田輝，王帥，劉波

中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)研究所，北京100081

枯草芽孢桿菌（Bacillus subtilis）是一類(lèi)通常被認(rèn)為安全的（generally recognized as safe，GARS）革蘭氏陽(yáng)性菌，因其具有培養(yǎng)條件簡(jiǎn)單、分泌系統(tǒng)良好、不含內(nèi)毒素等特點(diǎn)，廣泛用于食品加工、藥物研制、工程酶生產(chǎn)等方面[1?2]。B.subtilis168于1997年完成全基因組測(cè)序[3]，為從分子水平上研究B.subtilis提供了可靠的信息平臺(tái)。便捷的遺傳轉(zhuǎn)化體系是實(shí)現(xiàn)B.subtilis基因操作技術(shù)的關(guān)鍵，目前，B.subtilis主要的轉(zhuǎn)化方法包括以下幾種方法。①原生質(zhì)體轉(zhuǎn)化法[4]。原生質(zhì)體是在溶菌酶作用下芽孢桿菌消除細(xì)胞壁后的細(xì)胞，在聚乙二醇（polyethylene glycol）介導(dǎo)下，促進(jìn)細(xì)胞膜對(duì)外源DNA的吸附，進(jìn)而完成轉(zhuǎn)化；②自然感受態(tài)法[5]。通過(guò)控制芽孢桿菌的培養(yǎng)條件，將枯草芽孢桿菌從營(yíng)養(yǎng)豐富的培養(yǎng)基中轉(zhuǎn)接至營(yíng)養(yǎng)貧瘠的培養(yǎng)基中，生長(zhǎng)到特定的生長(zhǎng)階段，形成感受態(tài)；③電擊轉(zhuǎn)化法[6]。在瞬時(shí)的電脈沖下，菌體上形成小孔，使DNA分子進(jìn)入。這些方法普遍流程繁瑣，對(duì)操作技術(shù)要求極高，難以大面積推廣。

芽孢桿菌的自然感受態(tài)是細(xì)胞易于吸收外源DNA的一個(gè)特定理化狀態(tài)[7]，主要由ComX和CSF信息素組成的菌體密度感應(yīng)網(wǎng)絡(luò)介導(dǎo)[8?10]，其中ComK是一個(gè)全局調(diào)控因子，能激活晚期感受態(tài)形成相關(guān)基因的表達(dá)，主要包括ComC、ComE、ComF等DNA轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白，參與DNA斷裂降解過(guò)程的核酸酶NucA以及重組交換相關(guān)的蛋白R(shí)ecA、AddB等[11?12]，comK僅在嚴(yán)格的培養(yǎng)環(huán)境以及菌體生長(zhǎng)階段才開(kāi)始轉(zhuǎn)錄[13]，當(dāng)ComK在胞內(nèi)達(dá)到一定的閾值時(shí)，細(xì)胞即成為感受態(tài)。因此，comK的定量表達(dá)是細(xì)胞自然感受態(tài)形成的關(guān)鍵，并在B.licheniformis[14]以及B.pumilus[15]中得到應(yīng)用，Zhang等[16]在枯草芽孢桿菌B.subtilis1A751菌株lacA位點(diǎn)，以紅霉素抗性篩選標(biāo)記，整合1個(gè)木糖誘導(dǎo)啟動(dòng)子調(diào)控的Pxyl-comK表達(dá)盒，建立了該菌株高效轉(zhuǎn)化體系，對(duì)于質(zhì)粒轉(zhuǎn)化高達(dá)1×104CFU·μg?1。然而在基因組上整合一個(gè)誘導(dǎo)細(xì)胞感受態(tài)形成的元件存在兩個(gè)弊端：①菌株增加額外選擇性標(biāo)記（通常為抗生素抗性基因）；②木糖誘導(dǎo)啟動(dòng)子Pxyl存在一定的滲漏轉(zhuǎn)錄進(jìn)而使comK持續(xù)表達(dá)，細(xì)胞內(nèi)comK表達(dá)量本底高，導(dǎo)致細(xì)胞長(zhǎng)期處于自然感受態(tài)狀態(tài)，從而吸收環(huán)境（培養(yǎng)基）中DNA片段并可能整合到染色體上，致使細(xì)胞性狀發(fā)生改變。因此，誘導(dǎo)感受態(tài)形成后，再消除感受態(tài)形成的元件可有效保障細(xì)胞性狀穩(wěn)定性。

本研究通過(guò)在E.coli和B.subtilis穿梭質(zhì)粒pUBC01上引入Pxyl調(diào)控comK表達(dá)的元件，將其以游離質(zhì)粒的形式導(dǎo)入B.subtilis并獲得重組菌株B.subtilisK1，通過(guò)木糖誘導(dǎo)時(shí)間的摸索與質(zhì)粒消除等手段，確定該菌株最優(yōu)的轉(zhuǎn)化條件以及建立Pxyl?comK元件靈活的移除方法，以期在B.subtilis中創(chuàng)建一套便捷高效、不殘留篩選標(biāo)記、不影響菌株穩(wěn)定性的遺傳轉(zhuǎn)化體系。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 菌株與質(zhì)粒B.subtilisWB600為本實(shí)驗(yàn)室保存；B.subtilisSCK6購(gòu)自美國(guó)Bacillus Genetic Stock Center（BGSC）；大腸桿菌E.coliTop10感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自康為世紀(jì)有限公司；含有質(zhì)粒pUBC01的B.subtilisWB600-01為本實(shí)驗(yàn)室保存；質(zhì) 粒pUBC01[17]為 本 實(shí) 驗(yàn) 保 存；質(zhì) 粒pHY300-p43-egfp是 由 質(zhì) 粒pHY300-PLK[18]骨架 上添加有p43-egfp表達(dá)盒[19]構(gòu)建獲得，為實(shí)驗(yàn)室保存；pUBC01-Pxyl-comK為本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建；研究中所使用的引物詳見(jiàn)表1。

1.1.2 試劑與儀器高保真DNA聚合酶以及無(wú)縫克隆試劑盒購(gòu)于南京諾維贊技術(shù)有限公司；瓊脂糖購(gòu)自莫納生物科技有限公司；瓊脂糖凝膠DNA回收試劑盒及質(zhì)粒小提試劑盒購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司；限制性?xún)?nèi)切酶AscⅠ、PacⅠ購(gòu)自賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；卡那霉素和四環(huán)素購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司；引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；其他試劑均為進(jìn)口或國(guó)產(chǎn)分析純。

PCR儀及基因電擊導(dǎo)入儀（Bio-Rad公司）；立式冷凍離心機(jī)（HITACHI公司）；電泳儀（北京君意東方電泳設(shè)備有限公司）；凝膠成像分析系統(tǒng)（天能科技有限公司）；恒溫金屬儀（杭州奧盛儀器有限公司）；恒溫培養(yǎng)箱（上海一恒科技有限公司）；恒溫培養(yǎng)振蕩器（上海旻泉儀器有限公司）；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)（上海尤尼科儀器有限公司）；藍(lán)光透射儀[天根生化科技（北京）有限公司]。

1.1.3 培養(yǎng)基及相關(guān)試劑LB液體培養(yǎng)基（固體添加2%瓊脂粉）：1%蛋白胨、0.5%酵母膏、1%氯化鈉，121℃滅菌；碘液：2 g碘化鉀，1 g碘，將碘化鉀溶于少量水中，全部溶解后再加碘，攪拌充分溶解后，加水定容至300 mL，避光保存。

1.2 研究方法

1.2.1 質(zhì)粒pUBC01-Pxyl-comK的構(gòu)建以B.sub?tilisSCK6基因組為模板，引物PxylF/TTRR擴(kuò)增Pxyl-comK表達(dá)盒，將其擴(kuò)增片段凝膠回收后，重組法連入AscⅠ和PacⅠ同時(shí)酶切后的pUBC01質(zhì)粒，熱激轉(zhuǎn)化E.coliTop10感受態(tài)，涂布含有50 μg·mL?1卡那霉素的LB平板，過(guò)夜培養(yǎng)。用質(zhì)粒上引物01seqF/01seqR，進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證，取陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子的菌液送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序，選取測(cè)序正確的菌株，用質(zhì)粒小提試劑盒提取pUBC01-Pxyl-comK質(zhì)粒。采用高滲法[6]轉(zhuǎn)化B.subtilisWB600，得到菌株B.subtilisK1。

表1 研究所用引物列表Table 1 List of primers used in research

1.2.2B.subtilisK1的優(yōu)化分別挑取含有質(zhì)粒pUBC01的B.subtilisWB600-01和 含 有 質(zhì) 粒pUBC01-Pxyl-comK的B.subtilisK1菌株，置于含有20 μg·mL?1卡那霉素的50 mL LB液體培養(yǎng)基中，37℃，220 r·min?1，過(guò)夜培養(yǎng)，分別將菌液按5%的比例轉(zhuǎn)接至新鮮的含有20 μg·mL?1卡那霉素的100 mL LB液體培養(yǎng)基中，B.subtilisWB600-01轉(zhuǎn)接1組，B.subtilisK1轉(zhuǎn)接2組（每組設(shè)3個(gè)平行）。培養(yǎng)OD600至1.0左右時(shí)，在B.subtilisWB600-01以及B.subtilisK1其中1組中添加木糖至終濃度為1%（質(zhì)量體積比分?jǐn)?shù)），B.subtilisK1的另一組不添加木糖。每隔1 h取出100 μL新鮮的培養(yǎng)液，添加100 ng的pHY300-P43-egfp質(zhì)粒，37℃，220 r·min?1，共培養(yǎng)1.5 h，涂布含有10 μg·mL?1四環(huán)素的LB平板，37℃，倒置培養(yǎng)，次日統(tǒng)計(jì)轉(zhuǎn)化子數(shù)目。挑取轉(zhuǎn)化子于450 μL LB（含有10 μg·mL?1四環(huán)素）的EP管中，37℃，220 r·min?1，培養(yǎng)3 h，置于藍(lán)光透射儀下觀察熒光。

1.2.3 質(zhì)粒pUBC01-Pxyl-comK的消除分別取含有pHY300-P43-egfp質(zhì)粒的B.subtilisK1菌株的100 μL菌液，于含有10 μg·mL?1四環(huán)素的5 mL LB培養(yǎng)液中，以及同時(shí)含有10 μg·mL?1四環(huán)素和20 μg·mL?1卡那霉素的5 mL LB培養(yǎng)液中，在2類(lèi)LB培養(yǎng)液中各添加1%的木糖，培養(yǎng)12 h后，稀釋涂布于對(duì)應(yīng)抗性LB平板上，37℃倒置培養(yǎng)。長(zhǎng)出單菌落后，挑取單菌，同時(shí)點(diǎn)接至四環(huán)素抗性（10 μg·mL?1）和卡那霉素抗性（20 μg·mL?1）LB平板，對(duì)比2個(gè)平板的菌落生長(zhǎng)情況，同時(shí)，通過(guò)引物01seqF/01seqR驗(yàn) 證pUBC01-Pxyl?comK，引 物pHseqF/pHseqR驗(yàn)證pHY300-p43-egfp。

1.2.4 菌株B.subtilisK1基因敲除選擇B.subti?lisK1的α-淀粉水解酶編碼基因（amyE）作為整合位點(diǎn)，以B.subtilisWB600基因組為模板，用amyE-LF和amyE-LR擴(kuò) 增amyE左 臂 同 源 序 列amy-L；用amyE-RF和amyE-RR擴(kuò)增右臂同源序列amy-R；用Tet-F/Tet-R擴(kuò)增pHY300-P43-egfp上四環(huán)素抗性表達(dá)盒Tet；同時(shí)以amyE-L，amyE-R以及Tet回收片段為模板，用引物amyE-LF/amyE-RR，通過(guò)overlap-PCR程序?qū)⑸鲜?個(gè)片段融合成片段LTR，回收LTR片段并轉(zhuǎn)化B.subtilisK1誘導(dǎo)感受態(tài)細(xì)胞，涂布含有10 μg·mL?1四環(huán)素LB平板，37℃倒置培養(yǎng)。次日，挑取轉(zhuǎn)化子，用位點(diǎn)側(cè)翼引物amyE-VF/amyE-VR進(jìn)行PCR驗(yàn)證。分別挑取WB600菌株以及ΔamyE菌株，點(diǎn)接于含有1%淀粉的LB固體平板上，培養(yǎng)24 h，均勻噴灑碘液，觀察水解透明圈的形成情況。

2 結(jié)果與分析

2.1 表達(dá)盒Pxyl-comK擴(kuò)增以及穿梭質(zhì)粒的構(gòu)建

構(gòu)建含有Pxyl?comK表達(dá)盒的穿梭質(zhì)粒，在枯草芽孢桿菌中建立以游離型質(zhì)粒為基礎(chǔ)的木糖誘導(dǎo)感受態(tài)的遺傳轉(zhuǎn)化體系。以B.subtilisSCK6菌株基因組為模板，擴(kuò)增Pxyl-comK表達(dá)盒，片段大小為2.4 kb（圖1A），回收的片段連入pUBC01質(zhì)粒，通過(guò)質(zhì)粒上引物驗(yàn)證，pUBC01質(zhì)粒對(duì)照為0.3 kb，陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子為2.7 kb。挑取的4個(gè)轉(zhuǎn)化子均為陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子，測(cè)序正確后，將pUBC01-Pxyl?comK質(zhì)粒電擊轉(zhuǎn)化B.subtilisWB600得到菌株B.subtilisK1，即完成了誘導(dǎo)感受態(tài)菌株的創(chuàng)建（圖1B）。

圖1 Pxyl?comK表達(dá)盒的擴(kuò)增以及pUBC01-Pxyl-comK的PCR鑒定Fig.1 Amplification of Pxyl?comK cassette and verification of plasmid pUBC01-Pxyl-comK by PCR

2.2 木糖誘導(dǎo)B.subtilis K1感受態(tài)的優(yōu)化及熒光觀察

含有質(zhì)粒pUBC01的B.subtilisWB600-01在添加木糖和pHY300-P43-egfp質(zhì)粒共培養(yǎng)后，未產(chǎn)生轉(zhuǎn)化子，說(shuō)明B.subtilisWB600出發(fā)菌株，在LB培養(yǎng)條件下，不會(huì)吸收外源DNA。對(duì)于菌株B.subtilisK1，隨著木糖誘導(dǎo)時(shí)間的延長(zhǎng)，pHY300-P43-egfp質(zhì)粒轉(zhuǎn)化效率逐步升高，在第4小時(shí)，轉(zhuǎn)化效率最高，達(dá)到4.8×103CFU·μg?1；到第5～6小時(shí)，轉(zhuǎn)化效率逐漸降低，可能ComK在胞內(nèi)維持合適的濃度，更利于感受態(tài)的形成以及質(zhì)粒轉(zhuǎn)化。此外，不添加木糖的B.subtilisK1對(duì)照組，從2 h開(kāi)始，有少量的轉(zhuǎn)化子出現(xiàn)，可能是木糖誘導(dǎo)啟動(dòng)子Pxyl存在一定的本底轉(zhuǎn)錄而導(dǎo)致comK滲漏表達(dá)，促進(jìn)細(xì)胞形成感受態(tài)而吸收外源DNA片段（圖2）。

木糖誘導(dǎo)的B.subtilisK1感受態(tài)添加質(zhì)粒pHY300-p43-egfp后轉(zhuǎn)化效率顯著提高，產(chǎn)生的轉(zhuǎn)化子對(duì)10 μg·mL?1的四環(huán)素表現(xiàn)出明顯的抗性。由于轉(zhuǎn)化質(zhì)粒上含有p43-egfp表達(dá)盒，可通過(guò)熒光檢測(cè)判斷陽(yáng)性轉(zhuǎn)化子。隨機(jī)挑取的8個(gè)轉(zhuǎn)化子均能產(chǎn)生顯著的熒光，進(jìn)一步證明該木糖誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化體系具備較高的準(zhǔn)確性（圖3）。

2.3 pUBC01-Pxyl-comK質(zhì)粒的消除

由于Pxyl-comK存在微量的本底轉(zhuǎn)錄，有影響菌株穩(wěn)定性的風(fēng)險(xiǎn)，可采取質(zhì)粒消除的策略進(jìn)行規(guī)避。挑取含有綠色熒光的轉(zhuǎn)化子，分別在添加1%木糖的單抗或雙抗LB培養(yǎng)液中過(guò)夜培養(yǎng)，稀釋涂布，挑取單菌到四環(huán)素抗性LB平板上，同時(shí)，轉(zhuǎn)接到卡那霉素抗性LB平板上。雙抗培養(yǎng)條件下，挑取的單菌既能在四環(huán)素平板上生長(zhǎng)，又能在卡那霉素平板生長(zhǎng)，說(shuō)明雙抗培養(yǎng)能使WB600同時(shí) 保 持pUBC01-Pxyl?comK和pHY300-p43-egfp質(zhì)粒（圖4A、B）。四環(huán)素單抗培養(yǎng)條件下，挑取的96個(gè)單菌中，只有7個(gè)對(duì)卡那霉素有明顯的抗性，即大部分菌株實(shí)現(xiàn)pUBC01-Pxyl?comK質(zhì)粒成功丟失（圖4C、D）。對(duì)C平板上的1～5號(hào)單菌進(jìn)行PCR驗(yàn)證，挑取的5個(gè)單菌含有pHY300-p43-egfp質(zhì)粒的擴(kuò)增條帶，而不含有pUBC01-Pxyl?comK質(zhì)粒的擴(kuò)增條帶，與抗性實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致，說(shuō)明pUBC01-Pxyl?comK作為可移動(dòng)的誘導(dǎo)感受態(tài)質(zhì)粒，可在添加卡那霉素條件下培養(yǎng)，使之在B.subtilisK1穩(wěn)定遺傳，以便后續(xù)的遺傳轉(zhuǎn)化，也可完成單輪轉(zhuǎn)化后使之消除，以保障菌株性狀穩(wěn)定（圖5）。

2.4 WB600的基因amyE的敲除

為探究木糖誘導(dǎo)B.subtilisK1感受態(tài)可否適用于染色體基因的編輯，構(gòu)建以四環(huán)素抗性基因Tet為篩選標(biāo)記的PCR整合片段。分別擴(kuò)增了amyE-L、amyE-R以及Tet片段，三者通過(guò)overlap-PCR融合在一起，形成LTR整合片段（圖6A），回收PCR產(chǎn)物直接轉(zhuǎn)化B.subtilisK1感受態(tài)，用位點(diǎn)側(cè)翼引物amyE-VF/VR驗(yàn)證轉(zhuǎn)化子，WB600出發(fā)菌株理論條帶大小為2.1 kb，發(fā)生位點(diǎn)整合的轉(zhuǎn)化子理論條帶為2.8 kb。挑取的4個(gè)單菌的條帶顯著高于對(duì)照，且符合預(yù)期大小，說(shuō)明PCR產(chǎn)物可與位點(diǎn)發(fā)生同源雙交換整合（圖6B）。amyE為α-淀粉酶，可催化淀粉水解，并通過(guò)淀粉碘液反應(yīng)鑒定，該酶對(duì)應(yīng)的編碼序列也是芽孢桿菌中常用的整合位點(diǎn)[20?21]。在含有1%可溶性淀粉的LB平板上，噴灑碘液后，WB600野生型有明顯的透明圈產(chǎn)生，而amyE敲除菌株不產(chǎn)生透明圈，且菌體形態(tài)較?。▓D7）。上述的實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明該木糖誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化體系同樣適用于對(duì)芽孢桿菌染色體的基因編輯，是一套快速便捷且完善的遺傳轉(zhuǎn)化體系。

圖2 B.subtilis K1菌株不同誘導(dǎo)時(shí)間的單位轉(zhuǎn)化效率Fig.2 The transformation efficiency of strain B.subtilis K1 under different induced times

圖3 轉(zhuǎn)化結(jié)果以及熒光的觀察Fig.3 The result of transformation and fluorescence visualization

圖4 抗生素抗性驗(yàn)證質(zhì)粒pUBC01-Pxyl?comK的消除Fig.4 Identification of plasmid pUBC01-Pxyl?comK elimination by antibiotic resistance assay

圖5 PCR驗(yàn)證pHY300-p43-egfp以及pUBC01-Pxyl-comK質(zhì)粒Fig.5 PCR verification of pHY300-p43-egfp and pUBC01-Pxyl-comK plasmids

圖6 整合片段的擴(kuò)增及amyE敲除菌株的PCR驗(yàn)證Fig.6 Amplification of integration fragments and PCR vertification of strains with amyE knocked out

3 討論

枯草芽孢桿菌因具有蛋白分泌能力強(qiáng)、培養(yǎng)發(fā)酵方便等特點(diǎn)，廣泛地應(yīng)用于酶的生產(chǎn)以及小分子化合物的合成。除了深入對(duì)芽孢桿菌代謝調(diào)控機(jī)制的研究以及發(fā)酵培養(yǎng)工藝的優(yōu)化，構(gòu)建快速便捷、成功率高的遺傳操作技術(shù)，也是加快芽孢桿菌應(yīng)用的重要手段。

圖7 淀粉水解實(shí)驗(yàn)Fig.7 Starch hydrolysis experiment

選取枯草芽孢桿菌感受態(tài)形成的關(guān)鍵調(diào)控基因comK，將含有Pxyl-comK表達(dá)盒的質(zhì)粒轉(zhuǎn)化B.subtilisWB600中，實(shí)現(xiàn)了質(zhì)粒pHY300-P43-egfp高達(dá)4.8×103CFU·μg?1的轉(zhuǎn)化效率，能達(dá)到質(zhì)粒常規(guī)轉(zhuǎn)化以及突變體建庫(kù)的要求，后期可通過(guò)優(yōu)化培養(yǎng)基成分以及木糖的誘導(dǎo)濃度，或采用多聚體質(zhì)粒轉(zhuǎn)化等方法進(jìn)一步提高其轉(zhuǎn)化效率[6,22?23]。此外，由于Pxyl啟動(dòng)子有一定的本底轉(zhuǎn)錄[24]，即使在不添加木糖培養(yǎng)條件下，滲漏表達(dá)的ComK也會(huì)調(diào)控下游感受態(tài)形成相關(guān)基因的轉(zhuǎn)錄，使細(xì)胞吸收外源DNA，影響菌體生長(zhǎng)以及性狀的穩(wěn)定性。將Pxyl-comK表達(dá)盒搭載在游離質(zhì)粒上，在完成誘導(dǎo)轉(zhuǎn)化后，可在無(wú)選擇壓力條件下連續(xù)培養(yǎng)，質(zhì)粒會(huì)丟失，避免因comK滲漏表達(dá)而導(dǎo)致的菌株性狀不穩(wěn)定。此外，該誘導(dǎo)芽孢桿菌感受態(tài)的方法同樣適用于染色體基因的編輯，含有同源臂以及四環(huán)素抗性篩選標(biāo)記的PCR產(chǎn)物可直接轉(zhuǎn)化芽孢桿菌誘導(dǎo)感受態(tài)，敲除amyE基因，使B.subtilisWB600失去水解淀粉的活性。在芽孢桿菌中建立的木糖誘導(dǎo)型遺傳轉(zhuǎn)化體系與常規(guī)芽孢桿菌的轉(zhuǎn)化體系[4?6]相比，具有流程簡(jiǎn)便、周期短等優(yōu)點(diǎn)，充分利用Comk調(diào)控芽孢桿菌感受態(tài)形成的特性，又能通過(guò)質(zhì)粒消除規(guī)避其造成的負(fù)面影響，是一套較完善的芽孢桿菌轉(zhuǎn)化體系，未來(lái)可在該誘導(dǎo)感受態(tài)的基礎(chǔ)上，結(jié)合誘導(dǎo)毒性蛋白MazF這種負(fù)向篩選的手段[25?26]，在枯草芽孢桿菌中建立綠色的、無(wú)篩選標(biāo)記殘留的基因敲除體系，從而避免由于抗生素抗性基因漂移造成的風(fēng)險(xiǎn)。