王雪，陳曉紅

(哈爾濱醫(yī)科大學附屬第四醫(yī)院感染科，哈爾濱 150001)

人類免疫缺陷病毒(human immune deficiency virus，HIV)是一種雙鏈RNA逆轉(zhuǎn)錄病毒，變異非?；钴S。HIV-1主要選擇性地侵入人體免疫系統(tǒng)的CD4+T淋巴細胞和巨噬細胞，拷貝插入宿主細胞DNA中的HIV形成前病毒，即HIV儲存庫[1]。感染細胞以前病毒為模板，通過轉(zhuǎn)錄、剪切、翻譯等借助宿主細胞內(nèi)物質(zhì)產(chǎn)生更多HIV顆粒[2]，創(chuàng)造新的感染周期，傳播受感染的細胞，從而導致HIV的惡性傳播。一般情況下，人體感染HIV后，如果不經(jīng)抗病毒治療，8～10年即可進展至艾滋病期，因此早發(fā)現(xiàn)、早治療顯得尤為重要。高效抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療(highly active antiretroviral therapy，HAART)的出現(xiàn)為獲得性免疫缺陷綜合征的治療提供了新途徑，但目前的治療方法并不能徹底清除HIV儲存庫。因此，研發(fā)可清除宿主細胞DNA中攜帶整合、可復制的HIV儲存庫的策略迫在眉睫。HIV儲存庫對HAART和宿主免疫系統(tǒng)的清除具有抗藥性，抗病毒治療一旦停止，就會導致病毒反彈，引起新一輪的感染[3]。現(xiàn)就HIV儲存庫形成及檢測方法的研究現(xiàn)狀予以綜述。

1 HIV儲存庫的形成

1.1HIV儲存庫潛伏期的機制 關于HIV儲存庫潛伏期的機制目前探討最多的為整合前潛伏和整合后潛伏。整合前潛伏是指HIV以雙鏈DNA的形式存在于靜息CD4+T細胞胞質(zhì)內(nèi)，當外界抗原進入機體活化靜息CD4+T細胞時，HIV就整合進入宿主遺傳物質(zhì)開始復制周期；整合后潛伏是指HIV的雙鏈DNA先整合到宿主遺傳物質(zhì)中，以前病毒的形式維持病毒庫的穩(wěn)定[4]，其中整合后潛伏占主導要地位。

1.1.1表觀遺傳 表觀遺傳可調(diào)控細胞染色質(zhì)，HIV DNA的整合位置主要是細胞染色質(zhì)，因此HIV DNA的表達受相同表觀遺傳機制的調(diào)控。有研究證明，當DNA甲基化位于啟動子時，可以導致體外潛伏期模型中的HIV原病毒表達沉默，這也是常見的與轉(zhuǎn)錄抑制相關的表觀遺傳機制[5]。因此，可通過DNA甲基化維持HIV潛伏期。Hughes等[6]研究發(fā)現(xiàn)，約70%的脊椎動物基因啟動子與CpG島的DNA元素相關，而CpG島對DNA甲基化不敏感。CpG島可以影響染色質(zhì)調(diào)節(jié)因子的活性，這些調(diào)節(jié)因子可以翻譯后修飾組蛋白并調(diào)節(jié)基因表達。另一方面，組蛋白乙?；ǔＥc活躍的轉(zhuǎn)錄相關[7]。用組蛋白去乙?；敢种苿┣乓志谹治療HIV潛伏感染細胞，可以激活病毒，表明組蛋白去乙?；诰S持潛伏期中起主要作用[8]。

1.1.2位點選擇 前病毒對于宿主DNA位點的選擇存在特異性。對前病毒整合位點的進一步分析表明，HIV-1更傾向于主動轉(zhuǎn)錄的基因[9]。Singh等[9]對從培養(yǎng)的HEK293T細胞中分離的100萬個HIV-1整合位點進行測序分析后發(fā)現(xiàn)，內(nèi)含子和選擇性剪接均有助于整合位點的選擇。事實上，HIV-1整合酶通過與細胞剪接相互作用，在選擇整合位點方面起關鍵作用。HIV-1整合酶可直接與晶狀體上皮源性生長因子/p75相互作用，通過將整合前復合體與染色質(zhì)結合促進HIV整合[10]。晶狀體上皮源性生長因子/p75常與許多剪接因子相互作用，并通過這些剪接因子將HIV-1整合到高度剪接的轉(zhuǎn)錄單元上。由此可見，HIV-1通過選擇主動轉(zhuǎn)錄的基因進行整合來避免潛伏期。

1.1.3轉(zhuǎn)錄干擾 整合是HIV復制中關鍵且不可逆的環(huán)節(jié)，盡管有抑制性抗反轉(zhuǎn)錄病毒治療，但HIV在長壽命細胞庫中仍持久存在，即潛在的前病毒常在高表達基因中整合，表明高表達基因的轉(zhuǎn)錄可干擾病毒的轉(zhuǎn)錄[11]。Lenasi等[12]研究證明，宿主基因在轉(zhuǎn)錄時會抑制整合在基因中的前病毒的表達。當前病毒DNA的極性與宿主基因的極性相同時，啟動子就會被阻斷，在這種情況下，通過延長RNA聚合酶Ⅱ的轉(zhuǎn)錄可干擾HIV-1轉(zhuǎn)錄所必需的轉(zhuǎn)錄因子的組裝，而轉(zhuǎn)錄起始復合物的缺乏會導致HIV-1潛伏期[13]。因此，在病毒潛伏期，HIV-1可以通過抑制上游轉(zhuǎn)錄或協(xié)同激活病毒轉(zhuǎn)錄起始和延伸來抵消轉(zhuǎn)錄；然而，當前病毒DNA與宿主基因具有相反的極性時，RNA聚合酶Ⅱ可能發(fā)生碰撞，導致病毒轉(zhuǎn)錄提前終止[14]。

1.1.4病毒蛋白與HIV-1再激活 HIV感染細胞的潛伏期受兩種HIV-1蛋白(即Tat和Vpr)的調(diào)節(jié)。Tat是轉(zhuǎn)錄的反式激活因子，也是編碼于HIV基因組中的一種關鍵調(diào)節(jié)蛋白，受單個HIV啟動子控制。Cao等[15]通過研究HIV感染細胞的潛伏機制和反式激活細胞表型發(fā)現(xiàn)，增加Tat乙酰化可顯著增加Tat和病毒的產(chǎn)生，而增加Tat反式激活可更快地反式激活潛伏細胞。作為病毒反式激活因子的調(diào)節(jié)蛋白，Tat的缺失是HIV-1潛伏期的一個關鍵因素[16]。而HIV-1輔助蛋白Vpr則可再一次激活潛伏感染的細胞。對HIV-1感染患者進行血清學檢查發(fā)現(xiàn)，患者外周血中Vpr的數(shù)量顯著高于Tat，因此細胞外Vpr在激活HIV-1潛伏感染細胞中占據(jù)重要地位[17]。Rev也是一種調(diào)節(jié)蛋白，可結合HIV的信使RNA，促進病毒中信使MRA的核質(zhì)轉(zhuǎn)運，且需要多個Rev單體結合Rev反應元件將病毒信使RNA轉(zhuǎn)運至細胞質(zhì)，因此Rev表達水平與功能間的關系是非線性的[18]；同時，還需要一定水平的Rev維持病毒蛋白的活性表達，Rev表達不足則可能導致HIV-1潛伏期[19]。

1.2HIV儲存庫的存在部位 HIV DNA儲存庫存在于外周血的多種細胞中，主要包括單核細胞和中心記憶CD4+T細胞、過渡狀態(tài)的記憶CD4+T細胞以及效應記憶CD4+T細胞等。

1.2.1淋巴結 淋巴結是主要的HIV儲存庫,高水平激活和高水平復制的特點可以快速誘發(fā)其感染新的細胞。因此，淋巴結在HIV儲存庫的動態(tài)變化中起重要作用。Fukazawa等[20]通過研究恒河猴胚胎干細胞模型發(fā)現(xiàn)，濾泡輔助性CD4+T細胞多在分化過程中被感染，且不易被特異性免疫反應或抗反轉(zhuǎn)錄病毒藥物所獲取。可見，淋巴結是HIV儲存庫清除的一個障礙。Lorenzo-Redondo等[21]研究證實，在HIV感染者行HAART過程中，淋巴組織中的HIV發(fā)生了變化，表明HIV儲存庫存在進行性復制。但當HAART中斷時，會出現(xiàn)許多表達不同病毒RNA的變異細胞，有助于HIV的反彈[22]。

1.2.2內(nèi)臟相關淋巴組織 對人類和猿類模型的研究顯示，內(nèi)臟相關淋巴組織包含人體60%的淋巴細胞，內(nèi)臟相關淋巴組織通過輔助性T細胞17耗竭、細菌易位和局部宿主細胞激活等方式促進HIV復制，導致HIV在細胞感染中持續(xù)存在[23-25]。在急性和早期HIV感染期間，胃腸道CD4+T細胞的HIV DNA載量較血液中CD4+T細胞的HIV DNA載量平均高13倍[26]。非CD4+T細胞在腸道中攜帶的HIV DNA較CD4+T細胞攜帶的HIV DNA少，但內(nèi)臟相關淋巴組織中非CD4+T細胞的感染水平高于血液[27]。在內(nèi)臟相關淋巴組織中，髓細胞也含有HIV DNA[28]。在HAART啟動后，內(nèi)臟相關淋巴組織中的HIV DNA載量降低但不會消失[29]，且HIV DNA載量在不同的腸道位置存在差異[30]。在回腸和直腸細胞中，記憶效應CD4+T細胞中含有的HIV DNA最多[31]。與未接受HAART的患者相比，接受HAART患者直腸中的HIV DNA載量升高[32]?？梢?，內(nèi)臟相關淋巴組織中的總HIV DNA與感染不同階段血液中的總HIV DNA載量相關。

1.2.3其他組織 中樞神經(jīng)系統(tǒng)在單核細胞將感染由外周轉(zhuǎn)移至大腦的過程中具有特殊作用[33]。單核細胞可遷移到各種組織并分化為抗原呈遞細胞，如巨噬細胞、膠質(zhì)細胞和樹突狀細胞等。膠質(zhì)細胞是大腦中HIV-1的主要靶點，在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中可以作為HIV儲存庫發(fā)揮作用[34]。另外，由于血腦屏障的存在，大部分抗病毒藥物難以透過血腦屏障進入大腦，因此血腦屏障也成為HIV的天然保護層，增加了病毒耐藥突變的發(fā)生率[35]；其次，腦內(nèi)潛伏的HIV較少與外周細胞或組織進行遺傳物質(zhì)交換[36]。由于HAART僅可起到局部抑制作用，且目前的抗病毒藥物對腦內(nèi)的病毒無效，因此含有HIV DNA的細胞一直存在[37]。另外，脂肪組織中的記憶CD4+T淋巴細胞也是一個潛在、重要的HIV儲存庫，在未經(jīng)治療的獼猴和接受有效治療的HIV感染者中均檢測到HIV DNA[38]。未來，測量不同組織和液體中的總HIV DNA，有助于評估針對清除HIV儲存庫的治療策略。

1.3HIV DNA在病毒復制中的主要存在形式 在HIV儲存庫中，非整合的前病毒占比為10∶1～100∶1，主要包括線性非整合DNA和環(huán)狀非整合DNA[39]。其中，環(huán)狀非整合DNA包括1個長末端重復序列 (long terminal repeat，LTR)和含有2個LTR的環(huán)狀HIV DNA。線性非整合DNA和環(huán)狀非整合DNA在分子結構、穩(wěn)定性、表達特性以及在潛伏期中的作用等方面均存在差異。線性非整合DNA結構不穩(wěn)定，很容易降解，因此其臨床意義較小[40-41]；2-LTR HIV DNA的結構較特殊，因此與線性非整合HIV DNA相比，2-LTR HIV DNA的臨床意義更大[42]。非整合形式前病毒主要存在于感染細胞內(nèi)，參與HIV致病機制的形成。而整合的前病毒大部分因高突變、缺失以及轉(zhuǎn)錄后沉默造成缺陷不能形成病毒復制，這些缺陷前病毒的作用可能與非整合前病毒作用一致。在HIV持續(xù)復制中真正起作用的前病毒所占比例較小，非缺陷的整合前病毒是最穩(wěn)定的形式[43]，可導致潛伏性感染或有轉(zhuǎn)錄活性的感染；同時非缺陷的整合前病毒也是HIV儲存庫的基本成分，是病毒清除的主要障礙[44]。

2 HIV DNA的檢測方法及意義

2.1HIV DNA的檢測方法 HIV儲存庫的檢測方法主要包括以細胞培養(yǎng)為前提的病毒外生測定法以及基于DNA儲存庫核酸結構的定量聚合酶鏈反應(polymerase chain reaction，PCR)檢測法。而關于DNA儲存庫的臨床研究主要應用熒光定量PCR檢測法。

2.1.1Alu-gag PCR Alu-gag PCR是檢測感染細胞中整合前病毒的一種定量分析方法[45]。該方法主要通過兩個步驟實時PCR檢測：①用與Alu、gag序列匹配的引物擴增gag與最近的Alu之間的區(qū)域[46]；②通過巢式PCR擴增識別第一步驟中特異性擴增產(chǎn)物中長末端重復序列的R-U5區(qū)域[45]。Alu-gag PCR檢測精確且靈敏度高，對整合前病毒的量化十分靈敏。Alu-gag PCR檢測的弊端在于不能辨別缺陷病毒與非缺陷病毒，導致實際測出的HIV儲存庫遠高于理論數(shù)值。

2.1.2定量病毒生長檢測法(quantitative viral outgrowth assay，Q-VOA) Q-VOA可以檢測出有復制能力的前病毒的數(shù)量[45]。傳統(tǒng)的Q-VOA以健康供者的CD4+T淋巴細胞為目標，其病毒復制率低，且耗時長、成本高、程序復雜；最新的Q-VOA則以CC趨化因子受體5和CXC趨化因子受體4共受體的人急性淋巴母細胞白血病細胞/CC趨化因子受體5體外細胞株為目標，其克服了病毒復制率低、耗時長、成本高等缺點[45,47]，因此目前廣泛應用于臨床。但最新的Q-VOA也存在弊端：①其僅能檢測HIV生命周期的一個組成部分，無法完整檢測組織中的病毒庫，導致實際測出的HIV儲存庫遠高于理論數(shù)值；②檢測的血樣本量較小，準確檢測的血樣本量應>150 mL[45]；③檢測耗時長且成本高，患者難以接受。

2.1.3Tat/Rev誘導的限制稀釋法 Tat/Rev誘導的限制稀釋法是一種基于PCR的分析方法，可重復、敏感地測量臨床樣本中有效和潛在的感染HIV的CD4+T細胞的頻率[48]。這些有效和潛在的感染HIV的CD4+T細胞主動產(chǎn)生編碼Tat/Rev蛋白的多重剪接RNA，因為多重剪接RNA在潛在感染細胞中不存在，但在病毒重新激活后可被誘導[48]。雖然Tat/Rev誘導的限制稀釋法需要較小的血樣量，不需要提取病毒核酸，但仍會導致實際測出的HIV儲存庫數(shù)量遠高于理論數(shù)值[45]。

2.2HIV DNA定量檢測的意義

2.2.1在早期篩查方面的意義 HIV DNA作為HIV儲存庫標志物，其最主要的優(yōu)勢為窗口期最短，即在感染HIV后3～7 d就可建立HIV儲存庫，因此將其應用于HIV早期篩查可準確揭示病毒感染程度、患者病情進展及臨床分期。在國內(nèi)，HIV DNA定量檢測技術還具有價格相對較低且穩(wěn)定性高等優(yōu)勢，同時需要的血液量少、所受干擾少、特異性高，因此可用于嬰幼兒HIV感染的診斷。HIV DNA可以在血液和其他體液中被檢測到，HIV DNA定量檢測技術是組織活檢標本中應用最廣泛的量化HIV儲存庫的方法[49]。在大多數(shù)情況下，血清學檢測在區(qū)分 18個月以下嬰兒HIV抗體來源方面缺乏足夠的敏感性和特異性，因此HIV DNA檢測有助于確認特異性抗體產(chǎn)生不足時的HIV感染[50]。采集嬰兒血樣標本時應注意：①要具備小嬰兒靜脈穿刺所需的專業(yè)知識；②在2～25 ℃下運輸和儲存血樣標本；③在獲得血樣后4 d內(nèi)進行檢測。

2.2.2在病情預測方面的意義 HIV DNA定量檢測具有簡單、標準化、靈敏和可重復的特點。在臨床上，HIV DNA載量可以反映HIV感染的過程，特別是，HIV DNA是獲得性免疫缺陷綜合征進展和死亡的預測因子，獨立于HIV RNA和CD4+T細胞計數(shù)之外?；€總HIV DNA載量可預測HAART，HIV DNA載量在HAART期間降低但仍可量化，其水平既可反映感染史(HIV RNA峰值、CD4+T細胞計數(shù)的最低點)，也可反映療效(殘余病毒血癥、累積病毒血癥、免疫恢復、免疫細胞活化)[51]。血液中總的HIV DNA載量還可預測某些HIV-1相關終末器官疾病的存在和嚴重程度。雖然HIV DNA不能區(qū)分復制能力強的和有缺陷的潛伏病毒，但血液、組織和細胞中的總HIV DNA載量可從某種程度上反映HIV的發(fā)病機制，這可能由于所有的病毒形式均參與了宿主細胞的激活和HIV的發(fā)病過程。HIV DNA是獲得性免疫缺陷綜合征進展和死亡的預測因子，HIV DNA載量高的患者病程進展快、免疫功能差、并發(fā)癥嚴重且合并感染及病死率均更高[51]。

3 小 結

雖然經(jīng)HAART后HIV感染者的壽命延長，但長期服藥的依從性不良、耐藥性、不能徹底根除HIV仍是HIV感染者潛在的致命威脅。徹底治愈HIV感染者，HIV儲存庫仍是研究重點。首先應明確HIV潛伏感染的機制，找到準確且敏感的測量方法以量化HIV儲存庫的大小。雖然研究者嘗試多種方法清除體內(nèi)整合的HIV，且取得了一定進展，但要應用于臨床還需更深入的研究。HIV DNA作為HIV儲存庫的標志物具有臨床相關性，可在臨床實踐中廣泛應用。將HIV DNA用于監(jiān)測HAART的效果，或許可為減少或清除HIV策略的研究提供新思路。