李偉，王沖，劉嗣嘉，楊敏一，張云平

1.聊城大學(xué)東昌學(xué)院化學(xué)與生物系，山東 聊城252000；

2.聊城市人民醫(yī)院皮膚科，山東 聊城252000；

3.香港浸會大學(xué)理學(xué)院，香港999077

皮膚覆蓋于人體的表面，是人體最大的器官，皮膚微生物組是一個多樣化的生態(tài)系統(tǒng)，通過調(diào)節(jié)皮膚的微生物組成和免疫系統(tǒng)功能影響皮膚的健康狀況。皮膚微生物組因身體部位、年齡、地域和疾病等因素而存在差異，且還會受到環(huán)境、護膚品和藥物等因素的影響。研究表明，皮膚微生物組是健康皮膚環(huán)境必不可少的組成部分，微生物群落組成的改變可能導(dǎo)致皮膚失去平衡，進而引起皮膚疾病[1?2]。痤瘡作為最常見的皮膚病之一，影響全球約85%的青少年。痤瘡是免疫介導(dǎo)的慢性炎癥性毛囊皮脂腺單位的疾病，與多種因素有關(guān)，雖然尚不清楚其病因，但研究表明皮膚微生物及其變化在痤瘡的發(fā)病機理中具有重要作用[3]。

早期人們研究微生物物種及其相互作用主要通過體外培養(yǎng)的方法，這種基于菌株水平的傳統(tǒng)分離培養(yǎng)技術(shù)可以幫助人們認(rèn)識微生物的多樣性。然而許多微生物是無法經(jīng)體外培養(yǎng)的，不同微生物的生長速度及其對培養(yǎng)條件的要求也存在差異，使得培養(yǎng)分離耗時較長且不能全面挖掘微生物的多樣性[4?5]。高通量測序技術(shù)（high-throughput sequencing）的出現(xiàn)和發(fā)展有效地解決了這一問題，尤其是近年來發(fā)展迅速的宏基因組學(xué)技術(shù)，利用現(xiàn)代基因技術(shù)對樣品中的大量基因進行測序，無需分離單個物種，這使得人們能夠?qū)ξ⑸锝M的多樣性進行深入探索，并對微生物暗物質(zhì)進行表征[4]，該方法不僅可以更全面地鑒定皮膚上的微生物種類，還可以揭示微生物在轉(zhuǎn)錄組水平上對特定刺激的反應(yīng)。該技術(shù)在人體腸道微生物組的研究中發(fā)揮重要的作用，闡明了許多疾病與腸道微生物組之間的關(guān)系[6]。由于菌群數(shù)量、樣本DNA含量以及樣本采集、分析技術(shù)等原因，該技術(shù)在皮膚微生物的研究中并未得到廣泛和深入的應(yīng)用[7]。

本文通過介紹宏基因組學(xué)技術(shù)的發(fā)展背景、概述及其應(yīng)用研究進展，探討皮膚微生物與痤瘡的關(guān)系，綜述宏基因組學(xué)技術(shù)在痤瘡研究中的應(yīng)用現(xiàn)狀，并總結(jié)目前宏基因組學(xué)技術(shù)在皮膚疾病研究中存在的問題，以期為痤瘡的宏基因組研究提供參考。

1 宏基因組學(xué)技術(shù)及其應(yīng)用研究進展

1.1 發(fā)展背景

宏基因組學(xué)技術(shù)是基于基因?qū)用娴囊环N高通量測序技術(shù)。高通量測序技術(shù)又稱下一代/第二代測序技術(shù)（next-generation sequencing technology），可一次對幾十萬到幾百萬條DNA分子進行序列測定。相比傳統(tǒng)分離培養(yǎng)技術(shù)，高通量基因測序技術(shù)的出現(xiàn)使得人們能快速準(zhǔn)確地得到大量微生物基因數(shù)據(jù)，從而更加全面地認(rèn)識微生物的分布特征和功能特點。

擴增子和宏基因組學(xué)技術(shù)是微生物組研究中使用最廣泛的高通量測序技術(shù)，不僅促進了微生物組研究的快速發(fā)展，且相應(yīng)的分析方法和標(biāo)準(zhǔn)也隨之發(fā)展[8?10]。擴增子測序技術(shù)通常以16S、18S或ITS等標(biāo)志物基因作為研究對象，采用PCR的方法擴增出菌群的群落結(jié)構(gòu)，成本低廉，適合開展大規(guī)模的研究，但由于PCR的局限性及偏好性，擴增子測序技術(shù)只能達到屬水平的分辨率，雖然可以研究物種分類，但無法研究其功能。宏基因組學(xué)技術(shù)則可以彌補以上不足，其可以獲取樣本中所有生物的基因組信息，不僅能達到物種或菌株水平的分辨率，而且能提供微生物組的潛在功能信息，甚至可以挖掘出不可培養(yǎng)的微生物的基因組草圖，但同時存在價格較昂貴、易出現(xiàn)宿主的污染等缺點[8]。

1.2 宏基因組學(xué)技術(shù)概述

宏基因組學(xué)技術(shù)通過對樣本中細(xì)菌、古菌、真菌、原生動物、病毒等微生物的總DNA進行高通量測序分析，獲得微生物的群落結(jié)構(gòu)、功能特點和遺傳特征[11?12]。

宏基因組學(xué)技術(shù)的分析流程主要包括：①樣本采集；②DNA的提取；③DNA的打斷測序；④宏基因組分析，包括質(zhì)控定量、組裝注釋、物種組成和功能分析等（圖1）。目前人類微生物組數(shù)據(jù)庫質(zhì)量較高，因此基于讀長（read-based）的分析方法比較適合于人類的研究；而對于其他環(huán)境微生物，適合采用基于組裝/拼接的分析方法，將原始序列組裝成重疊群，進一步挖掘基因，甚至挖掘潛在的未培養(yǎng)微生物的基因組[8]。

圖1 宏基因組測序分析流程Fig.1 Metagenomic sequencing analysis process

1.3 宏基因組學(xué)技術(shù)的應(yīng)用現(xiàn)狀

目前，利用宏基因組學(xué)技術(shù)進行的研究明顯增加，這可以為微生物組的結(jié)構(gòu)和功能提供全面、多維度的研究，實驗權(quán)重也從培養(yǎng)方法的選擇轉(zhuǎn)移到樣品的收集、DNA的提取、測序方法的選擇、數(shù)據(jù)的處理和結(jié)果的可視化[8,13?15]。

宏基因組學(xué)技術(shù)已被應(yīng)用于各種環(huán)境中微生物組的研究，如人體、其他動物、土壤、水體、空氣等。在臨床上，通過分析疾病和健康狀態(tài)下的微生物組可以診斷多種類型的綜合征和樣本類型的傳染病[16]。宏基因組學(xué)技術(shù)在識別微生物未知基因及確定功能失調(diào)的病因方面發(fā)揮重要的作用。結(jié)合轉(zhuǎn)錄組學(xué)、代謝組學(xué)和蛋白質(zhì)組學(xué)等技術(shù)，可促進對人體微生物組的了解，為疾病診斷和治療提供新思路和策略[17]。

但該技術(shù)的應(yīng)用也存在以下問題和限制：①采樣、樣本處理、DNA提取和測序方法等尚缺乏統(tǒng)一的標(biāo)準(zhǔn)，這會導(dǎo)致分析結(jié)果存在較大的差異；②宏基因組測序?qū)?shù)據(jù)量有較高的要求，當(dāng)樣本中微生物細(xì)胞濃度低于105個·g?1時，無法測得其組成[18]；③對科研人員的計算機和生信數(shù)據(jù)分析能力有較高的要求，對于廣大微生物和醫(yī)學(xué)領(lǐng)域的研究者挑戰(zhàn)較大，通常需要跨學(xué)科合作。

2 宏基因組學(xué)技術(shù)與痤瘡

2.1 皮膚微生物

人體所有的皮膚表面均存在共生微生物，人類在出生后便開始了微生物的定殖，并在生命的最初幾年形成穩(wěn)定的共生微生物群落[19]。目前，人類皮膚上已經(jīng)鑒定出40多個細(xì)菌屬，常駐微生物優(yōu)勢菌系為放線菌門、變形菌門、厚壁菌門和擬桿菌門，微生物組的分布存在個體特異性和部位特異性[20?24]。皮膚屏障與微生物群落之間的作用是相互的，皮膚給微生物提供生存環(huán)境，當(dāng)皮膚微生物與皮膚防御機制處于平衡時，微生物可以抑制細(xì)菌的過度增殖和各種致病菌的攻擊，促進皮膚健康；當(dāng)皮膚環(huán)境發(fā)生變化時，微生物與宿主之間的平衡被打破，可能會引起皮膚疾病[25]。

2.2 痤瘡與微生物

痤瘡是一種慢性炎癥皮膚疾病，常發(fā)生于皮脂腺豐富的皮膚區(qū)域，在青少年群體中發(fā)病率高。痤瘡在不同種族青少年中的發(fā)病率高達44%～95%，但同時約50%患者可自行恢復(fù)[26]。痤瘡是免疫介導(dǎo)的慢性炎癥性疾病，大量的研究者認(rèn)為，痤瘡是青少年期面部皮膚微生物發(fā)生變化，取代了以前的兒童皮膚穩(wěn)態(tài)，皮膚菌群與免疫系統(tǒng)相互作用而自然發(fā)生的短暫性炎癥[27?29]。

痤瘡丙酸桿菌長期以來被認(rèn)為是痤瘡的致病因素，但同時其通過皮脂中甘油三酸酯的水解和釋放微生物脂肪酸以防止病原體的定殖和入侵，并促進酸性物質(zhì)的產(chǎn)生，維持皮膚表面的pH平衡[28]，因此探究痤瘡丙酸桿菌對皮膚的影響具有重要意義。痤瘡丙酸桿菌與其他皮膚分枝桿菌屬（如顆粒丙酸桿菌、貪婪丙酸桿菌）以及葡萄球菌、單甲胞菌、棒狀桿菌和共生真菌馬拉色菌共存于皮膚表面和皮脂腺毛囊中。與健康對照毛囊相比，痤瘡病灶部位更易形成痤瘡丙酸桿菌生物膜，這些生物膜以微生物結(jié)構(gòu)存在，包含金黃色葡萄球菌、角質(zhì)層細(xì)菌和馬拉色氏菌等種群[30?31]。在皮脂腺中，生物膜基質(zhì)可充當(dāng)生物膠，形成物理屏障限制皮脂排出，促進內(nèi)腔中角質(zhì)細(xì)胞的堆積，從而導(dǎo)致角質(zhì)堵塞和粉刺形成[32]。

2.3 痤瘡的宏基因組學(xué)研究進展

一項對各種人類皮膚部位的宏基因組學(xué)分析研究發(fā)現(xiàn)，個性和皮膚形貌決定了微生物組的組成[33]。比較痤瘡皮膚和健康皮膚的微生物組可以提高對痤瘡病理生理機制的理解。

目前對于痤瘡丙酸桿菌定殖引起痤瘡的認(rèn)知是早期基于培養(yǎng)的方法得出的偏見性結(jié)論[34]。營養(yǎng)豐富的人工培養(yǎng)條件，不同于皮膚干燥以及營養(yǎng)貧乏的條件，并且低估了微生物群落的多樣性。為了獲得皮膚微生物組的多樣性，研究人員開始應(yīng)用先進的測序方法以尋找保守分類標(biāo)記之外的可變序列，如16S擴增子分析或Shotgun分析收集全部基因以獲得所有常駐細(xì)菌的宏基因組[35]。宏基因組學(xué)可以獲得單核苷酸多態(tài)性以及微生物群落的代謝譜，在菌株水平上具有更高的分辨率，近年來，已成為微生物組研究的熱門技術(shù)。但由于其價格昂貴和對樣品基因負(fù)荷量的要求較高，在痤瘡微生物組的研究中，更多地采用16S擴增子技術(shù)，僅有少量研究采用宏基因組學(xué)技術(shù)。

Hall等[36]用16S擴增子和宏基因組學(xué)技術(shù)分析了不同采樣方法在痤瘡研究中的差異。采用3種采樣方法分別從20名12～40歲皮膚健康人群和痤瘡患者臉頰獲取樣品，棉拭子采集皮膚表面的微生物，毛孔條和氰基丙烯酸酯膠采集毛囊微生物。研究結(jié)果表明，棉拭子的采樣方法可獲取皮膚表面的微生物，毛孔條和氰基丙烯酸酯膠可進行毛囊采樣，其中毛孔條可分離出部分破裂的毛囊結(jié)構(gòu)及其微生物，氰基丙烯酸酯膠的采樣深度最大，可獲得完整的毛囊結(jié)構(gòu)及附屬微生物。2種毛囊采樣方法獲取的樣品具有相似的微生物物種相對豐度水平，α和β多樣性無顯著差異。與毛囊樣品相比，棉拭子獲取的皮膚表面樣品具有更高的α多樣性，痤瘡丙酸桿菌的相對豐度無顯著差異。皮膚表面和毛囊微生物群落在最豐富的物種組成上存在重疊，但某些細(xì)菌和病毒有其各自獨特的生態(tài)部位。

Fitz-Gibbon等[23]通過16S擴增子測序和shotgun宏基因組測序技術(shù)對比分析健康皮膚和痤瘡皮膚的毛囊微生物差異，使用市售毛孔條從受試者的鼻子采樣皮膚微粉刺樣品和正常毛囊樣品，結(jié)果表明，毛囊單位中常見的物種包括痤瘡丙酸桿菌、表皮葡萄球菌、肱骨丙酸桿菌和顆粒狀丙酸桿菌等，其中痤瘡丙酸桿菌占比最高。痤瘡患者痤瘡丙酸桿菌的相對豐度與健康人群比較無顯著差異。分析痤瘡丙酸桿菌16S rDNA序列10個主要核糖型的分布情況，結(jié)果表明，痤瘡患者痤瘡丙酸桿菌的種群結(jié)構(gòu)與健康人群比較差異顯著，分析原因為與痤瘡相關(guān)的菌株中含有的某些獨特基因座可能在痤瘡的發(fā)病機理中發(fā)揮重要作用。Barnard等[35]增加了噬菌體和毒性相關(guān)因子的研究，并因此提出益生菌和噬菌體療法調(diào)節(jié)皮膚微生物的治療建議。從38例痤瘡患者和30名年齡匹配的健康人群中采用毛孔條的方法采集皮膚毛囊部位樣本，通過宏基因組學(xué)Shotgun測序，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，健康人群皮膚中丙酸桿菌和痤瘡丙酸桿菌噬菌體的相對豐度較高，痤瘡患者中，皮膚菌群在物種水平和痤瘡丙酸桿菌菌株水平的多樣性更高，毒性相關(guān)因子富集且代謝合成基因豐度較低。皮膚菌群的總體毒性受宏基因組成分平衡的影響，且與毒力相關(guān)的基因編碼富含與疾病相關(guān)的痤瘡丙酸桿菌菌株的抗菌肽、細(xì)胞毒素和蛋白酶。Tao等[37]利用宏基因組測序技術(shù)對比痤瘡治療前后病變區(qū)域的微生物差異，對11例患有嚴(yán)重面部痤瘡患者進行5-氨基乙酰丙酸介導(dǎo)的光動力療法（5-aminolevulinic acid-mediated photodynamic therapy，ALA-PDT）治療，對治療前后病變區(qū)域采樣。宏基因組測序結(jié)果表明，痤瘡皮膚桿菌是最主要的物種，其次是表皮葡萄球菌和熒光假單胞菌；ALA-PDT通過殺死痤瘡丙酸桿菌、增加熒光假單胞菌和微生物群多樣性而發(fā)揮治療作用，同時，還具有抑制重度痤瘡毛囊皮脂腺單位微生物群的功能。

盡管宏基因組學(xué)技術(shù)優(yōu)勢明顯，但存在成本偏高、無標(biāo)準(zhǔn)方案可供參考、皮膚樣品中微生物含量較低、易受到宿主污染等缺點，影響測序結(jié)果的準(zhǔn)確性和全面性。因此，利用宏基因組學(xué)技術(shù)進行的皮膚微生物研究相對較少。痤瘡病灶部位不同于特應(yīng)性皮炎和銀屑病，其形成部位有毛囊結(jié)構(gòu)，因此，需研究皮膚表面和毛囊內(nèi)部的微生態(tài)，以明確其差異。不同采樣方法對基因測序分析和痤瘡微生態(tài)研究的影響也有待進一步明

確[33?34,36,38?39]。皮膚樣本中微生物含量較低，環(huán)境微生物會對其產(chǎn)生較大的影響和干擾，因此，采樣過程和后續(xù)的樣本處理及DNA提取過程均應(yīng)嚴(yán)格遵循無菌操作，最大程度減少環(huán)境微生物對結(jié)果的影響。

2.4 腸-皮軸及多組學(xué)研究

近年來，人們已經(jīng)對腸-腦軸的研究有了一定的認(rèn)識，諸多腦部相關(guān)疾病均與腸道菌群相關(guān)。在皮膚疾病的研究中，建議進行腸-皮軸研究，同時，采集健康組和疾病組的腸道和皮膚微生物樣本進行宏基因組分析。此外，在資金條件允許的情況下，進行代謝組學(xué)、病毒組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等多組學(xué)分析，對數(shù)據(jù)整合研究，解析皮膚和腸道微生物群落的結(jié)構(gòu)與功能，比較疾病組與健康組在不同水平下物種的活性豐度、基因的差異表達、代謝途徑的強弱，進而解析生物學(xué)過程的內(nèi)在機制，為痤瘡的發(fā)病機制研究和臨床治療提供支持。

3 展望

一百多年來，人們一直在研究痤瘡丙酸桿菌在痤瘡發(fā)病中的作用，但目前仍存在爭議。大量證據(jù)表明，痤瘡丙酸桿菌的不同菌種和菌株在多種細(xì)胞類型中誘導(dǎo)不同的免疫反應(yīng)，且痤瘡丙酸桿菌和表皮葡萄球菌中宿主互作和微生物互作的相關(guān)基因，在介導(dǎo)和促進痤瘡疾病中發(fā)揮重要作用。痤瘡發(fā)病機理的進一步明確還需要大量的研究，且對其中微生物所發(fā)揮作用的研究必不可少，而采樣方法和測序方法會影響研究結(jié)果和結(jié)論。宏基因組學(xué)技術(shù)可捕獲更多的樣品多樣性，達到更精細(xì)的分辨率，有望成為今后的痤瘡微生物組研究中重要的技術(shù)手段，其可打破培養(yǎng)組學(xué)和擴增子分析技術(shù)的局限，提高人們對微生物在痤瘡發(fā)病中的認(rèn)識。皮膚微生物不同于腸道微生物，其微生物含量較低，采樣過程中環(huán)境微生物會對其產(chǎn)生較大的影響和干擾，因此，采樣過程及后續(xù)的DNA提取和測序均應(yīng)嚴(yán)格遵循無菌操作，最大程度減少環(huán)境微生物對結(jié)果的影響。未來宏基因組學(xué)的研究還需要更加統(tǒng)一可靠的采樣、測序和數(shù)據(jù)分析方法及標(biāo)準(zhǔn)。此外還需從不同痤瘡種類和嚴(yán)重程度的患者獲取病灶毛囊微生物組，對不同方法治療前后微生物組的表型變化進行縱向的宏基因組學(xué)評估，并增加對痤瘡有關(guān)菌群之間的相互作用和與宿主間互作的研究，同時，進行代謝組學(xué)、病毒組學(xué)、轉(zhuǎn)錄組學(xué)等多組學(xué)綜合研究，這對于更好地理解病理生理以及制定治療策略至關(guān)重要。