姚利蘭綜述，陳鵬宇審校

0 引 言

單基因病又稱單基因遺傳病或單基因缺陷，通常指因點突變、片段缺失/重復(fù)、移碼突變、融合基因、動態(tài)突變等單個基因變異而導(dǎo)致的疾病。人類單基因疾病種類繁多，超過10000種，并且每年以約10～50種的速度不斷增加[1]。同時，人群中約3%～5%的人患某種單基因病，面臨妊娠、診斷、治療等多重難題，給患兒本身、孕婦及其家庭帶來沉重的身心壓力及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)。近年來，單基因遺傳病植入前遺傳學(xué)檢測(preimplantation genetic testing for monogenic/ single gene defects，PGT-M)技術(shù)的蓬勃發(fā)展[2]，可有效阻斷單基因病的垂直傳遞，通過加強遺傳咨詢和生殖管理，為人類輔助生殖及提高人口質(zhì)量提供了新的選擇和希望，日益成為單基因遺傳病預(yù)防控制的重要手段。PGT-M的檢測技術(shù)的發(fā)展促使植入前胚胎中可檢測到的遺傳缺陷數(shù)量及精度不斷提高。同時，隨著單基因病罹患率增加、人口結(jié)構(gòu)和生育意識的變化，單基因病診治需求呈現(xiàn)出快速增長的趨勢。隨之，引發(fā)了一系列PGT-M技術(shù)臨床應(yīng)用相關(guān)倫理問題的熱議。因此，有必要對PGT-M的檢測技術(shù)發(fā)展歷程、應(yīng)用范圍和現(xiàn)狀以及相關(guān)倫理問題等作一綜述，以期為臨床應(yīng)用提供參考。

1 PGT-M的新定義

PGT-M于2017年國際輔助生殖技術(shù)監(jiān)督委員會(ICMART)和世界衛(wèi)生組織(WHO)最新命名規(guī)范提出。該命名規(guī)范以植入前遺傳學(xué)檢測(preimplantation genetic testing , PGT)取代并涵蓋了原來的植入前遺傳學(xué)診斷(preimplantation genetic diagnosis, PGD)和植入前遺傳學(xué)篩查(preimplantation genetic screening, PGS)，指對卵母細(xì)胞(極體)或胚胎(卵裂期或囊胚期)DNA的HLA基因分型和遺傳異常進(jìn)行的檢測分析[3]，也就是所謂的“第三代試管嬰兒”。同時，進(jìn)一步將PGT細(xì)分為HLA分型的植入前遺傳學(xué)檢測(PGT-HLA)、非整倍體植入前遺傳學(xué)檢測(PGT for aneuploidies, PGT-A)、結(jié)構(gòu)變異植入前遺傳學(xué)檢測(PGT for chromosomal structural rearrangements, PGT-SR)以及PGT-M[2-4]。其中，PGT-M被明確定義為針對單基因遺傳病或單基因缺陷在體外受精胚胎植入之前對胚胎進(jìn)行遺傳學(xué)檢測的方法[5]。其意義在于PGT-M可作為單基因遺傳病的一級預(yù)防措施，識別、排除攜帶單基因異常的致病突變胚胎，選擇正常胚胎進(jìn)行移植，進(jìn)而阻斷單基因遺傳病的垂直傳遞，避免相關(guān)缺陷兒的降生。

2 PGT-M技術(shù)的發(fā)展歷程

1990年，Handyside等[6]首次報道了基于聚合酶鏈反應(yīng)(polymerase chain reaction, PCR)手段進(jìn)行Y染色體特異性重復(fù)區(qū)段標(biāo)記檢測以避免伴X-性連鎖隱性遺傳病的男胎出生，開創(chuàng)了PGT-M在人類輔助生殖領(lǐng)域中應(yīng)用的先河。PGT-M經(jīng)歷了極體-卵裂球-囊胚期滋養(yǎng)外胚層細(xì)胞三個階段[7-10]，從一代試管嬰兒技術(shù)到第三代試管嬰兒技術(shù)跨越了30年。為盡可能的避免胚胎損傷和影響胚胎后期發(fā)育，并建立較為準(zhǔn)確的檢測體系，一直以來PGT-M只能是針對單細(xì)胞水平進(jìn)行的檢測，我們面臨的最大的挑戰(zhàn)從早期采用技術(shù)中面臨的DNA量不足的難題轉(zhuǎn)向現(xiàn)在采用全基因組擴增技術(shù)(whole gene amplification, WGA)后的等位基因脫扣(allele dropout, ADO)等問題。一系列技術(shù)的發(fā)展與成熟使得PGT-M的診斷能力逐漸提高，解決ADO問題的能力成為了評估診斷準(zhǔn)確性的關(guān)鍵。發(fā)展至今，PGT-M的檢測方式主要分為直接檢測和間接檢測。直接檢測法指利用一系列的技術(shù)對變異位點進(jìn)行直接檢測，主要包括PCR[11]、WGA技術(shù)[12]以及基于WGA進(jìn)行的熒光原位雜交技術(shù)(fluorescence in situ hybridization, FISH)、比較基因組雜交或微陣列比較基因組雜交技術(shù)(comparative genomic hybridization, CGH and array comparative genomic hybridization, CGH-array)[13]、單核苷酸多態(tài)性微陣列(single nucleotide polymorphism array, SNP array)[14]、高通量測序技術(shù)(high-throughput sequencing, HTS)等；而間接檢測方法中最常見的就是單倍型連鎖分析法[15]。目前包括單細(xì)胞全基因組測序技術(shù)在內(nèi)的直接檢測方法尚不能有效解決ADO的問題，而單倍型連鎖分析作為一種可規(guī)避該問題的間接檢測和分析方法被廣泛應(yīng)用于臨床。

2.1PCRPCR技術(shù)是最早用于PGT-M的檢測技術(shù)，通過定制引物，可針對DNA序列的特定變異進(jìn)行檢測[16]。但PCR受限于技術(shù)本身及單細(xì)胞樣本，操作過程中極易發(fā)生DNA的丟失或污染，導(dǎo)致擴增失敗或擴增效率較低。此外，自發(fā)的細(xì)胞裂解和無核片段或退化細(xì)胞的活檢也是導(dǎo)致擴增效率降低的其他原因。因此，在早期對胚胎單細(xì)胞水平的檢測局限在于無法獲取足夠量的DNA模板[17]。

2.2WGA因為PGT能用的胚胎細(xì)胞較少，WGA的出現(xiàn)成功解決了單細(xì)胞水平檢測中DNA不足的難題[20]。近10年來，WGA技術(shù)取得了巨大的進(jìn)步，主要包含3類技術(shù)。第一類是基于PCR發(fā)展而來的引物延伸預(yù)擴增法(primer extension preamplification, PEP)[18]和簡并寡核苷酸引物聚合酶鏈反應(yīng)(degenerate oligonucleotide primed PCR, DOP-PCR)[19]技術(shù)，二者是較早應(yīng)用單細(xì)胞的擴增技術(shù)，均只能對特異位點擴增，且存在嚴(yán)重的擴增偏倚問題，擴增前后偏倚倍數(shù)分別為220倍和61倍左右，因極高的錯誤率使其在臨床實際應(yīng)用中被其他發(fā)展起來的技術(shù)取代。2001年，Lasken等[20]提出基于Φ29聚合酶和等溫隨機引物擴增的多重置換擴增技術(shù)，成為單細(xì)胞擴增的又一類新技術(shù)，與PEP和DOP-PCR比較，可將DNA模板擴增約106倍，擴增前后偏倚率顯著下降，但擴增偏倚率依然較高(約50%)，單基因變異檢測仍無法適用，后續(xù)主要用于拷貝數(shù)變異分析。第三類是近年來發(fā)展的一項新技術(shù)——多重退火環(huán)狀循環(huán)擴增法[21]，與前面的技術(shù)相比，除使用隨機引物外，還利用了新的共同序列和溫度循環(huán)，極大降低了對模板量的要求，擴增較均勻，擴增前后偏倚倍數(shù)僅2倍左右，可滿足對單個細(xì)胞的檢測，并且該技術(shù)的基因組覆蓋度達(dá)到了90%以上，已在多領(lǐng)域應(yīng)用。總體而言，WGA技術(shù)雖然同PCR一樣無法避免單細(xì)胞擴增導(dǎo)致的ADO、污染等問題。但與PCR技術(shù)相比，全基因組擴增技術(shù)是一種單細(xì)胞擴增困難的有效解決辦法，顯著降低了擴增偏倚率和ADO，同時使得DNA模板呈線性擴增，為全基因組大規(guī)模研究提供了保障。

2.3FISHFISH技術(shù)的原理是依賴帶熒光色素的特異性DNA探針和染色體特異序列雜交，通過熒光顯微鏡觀察，對單細(xì)胞水平多個靶標(biāo)進(jìn)行定位、定量分析DNA的表達(dá)狀況。該技術(shù)是最早用于胚胎植入前染色體異常的檢測技術(shù)，尤其在性別選擇、非整倍體檢測中應(yīng)用較多[22]，但能檢測的染色體數(shù)目較少，僅針對13、18、21、X和Y染色體，且雜交能力有限、信號易重疊、多次檢測又會發(fā)生DNA降解，分辨率較低，現(xiàn)已逐漸被其他方法所取代[23]。

2.4CGH-arrayCGH技術(shù)的本質(zhì)是消減雜交技術(shù)與FISH技術(shù)的結(jié)合，利用熒光染料分別對待測胚胎和正常樣本進(jìn)行熒光標(biāo)記，并與正常細(xì)胞中期染色體進(jìn)行共雜交，然后采用參照組與對照組的熒光強度比率來反映待測樣本中DNA表達(dá)差異量，再借助于圖像分析技術(shù)實現(xiàn)DNA序列拷貝數(shù)變異及變異定位的檢測[24]。最重要的是該技術(shù)彌補了FISH技術(shù)的染色體檢測覆蓋不足的缺點。CGH-array技術(shù)，是CGH與基因芯片相結(jié)合的技術(shù)，較CGH技術(shù)的靈敏度、精確度、自動化程度更高，主要用于嵌合體、非平衡易位、微缺失、微重復(fù)等異常的檢測，但仍無法檢測DNA序列的變化、平衡重排(羅氏易位、相互易位、倒位)、UPD和三倍體等，準(zhǔn)確性較低[14,21]。

2.5SNP arraySNP array技術(shù)也稱芯片技術(shù)，其原理是將大量SNP位點固定在芯片上，然后再與樣品雜交捕獲、激光掃描，可通過全基因組水平的SNP單倍型連鎖分析，檢測所有染色體的數(shù)目或結(jié)構(gòu)變異，區(qū)分正常及染色體平衡易位或倒位、UPD、三倍體等[24,25]。通常，SNP芯片含有大約30萬個檢測位點，與FISH技術(shù)相比，其位點數(shù)量顯著增加，這些位點幾乎覆蓋了整個基因組所有已知的基因或染色體片段，理論上可獲知染色體的全部情況，且分辨率高，可達(dá)1.5kb[26-28]。但該技術(shù)的缺點是技術(shù)要求高、重復(fù)性差、費用昂貴，無法檢測單堿基變異。

2.6HTSHTS最早是從焦磷酸測序的原理上發(fā)展而來的。自10余年前HTS首次用于植入前遺傳學(xué)檢測以來，逐步實現(xiàn)了非整倍體、結(jié)構(gòu)變異、堿基變異的檢測，成為了PGT-M領(lǐng)域最有潛力的技術(shù)。隨著二代測序技術(shù)(next generation sequencing, NGS)的不斷成熟，NGS幾乎是HTS技術(shù)代名詞。盡管三代、四代測序技術(shù)已經(jīng)出現(xiàn)，但仍面臨許多挑戰(zhàn)，現(xiàn)主要應(yīng)用于科研平臺，目前各大基因檢測公司針對PGT-M領(lǐng)域的應(yīng)用仍以二代測序技術(shù)為主要平臺。但是，基于NGS的全基因組檢測在PGT-M上的應(yīng)用價格昂貴，操作繁瑣且生物信息分析過程復(fù)雜，使其無法作為一種常規(guī)的臨床應(yīng)用的檢測方式[19,29]。此外，NGS與其他技術(shù)直接對單個胚胎細(xì)胞進(jìn)行檢測均面臨樣本量的不足、DNA模板量極低的客觀現(xiàn)實[30]。盡管WGA技術(shù)的產(chǎn)生為后續(xù)大規(guī)模的研究提供了保障，但由于起始模板量極低(單個細(xì)胞DNA含量僅6～10pg)，模板成倍擴增隨之產(chǎn)生ADO的問題，是當(dāng)前直接檢測面臨的主要挑戰(zhàn)[12,31]。因此，直接對胚胎突變位點進(jìn)行檢測的結(jié)果將變得不可靠，易造成誤診。

2.7單倍型分析技術(shù)單倍型分析技術(shù)通過短串聯(lián)重復(fù)序列或SNP單倍型連鎖分析，在疾病基因定位識別、探索順式互作在基因表達(dá)調(diào)控中的作用、種群歷史分析、進(jìn)化遺傳學(xué)研究等方面發(fā)揮著重要作用。2006年，Renwick等[32]率先提出“植入前單倍型分析”概念。植入前單倍型分析是指在體外受精-胚胎移植之前，基于單倍型連鎖分析，利用一系列檢測手段對胚胎的遺傳標(biāo)記進(jìn)行檢測，推斷親本間同源染色體不同遺傳位點的組合，判斷變異來源，對突變基因進(jìn)行定位分析。這種基于疾病相關(guān)基因內(nèi)部和附近的多個遺傳標(biāo)記的檢測方式，借助特定位點的靶標(biāo)檢測，設(shè)計不同的試劑盒以涵蓋更多的變異，進(jìn)而可實現(xiàn)整條染色體的疾病定位及病因分析，可間接規(guī)避特定位點的高ADO問題，將正常染色體與突變基因所在的染色體區(qū)分開來，展示了其極高的準(zhǔn)確性和可靠性[33-35]。因此，目前市面上基于NGS的單倍型分析技術(shù)被廣泛應(yīng)用于臨床作為單基因病胚胎植入前遺傳學(xué)檢測的解決方案，針對特定疾病進(jìn)行精細(xì)化設(shè)計及檢測，大幅降低了檢測成本，具有高靈敏度、高準(zhǔn)確性、高檢出率，適用范圍廣等優(yōu)點。但在一些特殊情況下單倍型分析法也面臨著嚴(yán)峻的挑戰(zhàn)，如利用家系推斷法推斷單倍型時在家系成員缺失或難以獲取時將無法實現(xiàn)[36]；其次，受連鎖不平衡的影響，借助群體數(shù)據(jù)庫的群體推斷法往往會遺漏群體中極低突變率的個體，最終導(dǎo)致漏診[35]；此外，對于一些新發(fā)變異，這里指父母無突變而子代存在突變的情形，單倍型分析法也易出現(xiàn)漏診[36-38]。因此，一種既能直接獲得單倍型(只需檢測夫妻雙方樣本及胚胎樣本)又能兼顧成本的方法將是今后發(fā)展的方向。

3 PGT-M的應(yīng)用范圍

單基因病遵循孟德爾遺傳規(guī)律，從親代向子代傳遞，故PGT-M的常規(guī)適應(yīng)證取決于潛在的遺傳變異背景。PGT-M通過一系列技術(shù)及分析方法可診斷胚胎是否攜帶異常單基因突變，并獲知其變異的親本來源。PGT-M的應(yīng)用范圍主要包括：①父母均攜帶已知基因的常染色體隱性遺傳病，如囊性纖維化、地中海貧血、鐮狀細(xì)胞病等；②父母一方或雙方常染色體顯性遺傳病，如脊髓小腦共濟(jì)失調(diào)癥、亨廷頓氏舞蹈病等；③X性連鎖疾病，如血友病等；④父母具有不完全外顯率的突變，如可導(dǎo)致癌癥易發(fā)綜合征的BRCA1/2突變；⑤父母攜帶某些染色體平衡易位或倒置；⑥HLA分型，尋找相同HLA配型進(jìn)行干細(xì)胞治療；⑦不明原因復(fù)發(fā)性流產(chǎn)，旨在減少反復(fù)流產(chǎn)引起的并發(fā)癥和副作用[238-40]。隨PGT檢測能力的不斷提高，越來越多的單基因病被納入其中。值得注意的是，PGT-M作為國家、社會、家庭控制生育質(zhì)量、實現(xiàn)優(yōu)生優(yōu)育而采取的積極的輔助生殖措施，雖然已在世界各地廣泛應(yīng)用，但大多數(shù)國家將PGT-M的適應(yīng)證僅限制于嚴(yán)重性單基因遺傳病[6-7]。而不對其他類型單基因疾病進(jìn)行檢測，如在下述情況下卻不適用：①父母尚未確定是否存在明確遺傳疾病；②性別選擇，如平衡男女比例；③表型選擇，如頭發(fā)顏色、重瞼等。這種應(yīng)用性受到限制的原因在于PGT-M打破了傳統(tǒng)自然妊娠的模式，面臨諸多倫理、社會、法律等問題[39]。

4 PGT-M相關(guān)倫理思考

除技術(shù)、法律、經(jīng)濟(jì)等因素外，倫理問題是決定PGT-M未來發(fā)展的一個關(guān)鍵因素[41]。PGT-M在倫理上是有爭議的，因為對受試者、胚胎和子代有潛在的影響。國際上關(guān)于PGT-M的本身爭論主要集中在是否應(yīng)該允許這樣的技術(shù)，其對胚胎進(jìn)行篩選的行為改變了人性，必然會威脅到人類尊嚴(yán)和自由民主權(quán)，并且將越來越多地導(dǎo)致市場驅(qū)動的不平等[42]。盡管PGT-M是針對胚胎植入前進(jìn)行的干預(yù)措施，不違反“不傷害”原則，但為保證健康胎兒無差錯的出生，實際應(yīng)用中仍需牽涉體外授精、基因檢測、植入后/產(chǎn)前檢測三個領(lǐng)域，而每個領(lǐng)域都引發(fā)了各自的倫理問題[43]。圍繞PGT-M相關(guān)胚胎的道德和法律地位及其潛在的優(yōu)生維度的核心倫理問題，進(jìn)而引發(fā)胚胎是否是一個完整生命，能否享有尊重、不傷害、生命自主權(quán)等基本權(quán)益以及最新關(guān)于人類基因庫的潛在弱化、人倫關(guān)系、子代安全責(zé)任問題和社會上越來越多的不孕癥等爭論[44]。同時，PGT-M尚存在一定的誤診、漏診風(fēng)險，若錯誤淘汰了正常胚胎，剝奪了其生命自主權(quán)；若在產(chǎn)前檢測中發(fā)現(xiàn)其漏診，產(chǎn)婦不得已引產(chǎn)，又將違反了不傷害和尊重原則。此外，一些反對PGT-M的論點甚至是反對任何形式的技術(shù)干預(yù)生育的“自然選擇過程”，進(jìn)而衍生了“定制胎兒”這一消極看法，認(rèn)為PGT-M可能導(dǎo)致“無意義的選擇”，被濫用于特定表型篩選和性別選擇等。實際上PGT-M的本質(zhì)是一種尋求確保孩子出生時無明顯不良的單基因遺傳疾病方法，強調(diào)了非強制性和賦權(quán)性，以胚胎的生物學(xué)定位、濫用的可能性、子代遠(yuǎn)期安全責(zé)任問題等并不能作為PGT-M被禁止的充分理由，不應(yīng)妨礙在當(dāng)前采取行動預(yù)防子代不必要的疾病和身心痛苦[41]。鑒于科學(xué)、文化和宗教的不同，對PGT-M的態(tài)度在全球各個國家各個地區(qū)存在較大差異。PGT-M是否應(yīng)該被接受用于哪些單基因疾病或新的醫(yī)療/非醫(yī)療用途，應(yīng)取決于針對各國政策、宗教、信仰等仔細(xì)評估擬定的共識和對受試者的重要性及其可能造成的有害影響[41]。當(dāng)前PGT-M尚處于發(fā)展中，存在技術(shù)和應(yīng)用上的局限性，因此如何擅用各種PGT-M檢測技術(shù)降低漏診、誤診風(fēng)險，加速輔助生殖醫(yī)學(xué)倫理建設(shè)及完善，并在實際應(yīng)用中結(jié)合各個國家的政策及專家指南/共識顯得尤為重要。

5 國內(nèi)PGT-M發(fā)展現(xiàn)狀

2000年，“中華試管嬰兒之父”莊廣倫教授帶領(lǐng)團(tuán)隊率先在中山大學(xué)附屬第一醫(yī)院行胚胎篩選、阻斷了血友病攜帶者夫婦的致病基因向子代傳遞，完成了國內(nèi)首例PGT-M，意味著中國自此之后進(jìn)入了第三代試管嬰兒的發(fā)展進(jìn)程中。繼之，北京大學(xué)喬杰院士團(tuán)隊、中信湘雅生殖與遺傳?？漆t(yī)院、上海國際和平婦幼保健院、南京婦幼保健院等陸續(xù)通過植入前遺傳學(xué)檢測技術(shù)成功實現(xiàn)了家族遺傳性多發(fā)性骨軟骨瘤病、家族性罕見病視網(wǎng)膜母細(xì)胞瘤、Leri-Weill軟骨發(fā)育不良癥、MAGEL2基因相關(guān)變異、先天性骨骼發(fā)育不良等疾病的阻斷[45-46]。單基因病并不罕見，作為人口基數(shù)大國，中國約有2000萬單基因病患者[45]，而相較歐美國家，我國PGT-M發(fā)展仍較緩慢，尚能解決的單基因病范圍有限，但其需求卻呈現(xiàn)爆發(fā)式增長。截至2020年12月31日，國家衛(wèi)生健康委員會官網(wǎng)(http://www.nhc.gov.cn)統(tǒng)計數(shù)據(jù)顯示國內(nèi)體外受精治療周期數(shù)為1082192個，獲批開展人類輔助生殖技術(shù)的醫(yī)療機構(gòu)共536家，其中僅78家可開展胚胎植入前遺傳學(xué)診斷技術(shù)。伴隨分子測序技術(shù)的不斷發(fā)展與成熟，將全面加速中國PGT-M的市場進(jìn)程，現(xiàn)有的PGT-M技術(shù)和檢測機構(gòu)遠(yuǎn)無法滿足市場需求，尚有廣袤的發(fā)展前景。如今我國已經(jīng)將PGT-M歸為人類輔助生殖技術(shù)進(jìn)行管理，并頒布了《人類輔助生殖技術(shù)管理辦法》、《人類輔助生殖技術(shù)應(yīng)用規(guī)劃指導(dǎo)原則(2021版)》、《人類輔助生殖技術(shù)和人類精子庫倫理原則》、《人類輔助生殖技術(shù)管理專項整治行動方案》等；同時，2018年《胚胎植入前遺傳學(xué)診斷/篩查技術(shù)專家共識》發(fā)布[39]，均促進(jìn)了整個市場進(jìn)入規(guī)范化、專業(yè)化時代。未來，PGT-M技術(shù)將為中國更多的單基因病攜帶者的優(yōu)生優(yōu)育帶來曙光，對我國“全面開放三孩政策”的實施執(zhí)行以及單基因病出生缺陷兒發(fā)生率的降低做出進(jìn)一步的貢獻(xiàn)。

6 結(jié)語與展望

隨著單基因病種類及患病率的不斷增加，PGT-M作為單基因病一級預(yù)防措施及輔助生殖的重要手段，無疑是人類遺傳學(xué)和臨床領(lǐng)域關(guān)注的焦點。體外受精的胚胎在不同時期發(fā)育潛能、診斷能力有所差異，近年來在獲取更高質(zhì)量的胚胎單細(xì)胞數(shù)據(jù)方面取得了重大進(jìn)展，胚胎細(xì)胞分離技術(shù)的提升，基因組擴增、測序和分析方法的改進(jìn)以及PGT-M市場的規(guī)范化，無疑使PGT-M的應(yīng)用更具前景。諸如單倍型分析技術(shù)，作為一種新型的檢測技術(shù)間接規(guī)避了ADO的影響，為PGT-M在越來越多的遺傳缺陷疾病中的應(yīng)用開辟了道路，繼之可檢測的病種數(shù)量和應(yīng)用范圍也在逐年增加和擴大。因此，如何優(yōu)化檢測技術(shù)，克服ADO、降低成本，同時為臨床應(yīng)用提供合理的技術(shù)指導(dǎo)，將成為我們今后進(jìn)一步探索的方向。同時，我們相信隨著測序技術(shù)地不斷完善與成熟，當(dāng)前PGT-M面臨的難點將會逐一攻破，低成本、高精準(zhǔn)測序?qū)⒉辉龠b遠(yuǎn)。