周 娜 娜，王 小 艷，張 媛，王 靖，趙 國 淼，魏 超，楊 凱，安泰*

1.中糧營養(yǎng)健康研究院有限公司，北京102209；

2.營養(yǎng)健康與食品安全北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京102209；

3.老年?duì)I養(yǎng)食品研究北京市工程實(shí)驗(yàn)室，北京102209

重組蛋白藥物是生物醫(yī)藥中的重要組成部分，在各種重大疾病治療中應(yīng)用廣泛，是基因工程技術(shù)應(yīng)用于制藥工業(yè)的典范[1]。重組蛋白類藥物是利用基因工程技術(shù)表達(dá)的產(chǎn)物，用于彌補(bǔ)人體內(nèi)某些功能蛋白的缺失，主要分為八個(gè)大類，具體包括多肽類激素、人造血因子、人細(xì)胞因子、人血漿蛋白因子、人骨形成蛋白、重組酶、融合蛋白和外源重組蛋白等[2]。經(jīng)過三十多年的發(fā)展，目前國內(nèi)重組蛋白藥物已經(jīng)占據(jù)生物藥物市場(chǎng)的1/3。2019年全球的藥物市場(chǎng)約12 000億美元[3]，僅重組蛋白藥物的銷售額就達(dá)835億美元，年復(fù)合增長率為4.6%，歐美國家占據(jù)全球主導(dǎo)地位，占全球市場(chǎng)份額的81%[4]。中國重組蛋白藥物的市場(chǎng)規(guī)模為436.66億元，年復(fù)合增長率8.9%，發(fā)展前景廣闊[4]。

由于重組蛋白藥物的創(chuàng)新成本高，基因工程藥物中仿制藥生產(chǎn)較多。但隨著重組蛋白藥物生產(chǎn)技術(shù)的發(fā)展和成熟，國內(nèi)重組蛋白藥物也在不斷創(chuàng)新研發(fā)。2020年新型冠狀病毒肺炎疫情全球大流行，危及世界人口健康和經(jīng)濟(jì)發(fā)展，疫苗的開發(fā)與接種是控制疫情的有效手段。多種候選疫苗——肽、病毒類粒子、病毒載體（復(fù)制和非復(fù)制）、核酸（DNA或RNA）、減毒活病毒、重組設(shè)計(jì)蛋白和滅活病毒等被大量研究[5]。我國在新型冠狀肺炎病毒疫苗的研發(fā)，尤其是重組蛋白疫苗的研發(fā)中，技術(shù)不斷提升，目前已經(jīng)躋身世界前列。

重組蛋白藥物的整體產(chǎn)業(yè)鏈分為上、中、下游，上游是基于基因工程技術(shù)、細(xì)胞工程技術(shù)的研發(fā)環(huán)節(jié)；中游為藥物及給藥系統(tǒng)生產(chǎn)制造，包括大規(guī)模細(xì)胞培養(yǎng)、重組蛋白純化與質(zhì)控；下游是銷售流通環(huán)節(jié)[6]。本文主要針對(duì)重組蛋白藥物產(chǎn)業(yè)鏈上游和中游的表達(dá)系統(tǒng)、細(xì)胞培養(yǎng)及純化質(zhì)控等環(huán)節(jié)的最新技術(shù)進(jìn)展進(jìn)行綜述，以期為重組蛋白藥物生產(chǎn)企業(yè)的技術(shù)提升提供一定的參考。

1 重組蛋白藥物生產(chǎn)的表達(dá)系統(tǒng)

目前在工業(yè)應(yīng)用中，涉及到多種重組表達(dá)系統(tǒng)，其中在生產(chǎn)重組蛋白藥物中,主要應(yīng)用到大腸桿菌、酵母和哺乳動(dòng)物CHO細(xì)胞系3種表達(dá)系統(tǒng)。借助于這幾種系統(tǒng)表達(dá)的重組藥物蛋白已經(jīng)成功地在世界范圍內(nèi)商業(yè)化投放。幾種表達(dá)系統(tǒng)的優(yōu)缺點(diǎn)列于表1中。

1.1 大腸桿菌系統(tǒng)

在3種表達(dá)系統(tǒng)中，大腸桿菌系統(tǒng)最為簡(jiǎn)單。此系統(tǒng)涵蓋多種類型的菌株，這些菌株的主要差異在于篩選標(biāo)記、誘導(dǎo)方式、有無信號(hào)序列、營養(yǎng)缺陷型及特殊蛋白質(zhì)折疊機(jī)制[7]。對(duì)于大腸桿菌的基因工程改造更好地完善了大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)，如編碼二硫鍵異構(gòu)酶的基因已穩(wěn)定整合到大腸桿菌的基因組中，確保蛋白正確折疊，提高胞內(nèi)蛋白的折疊和溶解性[8]。改進(jìn)的菌株Shuffle被開發(fā)用于生產(chǎn)全長效應(yīng)結(jié)合免疫球蛋白（1~25 mg·L?1），并且無體外再折疊加工[9]。此外，重組蛋白在大腸桿菌周質(zhì)空間中的有效分泌可提高大腸桿菌表達(dá)的蛋白可溶性[10]。大腸桿菌表達(dá)系統(tǒng)主要用于多肽類藥物的生產(chǎn)，如重組人胰島素和重組甲狀旁腺激素等[11]。

1.2 酵母系統(tǒng)

釀酒酵母（Saccharomyces cerevisiae）是被廣泛研究的酵母表達(dá)系統(tǒng)之一，用于生物制藥合成的宿主[12]。糖基化是重要的翻譯后修飾之一，盡管酵母可以進(jìn)行N-糖基化和O-糖基化，但與人源細(xì)胞的糖基化模式有顯著差異，其分泌的重組蛋白會(huì)形成α-1，3-甘露糖化，導(dǎo)致蛋白免疫原性增加、半衰期縮短。通過在酵母中準(zhǔn)確引入人源糖基轉(zhuǎn)移酶和糖苷酶，刪除超甘露糖化基因[13]，可以使酵母糖基化途徑與人糖基化途徑相似[14?15]，從而保證治療蛋白的藥代動(dòng)力學(xué)特性[16]。此外，對(duì)于釀酒酵母進(jìn)行工程化改造，使其表達(dá)融合轉(zhuǎn)運(yùn)體和人源O-FucT-1基因，可以生成末端帶有O-巖藻糖的人表皮生長因子[12]。

甲醇營養(yǎng)型酵母——畢赤酵母（Pichia pastoris）生長快，發(fā)酵細(xì)胞濃度高，可產(chǎn)生大量重組人源蛋白[17?18]。畢赤酵母系統(tǒng)能夠靈活地選擇合適的載體和兼容宿主，高效、經(jīng)濟(jì)地表達(dá)重組蛋白，保證產(chǎn)品成功開發(fā)。畢赤酵母表達(dá)載體中的AOX1基因可以驅(qū)動(dòng)所需蛋白的高表達(dá)量表達(dá)[19]，用甲醇誘導(dǎo)AOX1可使蛋白表達(dá)至極高水平，約占細(xì)胞總可溶性蛋白的30%。除可誘導(dǎo)啟動(dòng)子外，畢赤酵母載體還含有pGAP組成型啟動(dòng)子,在葡萄糖培養(yǎng)下表達(dá)水平與AOX啟動(dòng)子幾乎相同。此外，Thermo Scientific還引入了一種新的平臺(tái)Pichiap-Ink表達(dá)系統(tǒng)，通過營養(yǎng)缺陷互補(bǔ)抗性來代替抗生素，可以獲得高達(dá)12 g·L?1的蛋白表達(dá)量[20]。

除了釀酒酵母和畢赤酵母外，一些非傳統(tǒng)的酵母種類，如漢森菌多形酵母、脂酵母、裂殖酵母和乳酸克魯維酵母菌也已發(fā)展為合成各種不同特性蛋白藥物的宿主[21]。表2中列出了酵母系統(tǒng)所表達(dá)的重組蛋白藥物。

1.3 CHO細(xì)胞系（哺乳動(dòng)物）

CHO細(xì)胞系是一種來源于中國倉鼠卵巢的上皮細(xì)胞系，其可以產(chǎn)生人同源性蛋白。人體組織纖溶酶原激活劑是1986年第一個(gè)在CHO細(xì)胞系中成功生產(chǎn)并批準(zhǔn)臨床使用的重組治療蛋白[22]。隨后，越來越多的治療性蛋白質(zhì)在哺乳動(dòng)物細(xì)胞中被制造出來，并且隨著工藝的優(yōu)化，在該表達(dá)系統(tǒng)中生產(chǎn)重組蛋白的技術(shù)得到了迅速發(fā)展。

雖然CHO細(xì)胞系產(chǎn)生的重組蛋白糖基化譜與人相似，但二者并不完全相同。CHO細(xì)胞的差異糖基化是導(dǎo)致重組蛋白異質(zhì)性的重要因素，包括核心聚焦、半乳糖基化和唾液酸化[22]。通過CRISPR-Cas9技術(shù)，尤其是一種新型Cpf1酶，可以更加精準(zhǔn)的實(shí)現(xiàn)對(duì)于細(xì)胞系通路的改造，更好地實(shí)現(xiàn)糖基化途徑的人源化[23?24]。智飛生物公司生產(chǎn)的重組新冠疫苗就是將關(guān)鍵抗原成分利用改造后的CHO細(xì)胞系生產(chǎn)的，最后制成了重組蛋白亞單位疫苗[25]。

1.4 表達(dá)系統(tǒng)及宿主的篩選

在廣泛篩選表達(dá)系統(tǒng)時(shí)，蛋白的高表達(dá)量、翻譯后修飾質(zhì)量和遺傳穩(wěn)定性是主要的標(biāo)準(zhǔn)[26]。不同的表達(dá)系統(tǒng)具有各自的優(yōu)缺點(diǎn)，需要根據(jù)產(chǎn)品的特性選擇合適的系統(tǒng)和宿主（表1）。已用于生產(chǎn)重組蛋白藥物的酵母系統(tǒng)及生產(chǎn)情況見表2。優(yōu)勢(shì)宿主的篩選是生產(chǎn)異源蛋白的關(guān)鍵步驟。在選擇優(yōu)勢(shì)宿主時(shí)，通常采用高通量篩選技術(shù)，這種技術(shù)的出現(xiàn)徹底改變了宿主篩選技術(shù)領(lǐng)域，通過使用96深孔板或類似技術(shù)對(duì)多個(gè)批次實(shí)驗(yàn)進(jìn)行平行篩選[21]，提高了宿主的篩選效率。最終選擇的宿主要在產(chǎn)品質(zhì)量、滴度、特定生產(chǎn)率、工藝可行性、預(yù)期的電荷變體和糖基化配置、無或較少的聚集形成和克隆穩(wěn)定性上滿足標(biāo)準(zhǔn)[43]。

表1 重組藥物蛋白的多種表達(dá)系統(tǒng)Table 1 The different expression systems for recombinant therapeutic proteins

表2 酵母系統(tǒng)所表達(dá)的重組蛋白藥物情況Table 2 The recombinant therapeutic proteins expressed by yeast systems

2 細(xì)胞培養(yǎng)

在選擇好最佳宿主后，下一個(gè)重要環(huán)節(jié)是細(xì)胞培養(yǎng)的開發(fā)。為了更好的控制和優(yōu)化細(xì)胞培養(yǎng)過程，開發(fā)了各種新的技術(shù)和工具。

通常，在宿主發(fā)酵生產(chǎn)蛋白藥物時(shí)，通過優(yōu)化培養(yǎng)基、溫度、pH、接種量和生產(chǎn)動(dòng)力學(xué)[44]等參數(shù)來提高蛋白質(zhì)的合成。生物量增長率是促進(jìn)產(chǎn)品合成的關(guān)鍵因素[21]，對(duì)于補(bǔ)料分批生產(chǎn)技術(shù)至關(guān)重要，某些醫(yī)藥公司將宿主細(xì)胞增長率保持在小于最大增長率的特定值，通過補(bǔ)料來控制宿主細(xì)胞以特定增長率生長[12]。不過，近年來制藥行業(yè)越來越關(guān)注通過將分批生產(chǎn)轉(zhuǎn)變到連續(xù)生產(chǎn)來提高生物合成效率。Rahimi等[45]研究發(fā)現(xiàn)，與補(bǔ)料分批工藝相比，利用巴斯德畢赤酵母連續(xù)發(fā)酵乙型肝炎表面抗原（HBsAg）具有更高的效率，HBsAg抗原滴度可達(dá)4.26 mg·L?1·h?1。

在發(fā)酵工具上，使用自動(dòng)化控制的一次性生物反應(yīng)器系統(tǒng)是當(dāng)今生物制藥公司的一個(gè)新趨勢(shì)。與傳統(tǒng)的不銹鋼系統(tǒng)相比，一次性系統(tǒng)投資成本和操作成本更低，生產(chǎn)周期更短，靈活性更好，大大減少了污染的幾率。這些一次性生物反應(yīng)器及其附件可從50 L擴(kuò)大到2 000 L的規(guī)模[46]。從細(xì)胞工程到細(xì)胞培養(yǎng)方法的創(chuàng)新開發(fā)，使得單克隆抗體的產(chǎn)量從50 mg·L?1提高到5~20 g·L?1[47]。但是，一次性系統(tǒng)在產(chǎn)品安全方面也有一些限制，這種系統(tǒng)的塑料材料也會(huì)與介質(zhì)組分結(jié)合，導(dǎo)致加工性能下降[48]。

3 重組蛋白藥物分離純化進(jìn)展

通過優(yōu)化好的細(xì)胞上游培養(yǎng)工藝，特定的表達(dá)系統(tǒng)會(huì)產(chǎn)生大量的重組藥物蛋白，其中還包含一些宿主本身的蛋白、核酸等雜質(zhì)，這些雜質(zhì)可能對(duì)人體產(chǎn)生不利的生物活性。因此，對(duì)藥品的純度要求非常嚴(yán)格[11]，這就需要對(duì)產(chǎn)品蛋白進(jìn)行精度純化。此環(huán)節(jié)是重組藥物蛋白制備技術(shù)的關(guān)鍵，是決定蛋白藥物品質(zhì)的核心。單克隆抗體或任何其他蛋白（包括重組酶）一般是通過各種過濾步驟和色譜層析等技術(shù)進(jìn)行純化的[47]。色譜法是純化有價(jià)值產(chǎn)品最合適的技術(shù)，許多成熟的色譜方法已經(jīng)應(yīng)用到實(shí)際的生物制藥生產(chǎn)中[49]。

3.1 收獲澄清

細(xì)胞培養(yǎng)完成后，離心、大孔徑切向流過濾和深度過濾是用于初級(jí)細(xì)胞澄清的常用技術(shù)[50]，深度過濾和生物減重過濾器有助于二次澄清過程[51]。近年來，KSep公司開發(fā)了一種可從低轉(zhuǎn)速到高轉(zhuǎn)速的連續(xù)離心裝置，這是一個(gè)全自動(dòng)系統(tǒng)，可回收97%以上的產(chǎn)品/細(xì)胞生物量，該系統(tǒng)可用于重組蛋白和疫苗的收獲澄清。有時(shí)，在離心步驟后會(huì)增加一步深度過濾，更進(jìn)一步澄清細(xì)胞[52]。

不同的表達(dá)系統(tǒng)可能會(huì)有不同的分泌部位（圖1），導(dǎo)致收集方式不同。如在大腸桿菌中表達(dá)的重組蛋白通常以包涵體的形式積累，需要回收后在體外重新折疊這些蛋白質(zhì)，使其具有生物活性[54]。

圖1 不同表達(dá)體系的樣品收集過程[53]Fig.1 The sample collection process for different expression systems[53]

3.2 色譜分離

由于蛋白藥物混合物中含有大量不同化學(xué)性質(zhì)的雜質(zhì)，單一的色譜技術(shù)往往不足以獲得良好的分離。傳統(tǒng)的重組蛋白藥物純化工藝，是在收獲澄清后進(jìn)行超濾濃縮，隨后進(jìn)行逐級(jí)的單柱色譜分離純化（表3）[47]，在充分了解目標(biāo)蛋白和雜質(zhì)的理化性質(zhì)后，盡量減少純化步驟，一般分離純化不超過4步[54]。

隨著技術(shù)的發(fā)展，一種創(chuàng)新的固定相被開發(fā)出來，其結(jié)合了兩種分離機(jī)制（反相或HILIC和離子交換）[55]，形成一種混合模式的純化方式（表3）。Khalaf等[56]使用C8鏈和季胺功能化的Zeochem色譜柱進(jìn)行多肽的分離，流動(dòng)相采用醋酸鹽和CAN的混合液，結(jié)果證明多肽的選擇性和生產(chǎn)率提高了2倍，產(chǎn)量提高了約20%。

考慮到蛋白藥物混合物通常需要結(jié)合基于多種不同分離原理的色譜技術(shù)來提高分辨率[57]，從而產(chǎn)生多維色譜分離技術(shù)（表3）。在線多維色譜中，從第一根色譜柱流出的產(chǎn)物會(huì)立即注入第二根色譜柱，并加快分析時(shí)間[58]。通常，在分離過程中，質(zhì)譜與多維色譜聯(lián)用可提高純度[59]。

近年來，為了處理復(fù)雜生物分子混合物的純化，又開發(fā)了一種稱為多柱逆流溶劑梯度純化（MCSGP）技術(shù)[60]（表3）。MCSGP技術(shù)的原理是流動(dòng)相相對(duì)于固定相逆流運(yùn)動(dòng)，通過一系列切換閥進(jìn)行模擬，使整個(gè)過程實(shí)現(xiàn)循環(huán)和自動(dòng)化。使用MCSGP技術(shù)可以使目標(biāo)蛋白和雜質(zhì)之間的重疊峰在內(nèi)部循環(huán)，以便再加工，并且可以使用溶劑梯度進(jìn)行洗脫。這種技術(shù)已被用于多個(gè)需要加強(qiáng)純化的案例中，如單克隆抗體[65]、寡核苷酸[66]、大麻二酚[67]和多肽[68]的純化。

表3 重組蛋白藥物的不同純化方式Table 3 The purification methods of recombinant therapeutic proteins

4 重組蛋白藥物質(zhì)量控制

與化學(xué)藥物相比，重組藥物蛋白結(jié)構(gòu)復(fù)雜，穩(wěn)定性相對(duì)較差，生產(chǎn)工藝需要嚴(yán)格控制，對(duì)其進(jìn)行質(zhì)量控制也更具挑戰(zhàn)性。重組蛋白藥物的生產(chǎn)和測(cè)試受到世界各國監(jiān)管機(jī)構(gòu)的嚴(yán)格監(jiān)管，批次間的一致性至關(guān)重要。原料藥經(jīng)過純化后會(huì)根據(jù)當(dāng)前的監(jiān)管指南進(jìn)行嚴(yán)格的質(zhì)量控制測(cè)試，以確保藥品的安全性、純度、特性、效力和強(qiáng)度[36]，以便提供給診所和患者。

我國在《中華人民共和國藥典》中，已將39種重組蛋白藥物納入，這些質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)和鑒定方法在保證我國重組藥物的安全、有效和質(zhì)量可控方面發(fā)揮了重要作用[69]。

高分辨率質(zhì)譜（MS）儀器和半自動(dòng)化軟件的最新進(jìn)展推動(dòng)了基于質(zhì)譜的cGMP級(jí)重組蛋白藥物的質(zhì)量控制[70]。與目前用于重組蛋白藥物的質(zhì)量檢測(cè)的傳統(tǒng)方法相比，這種新方法是基于肽譜液相色譜-MS（LC-MS）的方法，使用串聯(lián)質(zhì)譜（MS/MS）和數(shù)據(jù)庫搜索對(duì)消化的蛋白質(zhì)產(chǎn)品進(jìn)行深入的初步表征，以評(píng)估目標(biāo)產(chǎn)品的質(zhì)量屬性。這種方法可以很好地替代用于聚糖分析的親水相互作用液相色譜、用于電荷變異分析的色譜和用于剪切變異分析的誘導(dǎo)毛細(xì)管電泳，從而提高產(chǎn)品質(zhì)量控制的效率。

5 展望

雖然在全球生物藥物領(lǐng)域中重組蛋白藥物占比不到50%，但在臨床治療上卻發(fā)揮關(guān)鍵的作用。目前，大量用于治療多種人類疾病的重組蛋白藥物，已獲批準(zhǔn)并上市。

經(jīng)過幾十年的技術(shù)發(fā)展，我國重組蛋白藥物也取得了很大的進(jìn)步，尤其是近兩年新冠疫苗的研發(fā)上。隨著分子和細(xì)胞技術(shù)的不斷發(fā)展，重組蛋白藥物的產(chǎn)量和質(zhì)量也有了很大的提高，加工周期大幅縮短。隨著基因編輯技術(shù)的發(fā)展，特別是CRISPR/Cas9等新型技術(shù)的應(yīng)用，載體工程取得新的突破，未來越來越多特定改造的細(xì)胞系將被用于重組蛋白藥物的生產(chǎn)。重組蛋白藥物的重要性也推動(dòng)著蛋白純化工藝的提升，從先前的單柱色譜純化，到混合模式色譜純化，再到在線多維色譜純化系統(tǒng)和MCSGP技術(shù)，大大提高了重組蛋白藥物的純度和回收率，縮短了純化時(shí)間。一系列技術(shù)的進(jìn)步推動(dòng)了重組蛋白藥物產(chǎn)品的開發(fā)進(jìn)程。

雖然目前在重組蛋白藥物生產(chǎn)技術(shù)上有了很大的提升，但其半衰期短的問題仍然存在，還需進(jìn)行更深入的研究，進(jìn)一步提高國內(nèi)重組蛋白藥物的長效性，推動(dòng)相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的升級(jí)和創(chuàng)新，促進(jìn)長效性蛋白藥物的開發(fā)，使我國生物醫(yī)藥行業(yè)達(dá)到國際領(lǐng)先水平。