。有研究者還探討了URSA患者外周血中Th17、Treg細(xì)胞相關(guān)細(xì)胞因子的表達(dá)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，URSA患者血清Th17相關(guān)細(xì)胞因子RORγt、IL-17、IL-21、IL-22水平均顯著高于正常妊娠者，而Treg相關(guān)細(xì)胞因子Foxp3、TGF-β水平均顯著低于正常妊娠者，同時URSA患者的Foxp3/RORγt比值也顯著低于正常妊娠組[41-42]。以上研究表明，URSA患者子宮局部甚至全身免疫系統(tǒng)均處于Th17/Treg失衡的狀態(tài)。

Sereshki等[44]研究發(fā)現(xiàn)，URSA患者體內(nèi)的Th17/Treg比值會隨著月經(jīng)周期的變化而改變，URSA患者月經(jīng)周期增殖期和分泌期Th17細(xì)胞及相關(guān)細(xì)胞因子IL-17A水平均升高，但Treg細(xì)胞水平降低，Treg細(xì)胞相關(guān)因子TGF-β、IL-10則檢測不到，同時Th17/CD4+Treg比值升高，由此認(rèn)為，URSA患者增殖期Th17/Treg失衡可能是其自然流產(chǎn)的原因之一。以上研究證明，URSA患者體內(nèi)Th17細(xì)胞增加、Treg細(xì)胞減少、Th17/Treg失衡，而Th17/Treg失衡可導(dǎo)致母體對胎兒過度免疫，從而導(dǎo)致反復(fù)流產(chǎn)的發(fā)生。

2.2URSA患者Th17/Treg失衡的調(diào)控機(jī)制 URSA患者的Th17/Treg失衡由多種因素共同作用導(dǎo)致，包括基因表達(dá)、細(xì)胞因子、信號通路以及其他免疫細(xì)胞作用等。Abdolmohammadi Vahid等[45]通過測定反復(fù)妊娠丟失患者外周血中調(diào)控T細(xì)胞分化的微RNA水平發(fā)現(xiàn)，反復(fù)妊娠丟失患者與Treg細(xì)胞、Th2細(xì)胞分化相關(guān)的GATA結(jié)合蛋白3和抗糖皮質(zhì)激素誘導(dǎo)的腫瘤壞死因子受體基因表達(dá)均下調(diào)，而與Th17細(xì)胞分化相關(guān)的轉(zhuǎn)錄因子T-bet和干擾素調(diào)節(jié)因子4基因表達(dá)均上調(diào)，表明Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞及相關(guān)微RNA譜的表達(dá)水平有望成為評估反復(fù)妊娠丟失患者預(yù)后的指標(biāo)。另有研究發(fā)現(xiàn)，維甲酸和干擾素誘導(dǎo)的死亡相關(guān)基因19在URSA患者體內(nèi)的表達(dá)降低，維甲酸和干擾素誘導(dǎo)的死亡相關(guān)基因19表達(dá)缺乏可引起活性氧類和哺乳動物雷帕霉素靶蛋白表達(dá)上調(diào)，從而促進(jìn)Th17細(xì)胞分化，同時抑制Treg細(xì)胞分化，導(dǎo)致Th17/Treg失衡[46]。

細(xì)胞因子及相關(guān)信號通路在調(diào)節(jié)Th17/Treg平衡中發(fā)揮了重要作用，URSA患者體內(nèi)多種細(xì)胞因子表達(dá)異常均可導(dǎo)致Th17/Treg失衡的發(fā)生。Foxp3是Treg細(xì)胞生成所必需的細(xì)胞因子，Zhu等[47]發(fā)現(xiàn)，URSA患者體內(nèi)Foxp3-TSDR(Treg-specific demethylated region)DNA甲基化水平升高，導(dǎo)致Foxp3因子表達(dá)水平降低，進(jìn)而導(dǎo)致URSA患者體內(nèi)的Treg細(xì)胞數(shù)量和功能降低。人類白細(xì)胞抗原-G是一種免疫調(diào)節(jié)因子，能夠調(diào)節(jié)人體免疫細(xì)胞的分化。研究發(fā)現(xiàn)，URSA患者體內(nèi)人類白細(xì)胞抗原-G水平降低，導(dǎo)致Treg細(xì)胞水平降低[48]。STAT3是Th17細(xì)胞、Treg細(xì)胞分化的重要信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，研究發(fā)現(xiàn)，URSA患者體內(nèi)STAT3信號通路被過度激活，在抑制Treg細(xì)胞分化的同時還可促進(jìn)Th17細(xì)胞分化，導(dǎo)致URSA患者Th17/Treg失衡加劇[49]。

細(xì)胞誘導(dǎo)分化也是URSA患者Th17/Treg失衡的重要調(diào)節(jié)路徑之一。IL4+樹突狀細(xì)胞可以通過誘導(dǎo)Foxp3因子的表達(dá)促進(jìn)Treg細(xì)胞的分化，而反復(fù)流產(chǎn)患者體內(nèi)IL4+樹突狀細(xì)胞水平低于正常妊娠者，因此IL4+樹突狀細(xì)胞水平降低可能是URSA患者Foxp3H+Treg細(xì)胞比例降低的原因之一[50]。人絨毛膜滋養(yǎng)層細(xì)胞HTR8/SVneo是一種孕早期的滋養(yǎng)層細(xì)胞，研究表明，妊娠早期HTR8/SVneo滋養(yǎng)層細(xì)胞與Th17/Treg比值存在雙向調(diào)節(jié)作用，將CD4+T細(xì)胞群和HTR8/SVneo滋養(yǎng)層細(xì)胞進(jìn)行體外共培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，HTR8/SVneo滋養(yǎng)層細(xì)胞誘導(dǎo)分化Treg細(xì)胞的能力增強(qiáng)，同時還可促進(jìn)Th17細(xì)胞表面凋亡標(biāo)志物的表達(dá)，導(dǎo)致Th17細(xì)胞數(shù)量減少[51]。由此推測，URSA患者滋養(yǎng)層細(xì)胞分化異常造成了母胎界面Th17/Treg失衡，進(jìn)而導(dǎo)致流產(chǎn)的反復(fù)發(fā)生。以上研究表明，URSA患者體內(nèi)Th17/Treg失衡由多種因素共同導(dǎo)致，但其具體的調(diào)節(jié)網(wǎng)絡(luò)目前尚不明確，還需要進(jìn)一步研究。希望通過更深入的研究，可以明確URSA患者Th17/Treg失衡的具體機(jī)制，同時探究URSA有效治療的靶點(diǎn)。

2.3Th17/Treg失衡在URSA免疫治療中的意義 動物實(shí)驗表明，糖皮質(zhì)激素潑尼松可以調(diào)節(jié)大鼠體內(nèi)的Th17、Treg水平，重建免疫穩(wěn)態(tài)，且潑尼松的藥物安全性已得到臨床驗證，有望應(yīng)用于URSA患者的臨床治療中[52]。還有研究發(fā)現(xiàn)，小劑量的父系淋巴細(xì)胞免疫治療可通過降低母體外周血中的Th17/Treg比值，維持URSA孕婦成功妊娠[53-54]，但目前其治療的有效性和安全性還存在爭議，尚需更多的臨床試驗驗證。靜脈注射用人免疫球蛋白是免疫治療的常用藥物，具有免疫替代和免疫調(diào)節(jié)的作用。Guo等[55]應(yīng)用靜脈注射免疫球蛋白聯(lián)合肌內(nèi)注射人絨毛膜促性腺激素治療30例URSA患者，最終有18例患者成功妊娠，比較治療前后Th17、Treg細(xì)胞水平發(fā)現(xiàn)，治療后Th17細(xì)胞水平降低，Treg細(xì)胞水平升高，Th17/Treg平衡逆轉(zhuǎn)，偏向Treg細(xì)胞。一項針對20例URSA孕婦的研究發(fā)現(xiàn)，免疫球蛋白聯(lián)合人絨毛膜促性腺激素治療能夠調(diào)節(jié)URSA患者的Th17/Treg比值[56]，但該研究并未報道患者的妊娠結(jié)局，因此其確切療效尚不可知。Ahmadi等[57]應(yīng)用免疫抑制劑西羅莫司對反復(fù)種植失敗的患者進(jìn)行干預(yù)的隨機(jī)對照試驗顯示，與空白對照組相比，應(yīng)用西羅莫司干預(yù)患者的臨床妊娠率顯著升高，Th17/Treg比值顯著降低，這一研究結(jié)果為URSA的治療提供了新思路。以上研究表明，糾正Th17/Treg失衡有可能成為URSA的治療靶點(diǎn)，但其有效性及安全性還有待進(jìn)一步證實(shí)。

傳統(tǒng)中醫(yī)藥在URSA治療中也發(fā)揮了重要作用。有證據(jù)表明，中藥方劑補(bǔ)腎活血湯可通過磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路調(diào)節(jié)Th17/Treg比值，恢復(fù)URSA患者蛻膜基質(zhì)細(xì)胞的正常增殖，從而治療URSA[58]。此外，傳統(tǒng)中醫(yī)保胎方胎元飲、壽胎丸和益腎安宮方等也可通過糾正孕婦體內(nèi)的Th17/Treg失衡發(fā)揮保胎作用[59-60]。這些研究結(jié)果為補(bǔ)腎安胎方劑治療URSA提供了理論依據(jù)。

3 小 結(jié)

Th17/Treg平衡對母胎免疫耐受平衡的建立與維持意義重大。Th17/Treg失衡可能導(dǎo)致URSA、子癇、早產(chǎn)等妊娠疾病的發(fā)生，因此了解Th17/Treg平衡參與胎兒母體耐受的機(jī)制、制訂新的治療策略平衡母胎界面的免疫耐受對URSA的預(yù)防及治療均具有重要意義。與正常孕婦相比，URSA患者體循環(huán)及母胎界面的Th17/Treg失衡，且URSA患者體內(nèi)Th17、Treg的表達(dá)受多種因素的調(diào)節(jié)，其具體病理機(jī)制復(fù)雜。Th17/Treg失衡是URSA患者重要的免疫標(biāo)志，也可能是URSA的病因之一，但目前的研究大多處于初級階段，還有許多問題尚待解決。相信隨著研究的深入，Th17/Treg失衡導(dǎo)致URSA發(fā)生的具體機(jī)制將逐漸明確，并有助于尋找有效的URSA治療方法，使廣大URSA患者獲益。