韓力揮， 張 偉, ，羅 泉， 梁雅靜**， 呂雪峰

(1. 中國海洋大學(xué) 化學(xué)化工學(xué)院，山東 青島 266100； 2. 中國科學(xué)院青島生物能源與過程研究所，中國科學(xué)院生物燃料重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，山東 青島 266101)

藍(lán)細(xì)菌是地球上一類能夠進(jìn)行放氧光合作用的原核微生物，能夠利用光能將CO2和水轉(zhuǎn)化為各類有機(jī)物，并釋放氧氣，在地球物質(zhì)循環(huán)與能量流動中起著重要的作用，它們廣泛分布于淡水、海洋、陸地甚至各類極端環(huán)境中(如貧瘠的土壤、鹽湖、火山和熱泉等)[1]。相較于真核微藻和高等植物，藍(lán)細(xì)菌具有結(jié)構(gòu)簡單、易于培養(yǎng)、生長迅速且遺傳操作相對簡單等優(yōu)點(diǎn)，長期以來被作為研究光合作用機(jī)制以及光合自養(yǎng)生物環(huán)境適應(yīng)性的模式種類而被廣泛研究[2]。另一方面，相較于大腸桿菌、枯草芽孢桿菌和釀酒酵母等模式異養(yǎng)微生物，藍(lán)細(xì)菌又因其高效的光合作用能力，被認(rèn)為是極具潛力的光合微生物細(xì)胞工廠之一[3-4]。

很多研究已表明，藍(lán)細(xì)菌在鹽脅迫的條件下在細(xì)胞內(nèi)迅速從頭合成一類小分子相容性物質(zhì)(如海藻糖、蔗糖、甘油葡糖苷[glucosylglycerol, GG]、甘油葡萄糖酸酯[glucosylglycerate, GGA]、甘氨酸甜菜堿[glycine betaine, GB]等)來抵抗逆境[5]?；谶@一生理特性，國內(nèi)外多個研究小組通過基因工程改造，構(gòu)建了一系列高效合成相容性物質(zhì)的藍(lán)細(xì)菌基因工程菌株[6-10]。以被廣泛用作食品調(diào)味劑和微生物發(fā)酵原料的蔗糖為例，通過過量表達(dá)蔗糖合成關(guān)鍵基因sps(蔗糖磷酸合酶基因)，Synechocystissp. PCC 6803(集胞藻PCC 6803)鹽脅迫下蔗糖合成能力提高了將近3倍[7]。在SynechococcuselongatusPCC 7942(細(xì)長聚球藻PCC 7942，S.elongatusPCC 7942)中過表達(dá)sps，鹽脅迫條件下藻細(xì)胞內(nèi)蔗糖積累量也提高了將近1倍[11]；進(jìn)一步向S.elongatusPCC 7942中引入一個來自大腸桿菌的蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CscB，成功實(shí)現(xiàn)了蔗糖從胞內(nèi)向胞外的高效分泌，細(xì)胞蔗糖合成能力提高近10倍；該過程中通過光合作用固定的CO2，其中約80%都被導(dǎo)向了蔗糖合成[12]。目前，基因工程藍(lán)細(xì)菌達(dá)到的最高蔗糖產(chǎn)率為36.1 mg·L-1·h-1，其相應(yīng)的理論產(chǎn)率已超過部分地區(qū)甘蔗蔗糖生產(chǎn)水平，展現(xiàn)出利用基因工程藍(lán)細(xì)菌規(guī)?；a(chǎn)蔗糖的潛力[12]。而在藍(lán)細(xì)菌GG細(xì)胞工廠的構(gòu)建過程中，通過敲除Synechocystissp. PCC 6803中g(shù)gtCD基因，造成細(xì)胞GG吸收轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白無法組裝，成功實(shí)現(xiàn)了GG從胞內(nèi)向細(xì)胞外的分泌，使得工程菌株GG的產(chǎn)量較野生型菌株提高了約1.5倍；進(jìn)一步敲除一個相關(guān)轉(zhuǎn)錄因子基因ggpR，工程菌株△ggtCD△ggpR中GG的產(chǎn)量進(jìn)一步提高16%[13]。

然而，與其它利用基因工程藍(lán)細(xì)菌生產(chǎn)各種燃料分子或化學(xué)品所遇到的問題一樣，通過對合成途徑關(guān)鍵基因的過表達(dá)、競爭途徑的敲除、基因轉(zhuǎn)錄表達(dá)效率優(yōu)化等傳統(tǒng)研究手段，已很難在數(shù)量級上進(jìn)一步提高藍(lán)細(xì)菌中目標(biāo)相容性物質(zhì)的產(chǎn)量。這迫切需要我們?nèi)嬲J(rèn)識藍(lán)細(xì)菌響應(yīng)鹽脅迫積累相容性物質(zhì)的生理過程，尤其是深入了解其代謝調(diào)控的內(nèi)在機(jī)制，進(jìn)而指導(dǎo)新的基因工程改造策略、培養(yǎng)條件優(yōu)化策略，以及產(chǎn)品獲取、加工策略，實(shí)現(xiàn)藍(lán)細(xì)菌相容性物質(zhì)合成能力的繼續(xù)提升以及相關(guān)生產(chǎn)工藝的建立與優(yōu)化。在本文中，我們對藍(lán)細(xì)菌應(yīng)對鹽脅迫合成相容性物質(zhì)調(diào)控機(jī)制的研究現(xiàn)狀進(jìn)行了總結(jié)，從基因表達(dá)(包括轉(zhuǎn)錄、翻譯)和酶學(xué)活性兩個層面對該領(lǐng)域研究進(jìn)展進(jìn)行了詳細(xì)闡述，并對其未來發(fā)展方向進(jìn)行了展望。這對我們進(jìn)一步認(rèn)識微生物響應(yīng)、適應(yīng)鹽脅迫的分子機(jī)理和指導(dǎo)高效藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞工廠構(gòu)建等都具有重要參考價值。

1 藍(lán)細(xì)菌鹽脅迫下合成相容性物質(zhì)的種類

鹽脅迫是環(huán)境中一種常見的非生物脅迫，其主要通過增加外界環(huán)境的滲透勢，打破細(xì)胞內(nèi)外的滲透平衡，從而引起對細(xì)胞膜、細(xì)胞器結(jié)構(gòu)的損傷。此外，胞外離子向胞內(nèi)的大量涌入，抑制一些代謝關(guān)鍵酶功能的發(fā)揮，從而嚴(yán)重影響細(xì)胞正常的生命活動過程[5]。為了應(yīng)對鹽脅迫，藍(lán)細(xì)菌主要從兩方面來調(diào)整細(xì)胞活動：一方面，細(xì)胞通過膜上的離子轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白主動泵出無機(jī)鹽離子(如Na+、Cl-)，以降低胞內(nèi)離子濃度，進(jìn)而維持細(xì)胞內(nèi)的離子穩(wěn)態(tài)；另一方面，藍(lán)細(xì)菌在細(xì)胞內(nèi)迅速合成并積累相容性物質(zhì)，以實(shí)現(xiàn)細(xì)胞內(nèi)外的滲透壓平衡[14]。

相容性物質(zhì)是一類易溶于水的低分子量有機(jī)化合物，通常不帶電荷，能夠在細(xì)胞內(nèi)積累到較高濃度而不干擾細(xì)胞的新陳代謝過程[15]。細(xì)胞內(nèi)高濃度的相容性物質(zhì)一方面可以平衡細(xì)胞內(nèi)外的滲透勢，防止細(xì)胞脫水，維持細(xì)胞的體積和形態(tài)；另一方面，這些相容物還可以穩(wěn)定細(xì)胞內(nèi)的大分子結(jié)構(gòu)(如蛋白質(zhì)、核酸等)，減小高濃度的鹽離子對其結(jié)構(gòu)的破壞作用[16-18]。目前，微生物中已發(fā)現(xiàn)的相容性物質(zhì)按照結(jié)構(gòu)特點(diǎn)可以分為糖類(如蔗糖)、糖苷類(如GG)、氨基酸(如脯氨酸)及其衍生物(如四氫嘧啶)、多元醇(如山梨糖醇)及其衍生物(如鄰甲基肌醇)、甲胺類(如N-三甲胺氧化物)等[19,20]。

通過對多株藍(lán)細(xì)菌的研究發(fā)現(xiàn)，藍(lán)細(xì)菌中合成的相容性物質(zhì)種類與其鹽耐受程度有一定相關(guān)性(見表1)[14,21]。一般來說，低耐鹽度藍(lán)細(xì)菌(最高耐受0.6 mol/L NaCl，相當(dāng)于海水鹽度)主要合成海藻糖和/或蔗糖作為相容性物質(zhì)，如S.elongatusPCC 7942在鹽脅迫下專一性合成蔗糖，而Anabaenasp. PCC 7120(魚腥藻PCC 7120，A. sp. PCC 7120)則同時合成海藻糖和蔗糖；中等耐鹽藍(lán)細(xì)菌(最高耐受1.8 mol/L NaCl，相當(dāng)于3倍海水鹽度)往往可以合成多種相容性物質(zhì)，多以GG作為主要相容性物質(zhì)，以海藻糖、蔗糖、GGA等作為次要相容性物質(zhì)，如Synechocystissp. PCC 6803在鹽脅迫下同時合成蔗糖與GG來抵抗逆境；高鹽耐受性藍(lán)細(xì)菌(最高能耐受3 mol/L NaCl)則主要合成甘氨酸甜菜堿(GB)作為主要相容性物質(zhì)，如Spirulinasubsalsa(鹽澤螺旋藻)。除了上述相容性物質(zhì)，最新研究表明，海洋藍(lán)細(xì)菌TrichodesmiumerythraeumIMS101(漢氏束毛藻IMS101)合成一種新的相容性物質(zhì)——高絲氨酸甜菜堿來應(yīng)對鹽脅迫[22]。

表1 部分藍(lán)細(xì)菌中鹽脅迫誘導(dǎo)合成相容性物質(zhì)種類情況

2 藍(lán)細(xì)菌中相容性物質(zhì)的代謝途徑及鹽誘導(dǎo)積累的調(diào)控

在藍(lán)細(xì)菌合成的相容性物質(zhì)中，GG、蔗糖和海藻糖因其在皮膚護(hù)理、功能食品、微生物發(fā)酵原料等方面的應(yīng)用潛力，已成為當(dāng)前基因工程藍(lán)細(xì)菌生物合成相容性物質(zhì)的主要聚焦點(diǎn)[14,38]。對構(gòu)建高效藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞工廠的迫切需求，要求我們對鹽脅迫誘導(dǎo)藍(lán)細(xì)菌相容性物質(zhì)積累的分子調(diào)控機(jī)理有更為深入的認(rèn)識。我們在此對相關(guān)研究進(jìn)行了全面總結(jié)，重點(diǎn)闡述藍(lán)細(xì)菌積累GG、蔗糖和海藻糖的代謝調(diào)控機(jī)制，嘗試探索其中的共性規(guī)律，為構(gòu)建新一代高效藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞工廠提供新指導(dǎo)。

2.1 藍(lán)細(xì)菌中GG代謝途徑及其調(diào)控

在鹽脅迫的條件下，藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞中相容性物質(zhì)(如GG)的積累實(shí)際上是合成和降解協(xié)同作用的結(jié)果，通過這種方式，細(xì)胞動態(tài)地調(diào)節(jié)胞內(nèi)相容性物質(zhì)的水平，以適應(yīng)環(huán)境鹽度的變化。對GG而言，其在藍(lán)細(xì)菌中的代謝過程已被清楚鑒定(見圖1)。GG的合成包含兩步反應(yīng)：首先，ADP-葡萄糖和甘油-3-磷酸在GG磷酸合酶GgpS(EC 2.4.1.213)的作用下合成GG-6-磷酸，并釋放一個ADP分子；隨后，GG磷酸磷酸酶GgpP(EC 3.1.3.69)催化GG-6-磷酸水解產(chǎn)生GG[39-40]。GG的降解則是由gghA基因編碼的GG水解酶GghA(EC 3.2.1.21)催化完成，該酶將1分子的GG水解為1分子的甘油和1分子的葡萄糖(見圖1)[41-42]。

(甘油葡糖苷：glucosylglycerol，簡稱GG；GgpS：GG磷酸合酶；GgpP：GG磷酸磷酸酶；GghA：GG水解酶；SPS：蔗糖磷酸合酶；SPP：蔗糖磷酸磷酸酶；SUS：蔗糖合酶； INV：蔗糖酶；AMS：淀粉蔗糖酶；TreS：海藻糖合酶；TPS：海藻糖磷酸合酶；TPP：海藻糖磷酸磷酸酶；Mts：麥芽寡糖基海藻糖合酶；Mth：麥芽寡糖基海藻糖水解酶；TreH：海藻糖酶。glucosylglycerol is abbreviated as GG; GgpS: GG phosphate synthase; GgpP: GG phosphate phosphatase; GghA: GG hydrolase; SPS: sucrose phosphate synthase; SPP: sucrose phosphate phosphatase; SUS: sucrose synthase; INV: invertase; AMS: amylosucrase; TreS: trehalose synthase; TPS: trehalose phosphate synthase; TPP: trehalose phosphate phosphatase; Mts: maltooligosyltrehalose synthase; Mth: maltooligosyltrehalose trehalohydrolase; TreH: trehalase.)

2.1.1Synechocystissp. PCC 6803中GG代謝的調(diào)控 與已被深入研究的GG代謝途徑相比，鹽誘導(dǎo)GG積累調(diào)控機(jī)制的研究仍然有限，相關(guān)研究主要集中在Synechocystissp. PCC 6803中。淡水單細(xì)胞藍(lán)細(xì)菌Synechocystissp. PCC 6803在面對鹽脅迫時，細(xì)胞內(nèi)會迅速合成兩種相容性物質(zhì)——GG(主要)和蔗糖[7]。研究表明，Synechocystissp. PCC 6803中鹽誘導(dǎo)GG合成的調(diào)控發(fā)生在多個水平上——關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯和關(guān)鍵酶的生物化學(xué)活性(見圖2)。在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下(無鹽脅迫)，GG合成限速酶GgpS的基因轉(zhuǎn)錄和翻譯維持基礎(chǔ)水平，細(xì)胞內(nèi)幾乎沒有GG合成；而在NaCl脅迫條件下，ggpS基因的轉(zhuǎn)錄迅速上調(diào)，且呈現(xiàn)明顯的鹽濃度正相關(guān)性，與之對應(yīng)， GgpS的表達(dá)量在脅迫后明顯提高，GG開始迅速積累[43,44]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，RNA聚合酶選擇性σ因子SigF突變株中，鹽脅迫條件下ggpS基因的轉(zhuǎn)錄水平較野生型明顯降低，同時突變株應(yīng)對鹽脅迫的能力也明顯受損，表明SigF因子參與了ggpS基因的鹽依賴性轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)[43]。此外，敲除轉(zhuǎn)錄因子LexA和GgpR，ggpS基因的轉(zhuǎn)錄均明顯上調(diào)，表明LexA和GgpR很可能作為轉(zhuǎn)錄抑制因子參與了ggpS的表達(dá)調(diào)控[13,45-46]。值得注意的是，轉(zhuǎn)錄因子LexA的調(diào)控作用可能是全局性的，很多研究表明LexA參與了多種細(xì)胞生理過程的調(diào)控(如在Synechocystissp. PCC 6803中參與了涉及GG合成和吸收的多個相關(guān)基因的表達(dá)調(diào)控；在大腸桿菌中作為SOS應(yīng)急反應(yīng)的重要調(diào)節(jié)因子之一，調(diào)控了約50個相關(guān)基因的表達(dá))[45,47]；而對于GgpR，其編碼基因位于ggpS上游，可能介導(dǎo)了對GG合成的特異性調(diào)控[46]。但多個調(diào)控因子之間如何協(xié)同配合完成基因表達(dá)調(diào)控還有待深入研究。除了轉(zhuǎn)錄翻譯水平的調(diào)控，Hagemann等的研究還表明Synechocystissp. PCC 6803中GG的合成調(diào)控也可能發(fā)生在基因的翻譯后水平。他們發(fā)現(xiàn)利用氯霉素阻斷細(xì)胞中的蛋白合成后，對細(xì)胞施加684 mmol·L-1NaCl脅迫，仍然導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)GG水平的迅速上升[44]。2011年，Novak等的研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)這種翻譯后水平的調(diào)控主要通過胞內(nèi)離子濃度對GgpS酶活力的改變來實(shí)現(xiàn)，并且核酸在GgpS酶活發(fā)揮中起著抑制作用[48]。在正常培養(yǎng)條件下，胞內(nèi)基礎(chǔ)性表達(dá)的GgpS蛋白可能通過靜電作用與核酸非特異性結(jié)合，致使GgpS處于酶活抑制狀態(tài)，該狀態(tài)下細(xì)胞幾乎不合成GG；而當(dāng)細(xì)胞遇到鹽脅迫環(huán)境后，細(xì)胞內(nèi)升高的離子濃度破壞了GgpS與核酸的靜電結(jié)合，釋放出活性狀態(tài)的GgpS蛋白，進(jìn)而催化GG的迅速合成[48]。

圖2 NaCl誘導(dǎo)Synechocystis sp. PCC 6803積累甘油葡糖苷的調(diào)控機(jī)制示意圖

在GG的降解方面，研究表明Synechocystissp. PCC 6803中GG水解酶基因gghA的表達(dá)和GghA蛋白的酶學(xué)活性同樣受到鹽脅迫的影響(見圖2)。在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下(無鹽脅迫)，細(xì)胞中g(shù)ghA的轉(zhuǎn)錄和翻譯維持在低水平，而在550 mmol·L-1NaCl脅迫條件下，gghA基因的轉(zhuǎn)錄迅速上調(diào)[49]。進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)錄因子LexA的敲除后，gghA基因的轉(zhuǎn)錄明顯上調(diào)，表明LexA可能作為轉(zhuǎn)錄抑制因子也參與了對gghA的表達(dá)調(diào)控[45]。gghA基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)是否意味著細(xì)胞中GG降解也隨之加快呢？ Kirsch等的研究發(fā)現(xiàn)情況并不是這樣。他們對GghA酶學(xué)活性的分析表明，GghA酶活力與GgpS一樣也受到了胞內(nèi)離子濃度的調(diào)控，然而其調(diào)控方式與GgpS正好相反，即胞內(nèi)離子濃度的升高，明顯抑制了GghA的活性，而離子濃度的下降，則激活GghA的活力[42]。這樣，由高離子濃度引起的對GghA活性的抑制作用，一方面很大程度上抵消了gghA基因上調(diào)表達(dá)對胞內(nèi)GG積累的影響；另一方面，它與高離子濃度介導(dǎo)的GgpS活性激活一起，協(xié)同調(diào)控，共同實(shí)現(xiàn)了胞內(nèi)GG含量迅速積累。這樣，藍(lán)細(xì)菌通過胞內(nèi)離子濃度對GG合成/降解關(guān)鍵酶的協(xié)同調(diào)控，實(shí)現(xiàn)了對環(huán)境鹽度變化的動態(tài)適應(yīng)。

與對基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯調(diào)控相比，這種通過離子濃度介導(dǎo)的GG代謝關(guān)鍵酶學(xué)活性的協(xié)調(diào)調(diào)控，保證了藍(lán)細(xì)菌能以一種更為快速的方式實(shí)現(xiàn)細(xì)胞生理、生化響應(yīng)，因此也很可能是微生物界普遍采用的一種鹽脅迫環(huán)境適應(yīng)調(diào)控機(jī)制。

2.1.2Synechococcussp. PCC 7002中GG代謝的調(diào)控 除了Synechocystissp. PCC 6803，GG的代謝調(diào)控也在模式海洋藍(lán)細(xì)菌Synechococcussp. PCC 7002(聚球藻PCC 7002，S. sp. PCC 7002)中被研究，但相關(guān)研究僅限于GG的合成過程，并未涉及GG降解過程。S. sp. PCC 7002是一種中等耐鹽藍(lán)細(xì)菌，其在面對鹽脅迫時，會在胞內(nèi)能合成多種相容性物質(zhì)——GG(主要)、蔗糖以及GGA[32]。研究表明，S. sp. PCC 7002中GG合成的調(diào)控與Synechocystissp. PCC 6803明顯不同，其GG合成僅在基因表達(dá)水平受到調(diào)控，沒有發(fā)現(xiàn)類似Synechocystissp. PCC 6803中酶學(xué)水平上的調(diào)控[44]。當(dāng)S. sp. PCC 7002細(xì)胞受到684 mmol·L-1NaCl脅迫后，ggpS基因的轉(zhuǎn)錄水平迅速提高，在40 min左右達(dá)到最高水平；與轉(zhuǎn)錄上調(diào)相對應(yīng)的是，鹽脅迫后的24 h內(nèi)，胞內(nèi)GgpS蛋白含量也顯著上升，胞內(nèi)GG的單位含量也在5 h左右達(dá)到峰值，并在隨后近20 h內(nèi)維持穩(wěn)定[44]。而在培養(yǎng)基中加入氯霉素阻斷蛋白合成，鹽脅迫下的S. sp. PCC 7002細(xì)胞提取液中GgpS活性不受反應(yīng)體系中NaCl的影響，表明該藍(lán)細(xì)菌中GgpS蛋白調(diào)控方式與Synechocystissp. PCC 6803中不同，其酶活并不受到離子激活[44]。

由此可見，不同藍(lán)細(xì)菌種類中，鹽脅迫誘導(dǎo)GG合成的調(diào)控機(jī)制并不完全相同。有的種類主要依靠對關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯的調(diào)控來加速GG合成，有的則主要依賴酶學(xué)活性調(diào)控來實(shí)現(xiàn)GG的快速積累。

2.2 藍(lán)細(xì)菌中蔗糖代謝途徑及其調(diào)控

如前所述，很多藍(lán)細(xì)菌在鹽脅迫下合成蔗糖來作為相容性物質(zhì)。與GG合成相似，藍(lán)細(xì)菌中蔗糖的合成也是通過兩步酶學(xué)反應(yīng)來實(shí)現(xiàn)(見圖1)：首先，UDP-葡萄糖和果糖-6-磷酸在蔗糖磷酸合酶SPS(EC 2.4.1.14)的作用下，合成蔗糖-6-磷酸，同時釋放一分子UDP，該步反應(yīng)是蔗糖合成的限速步驟；隨后，蔗糖-6-磷酸在蔗糖磷酸磷酸酶SPP(EC 3.1.3.24)的作用下水解生成蔗糖[24,50]。相比蔗糖合成較為單一的途徑，目前為止，藍(lán)細(xì)菌中已鑒定出三條蔗糖降解途徑(見圖1)：(1)由蔗糖酶INV(EC 3.2.1.26)催化的蔗糖降解，該過程不可逆地催化蔗糖水解成游離的葡萄糖和果糖，是目前藍(lán)細(xì)菌中最為廣泛采用的一種蔗糖降解策略[51]；(2)由蔗糖合酶SUS(EC 2.4.1.13)催化的蔗糖降解，SUS主要存在于能形成異形胞的藍(lán)細(xì)菌種類中(如A. sp. PCC 7120)，在藻細(xì)胞的固氮過程中起著重要的作用[52-54]。SUS可催化從蔗糖、(A/U)DP到(A/U)DP-葡萄糖、果糖的可逆轉(zhuǎn)化，但在藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞內(nèi)，該酶主要催化蔗糖的裂解反應(yīng)而非合成反應(yīng)[53]；(3)由淀粉蔗糖酶AMS(EC 2.4.1.4)催化的蔗糖降解，該途徑由Perez-Cenci等2014年在S. sp. PCC 7002中發(fā)現(xiàn)。AMS可催化蔗糖分解為游離果糖和葡萄糖，葡萄糖進(jìn)一步通過糖苷鍵連到寡糖或者糖原上[55]。

目前，關(guān)于藍(lán)細(xì)菌中鹽誘導(dǎo)蔗糖積累的調(diào)控機(jī)制研究主要集中在一些模式種類中，如Synechocystissp. PCC 6803、A. sp. PCC 7120和S.elongatusPCC 7942。與GG積累的調(diào)控相似，鹽脅迫誘導(dǎo)蔗糖積累的調(diào)控同樣發(fā)生在多個水平上——關(guān)鍵基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯和關(guān)鍵酶的生物化學(xué)活性，但是不同藍(lán)細(xì)菌種類采用的調(diào)控方式又不完全相同。

2.2.1Anabaenasp. PCC 7120中蔗糖代謝的調(diào)控 有關(guān)藍(lán)細(xì)菌中蔗糖代謝調(diào)控的研究最早在淡水固氮種類A. sp. PCC 7120中展開[56]。魚腥藻A. sp. PCC 7120屬于絲狀固氮藍(lán)細(xì)菌，耐鹽能力較低，其在面對鹽脅迫時細(xì)胞內(nèi)能快速合成蔗糖(主要)和海藻糖兩種相容性物質(zhì)。Salerno等的研究發(fā)現(xiàn)，在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下(無鹽脅迫)，A. sp. PCC 7120中蔗糖合成限速酶基因spsA的轉(zhuǎn)錄和翻譯維持低的基礎(chǔ)水平，細(xì)胞內(nèi)幾乎沒有蔗糖合成；而在80 mmol·L-1NaCl脅迫條件下，spsA基因的轉(zhuǎn)錄、翻譯迅速上調(diào)，胞內(nèi)蔗糖濃度也迅速增加[25]。這一結(jié)果表明A. sp. PCC 7120中蔗糖合成在基因表達(dá)水平上受到了鹽脅迫的調(diào)控。Ehira等的研究進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，Hik-Rre雙元信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)可能參與了A. sp. PCC 7120中蔗糖合成的調(diào)控[57]。Hik-Rre即組氨酸激酶-應(yīng)答調(diào)控蛋白，該雙元信號轉(zhuǎn)導(dǎo)系統(tǒng)是包括藍(lán)細(xì)菌在內(nèi)的原核微生物感知、傳導(dǎo)并響應(yīng)各種環(huán)境變化的重要途徑，Hik負(fù)責(zé)感知外界信號，Rre接收Hik傳遞的信號后，通常借助轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控下游過程[58]。A. sp. PCC 7120中的orrA基因(alr3768)編碼一個NarL型的Rre蛋白OrrA，研究發(fā)現(xiàn)，orrA敲除株中，spsA的轉(zhuǎn)錄不再受鹽脅迫調(diào)控；而orrA過表達(dá)菌株中，spsA基因的轉(zhuǎn)錄在無鹽脅迫條件下明顯上調(diào)[57]。此外，RNA聚合酶σ因子SigB2敲除后，A. sp. PCC 7120細(xì)胞在鹽脅迫條件下，其spsA基因轉(zhuǎn)錄上調(diào)水平在脅迫初期較野生型明顯降低，表明SigB2也參與到了藍(lán)細(xì)菌對鹽脅迫的早期轉(zhuǎn)錄調(diào)控[57]。除了在基因表達(dá)水平上的調(diào)控，Hagemann等還對A. sp. PCC 7120中SPS酶學(xué)活性也進(jìn)行了研究，他們發(fā)現(xiàn)細(xì)胞破碎液中SPS酶活并沒有受到反應(yīng)體系中鹽濃度的影響，這表明鹽離子濃度的變化并不能直接調(diào)控A. sp. PCC 7120中蔗糖合成限速酶SPS的酶學(xué)活性[24]。綜上A. sp. PCC 7120中鹽脅迫誘導(dǎo)的蔗糖合成的調(diào)控主要發(fā)生在關(guān)鍵基因的表達(dá)水平。

2.2.2Synechocystissp. PCC 6803中蔗糖代謝的調(diào)控 作為藍(lán)細(xì)菌研究中的模式種類，Synechocystissp. PCC 6803在鹽脅迫下蔗糖(次要相容性物質(zhì))代謝調(diào)控機(jī)制，也獲得了研究人員的關(guān)注。研究發(fā)現(xiàn)，與A. sp. PCC 7120相似，Synechocystissp. PCC 6803中蔗糖合成的調(diào)控主要發(fā)生在sps基因的表達(dá)水平。在684 mmol·L-1NaCl脅迫下，sps基因的轉(zhuǎn)錄水平迅速上調(diào)[59]。Song等進(jìn)一步發(fā)現(xiàn)，敲除雙元信號轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白Rre39的編碼基因slr1588后，sps基因的轉(zhuǎn)錄水平上調(diào)，表明Rre39參與了對sps的表達(dá)調(diào)控[60]。此外，對Synechocystissp. PCC 6803中SPS酶活的研究顯示，純化的SPS蛋白在含有不同NaCl濃度的反應(yīng)體系中，其活性并無明顯差別，不受離子濃度的調(diào)控[24]。

研究表明，Synechocystissp. PCC 6803中的蔗糖降解過程同樣在基因表達(dá)水平受到了調(diào)控。Billis等的轉(zhuǎn)錄組學(xué)分析發(fā)現(xiàn)，550 mmol·L-1NaCl脅迫Synechocystissp. PCC 6803 1 h后，細(xì)胞內(nèi)inv基因(蔗糖酶基因)的轉(zhuǎn)錄水平明顯下降，表明鹽脅迫抑制了inv基因的表達(dá)[49]。Kirsch等進(jìn)一步詳細(xì)分析了蔗糖酶INV的酶學(xué)活性。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，純化的INV蛋白的活性受到鹽濃度的影響。與不添加NaCl的條件相比，當(dāng)反應(yīng)體系中NaCl濃度升高到75 mmol·L-1時，INV活性降低到約初始水平的50%，而當(dāng)NaCl濃度繼續(xù)升高到145 mmol·L-1時，INV活性僅殘留15%[61]。由此可見，Synechocystissp. PCC 6803中蔗糖降解基因inv的表達(dá)和關(guān)鍵酶INV的活性同時受到了鹽脅迫的調(diào)控。

綜上所述，蔗糖作為Synechocystissp. PCC 6803中次要的相容性物質(zhì)，其鹽誘導(dǎo)的積累主要是通過迅速sps基因的轉(zhuǎn)錄上調(diào)、inv基因的轉(zhuǎn)錄下調(diào)，以及對INV酶活性的抑制來實(shí)現(xiàn)的。

2.2.3SynechococcuselongatusPCC 7942中蔗糖代謝的調(diào)控S.elongatusPCC 7942是一種被廣為研究的低耐鹽性淡水藍(lán)細(xì)菌，在鹽脅迫下其合成蔗糖作為唯一相容性物質(zhì)抵御逆境。近期，其蔗糖代謝調(diào)控機(jī)制(見圖3)也被系統(tǒng)研究[62]。在S.elongatusPCC 7942中，蔗糖合成的關(guān)鍵酶SPS和SPP是以融合蛋白(記作7942-SPS)的形式存在的，由Synpcc7942_0808基因編碼(記作Syn0808)。研究發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞經(jīng)300 mmol·L-1NaCl脅迫0.5 h后，Syn0808基因的轉(zhuǎn)錄水平明顯上調(diào)；此外蛋白水平分析也表明，相同脅迫條件下7942-SPS蛋白含量也逐漸升高，在脅迫8 h達(dá)到初始水平的2倍[62]。盡管Syn0808基因的表達(dá)在鹽脅迫條件下受到了一定的調(diào)控作用，但這種7942-SPS水平有限的升高，似乎并不足以解釋蔗糖的快速積累過程(2 h內(nèi)可到達(dá)穩(wěn)定水平的80%)，暗示其蔗糖合成可能還有其它調(diào)控方式。Hagemann等發(fā)現(xiàn)，在S.elongatusPCC 7942近似種類SynechococcuselongatusPCC 6301(細(xì)長聚球藻PCC 6301，S.elongatusPCC 6301)中，細(xì)胞破碎液中SPS的活性明顯受到NaCl的激活，暗示7942-SPS活性也可能受到離子濃度的直接調(diào)控[24]。Liang等進(jìn)一步的酶學(xué)分析表明，異源表達(dá)純化的7942-SPS蛋白其活性能被高濃度的鹽離子顯著激活， 在200 mmol·L-1NaCl濃度條件下，7942-SPS的單位酶活性較無鹽條件提高了近40倍；進(jìn)一步研究表明這種激活調(diào)控發(fā)生在SPS結(jié)構(gòu)域而非SPP結(jié)構(gòu)域上[62]。但高鹽離子激活SPS結(jié)構(gòu)域的深入機(jī)制并沒能得到闡明，是類似Synechocystissp. PCC 6803中GgpS的離子激活機(jī)制，還是依賴其它方式，仍有待后續(xù)研究。相比于基因表達(dá)水平的調(diào)控，這種離子濃度介導(dǎo)的7942-SPS酶活調(diào)控保證了S.elongatesPCC 7942能以一種更為快速的方式實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的生化響應(yīng)，從而迅速應(yīng)對環(huán)境中的鹽度變化。有趣的是，該藍(lán)細(xì)菌中的蔗糖降解酶INV像Synechocystissp. PCC 6803中一樣，其活性也受到離子濃度變化的影響，且以與7942-SPS完全相反的方式受到調(diào)控，即高離子濃度抑制其活性，低離子濃度促進(jìn)其活性。這樣，S.elongatusPCC 7942細(xì)胞內(nèi)動態(tài)變化的離子濃度以完全相反的方式調(diào)控著蔗糖合成和降解的關(guān)鍵酶，從而實(shí)現(xiàn)對環(huán)境鹽度變化的動態(tài)響應(yīng)。

圖3 NaCl誘導(dǎo)Synechococcus elongatus PCC 7942積累蔗糖的調(diào)控機(jī)制示意圖

綜上所述，對于僅以蔗糖為唯一相容性物質(zhì)的S.elongatesPCC 7942，其鹽誘導(dǎo)的蔗糖積累主要以這種“離子濃度介導(dǎo)的酶活協(xié)同調(diào)控”方式進(jìn)行調(diào)控，其合成活性與降解活性的調(diào)控以一正一反的方式相互配合，維持細(xì)胞內(nèi)蔗糖含量的動態(tài)平衡。

2.3 藍(lán)細(xì)菌中海藻糖代謝途徑及其調(diào)控

很多藍(lán)細(xì)菌種類在鹽脅迫條件下也能合成海藻糖。與蔗糖和GG的合成途徑相比，藍(lán)細(xì)菌中海藻糖的合成途徑相對更加多樣化。目前已在不同藍(lán)細(xì)菌中鑒定出三條海藻糖合成途徑(見圖1)：(1)TreS途徑，已在SpirulinaplatensisNIES-39(鈍頂螺旋藻NIES-39，S. platensis NIES-39)、Cyanothecesp. PCC 7424(藍(lán)桿藻PCC 7424)、MicrocoleuschthonoplastesPCC 7420(原型微鞘藻PCC 7420)等種類中發(fā)現(xiàn)[5]。海藻糖合酶TreS(EC 5.4.99.16)能夠通過分子內(nèi)轉(zhuǎn)糖基作用，特異性的將麥芽糖的α-1,4糖苷鍵轉(zhuǎn)化為α-1,1糖苷鍵生成海藻糖；(2)TPS/TPP途徑，該途徑與藍(lán)細(xì)菌GG(GgpS/GgpP途徑)和蔗糖(SPS/SPP途徑)合成過程類似，由一個合酶(synthase)和一個磷酸酶(phosphatase)催化完成。首先，在海藻糖磷酸合酶TPS(EC 2.4.1.15)催化下，UDP-葡萄糖和葡萄糖-6-磷酸轉(zhuǎn)化為海藻糖-6-磷酸并釋放一分子UDP，隨后海藻糖-6-磷酸進(jìn)一步被海藻糖磷酸磷酸酶TPP(EC 3.1.3.12)水解，生成海藻糖。該途徑目前僅發(fā)現(xiàn)于海洋固氮藍(lán)細(xì)菌CrocosphaerawatsoniiWH8501(瓦氏鱷球藻WH8510，C.watsoniiWH8501)中。對C.watsoniiWH8501基因組的分析表明，該藍(lán)細(xì)菌中TPS和TPP由同一個基因編碼(otsAB基因)，產(chǎn)生一個融合型的TPS-TPP蛋白[29]；(3)Mts/Mth途徑(或TreY/TreZ途徑)，該途徑主要存在于A. sp. PCC 7120和近似種類中(如Nostocflagelliforme[發(fā)狀念珠藻，N. flagelliforme]、S.platensisNIES-39)[26,27]。這一途徑由兩種酶催化——麥芽寡糖基海藻糖合酶Mts(也稱TreY，EC 5.4.99.15)和麥芽寡糖基海藻糖水解酶Mth(也稱TreZ，EC 3.2.1.141)。細(xì)胞利用葡萄糖聚合物(如糖原和麥芽低聚糖)作為海藻糖合成的前體，由Mts首先將分子骨架中的α-1,4糖苷鍵轉(zhuǎn)換成α-1,1糖苷鍵，隨后Mth水解上述高分子量前體，釋放出海藻糖分子[26]。相對于研究較多的海藻糖合成途徑，目前在藍(lán)細(xì)菌中僅發(fā)現(xiàn)一種海藻糖降解途徑，即由海藻糖酶TreH催化水解海藻糖，生成兩個葡萄糖分子。該途徑中treH基因通常與負(fù)責(zé)海藻糖合成的mts和mth基因位于同一個操縱子中[26]。

與GG和蔗糖代謝調(diào)控研究相比，人們對鹽脅迫如何誘導(dǎo)藍(lán)細(xì)菌積累海藻糖的認(rèn)識還相對有限，目前只在少數(shù)種類中有過零星的研究。如對N.flagelliforme、S.platensisNIES-39和C.watsoniiWH8501的研究發(fā)現(xiàn)，盡管這三種藍(lán)細(xì)菌采用不同的途徑催化海藻糖的合成，其海藻糖合成關(guān)鍵基因(即Nostoc的mts和mth、Spirulina的mth和C.watsonii的ostAB)的轉(zhuǎn)錄均受到了鹽脅迫的誘導(dǎo)上調(diào)[27,29,34]。而負(fù)責(zé)海藻糖降解的海藻糖酶基因treH因與mts、mth位于同一操縱子中，其表達(dá)水平也會和mts、mth一樣受到鹽脅迫的誘導(dǎo)上調(diào)(見圖4)[26,28]。2009年，Yoshida和Sakamoto分析了絲狀固氮藍(lán)細(xì)菌NostocpunctiformeIAM M-15(點(diǎn)狀念珠藻IAM M-15，N. punctiforme IAM M-15)中Mts、Mth和TreH酶學(xué)活性[28]，結(jié)果發(fā)現(xiàn)細(xì)胞破碎液中Mts、Mth酶活并沒有受到反應(yīng)體系中鹽濃度的影響，表明該藍(lán)細(xì)菌中海藻糖的合成不受鹽離子濃度的直接調(diào)控。然而有趣的是，海藻糖酶TreH的酶活性卻受到鹽濃度的明顯影響。在50 mmol·L-1NaCl條件下，不論是利用細(xì)胞破碎液或是異源表達(dá)純化的蛋白，其TreH活性都會隨著反應(yīng)體系中鹽濃度的升高而迅速下降[28]。因此，在N.punctiformeIAM M-15中，鹽脅迫條件下海藻糖在胞內(nèi)的積累主要是通過對mts、mth基因表達(dá)的誘導(dǎo)以及對TreH酶活的抑制而實(shí)現(xiàn)的(見圖4)。

圖4 NaCl誘導(dǎo)Nostoc punctiforme IAM M-15積累海藻糖的調(diào)控機(jī)制示意圖

在很多藍(lán)細(xì)菌中，海藻糖往往作為一種應(yīng)對鹽脅迫的次要相容性物質(zhì)被合成，其合成水平與主要相容性物質(zhì)的合成水平密切相關(guān)[26-27,34]，這一生理特征也暗示海藻糖合成調(diào)控方式可能更為復(fù)雜，因此未來有必要針對一種具體的藍(lán)細(xì)菌種類做更為系統(tǒng)的研究。

3 總結(jié)與展望

本文總結(jié)了藍(lán)細(xì)菌相容性物質(zhì)代謝調(diào)控方面的研究進(jìn)展，重點(diǎn)闡述了三種典型的藍(lán)細(xì)菌相容性物質(zhì)GG、蔗糖和海藻糖鹽誘導(dǎo)積累的調(diào)控機(jī)制。藍(lán)細(xì)菌相容性物質(zhì)的積累是合成和降解協(xié)同作用的結(jié)果，其調(diào)控可以發(fā)生在兩個水平——關(guān)鍵基因的表達(dá)(包括轉(zhuǎn)錄、翻譯)和關(guān)鍵酶的活性上。然而對于不同藍(lán)細(xì)菌，這兩個水平在相容性物質(zhì)代謝調(diào)控中的重要性存在諸多差異。

有些藍(lán)細(xì)菌中，細(xì)胞遭遇鹽脅迫后通過促進(jìn)關(guān)鍵合成酶基因的表達(dá)，同時抑制降解關(guān)鍵酶活性的方式來實(shí)現(xiàn)相容性物質(zhì)的積累，如Synechocystissp. PCC 6803中蔗糖的積累、N.punctiforme中海藻糖的積累。盡管對關(guān)鍵合成酶基因表達(dá)的促進(jìn)有利于相容物的合成，但該過程需要經(jīng)歷轉(zhuǎn)錄、翻譯等一系列過程，并不能立即實(shí)現(xiàn)細(xì)胞的生化響應(yīng)，所以對鹽脅迫前期的快速響應(yīng)主要是依賴對降解酶活性的抑制來實(shí)現(xiàn)，因此相容性物質(zhì)的積累量相對有限，很可能是這類小分子沒有被作為主要相容物而被積累的原因之一。

而對于藍(lán)細(xì)菌中被作為主要抗逆物而積累的相容性物質(zhì)(如Synechocystissp. PCC 6803的GG、S.elongatusPCC 7942中的蔗糖)，其代謝調(diào)控則主要通過對合成關(guān)鍵酶與降解關(guān)鍵酶的協(xié)同調(diào)控來實(shí)現(xiàn)。環(huán)境中升高的鹽濃度，不僅有效的激活了合成關(guān)鍵酶，同時還顯著的抑制了降解代謝關(guān)鍵酶。通過這種方式，藍(lán)細(xì)菌細(xì)胞可以在鹽脅迫后的短時間內(nèi)，迅速完成相容物質(zhì)的積累，并達(dá)到較高的水平。由于這種“離子濃度介導(dǎo)的酶活協(xié)同調(diào)控”方式能快速的讓細(xì)胞做出生化響應(yīng)，因此很可能是微生物界廣泛采用的一種鹽適應(yīng)調(diào)控策略。

不同藍(lán)細(xì)菌相容性物質(zhì)積累的調(diào)控機(jī)制不同，這提示著我們在相關(guān)代謝工程研究中要根據(jù)具體的目標(biāo)選擇合適的技術(shù)策略。在以往的代謝工程研究中，研究者采用的策略多包括啟動子優(yōu)化、替換或者增加基因拷貝數(shù)的方式，大量表達(dá)關(guān)鍵合成酶，同時敲除關(guān)鍵降解酶基因。但這些策略可能存在兩方面的問題：(1)細(xì)胞內(nèi)能承載的蛋白量有限。這對于僅依賴關(guān)鍵基因表達(dá)方式合成相容性物質(zhì)的藍(lán)細(xì)菌，提高工程菌株中目標(biāo)相容性物質(zhì)產(chǎn)量的前景是有限的。若能引入依賴酶學(xué)水平調(diào)控的關(guān)鍵酶替換原始底盤細(xì)胞內(nèi)的關(guān)鍵酶，可能會明顯提高工程菌株的生產(chǎn)效率； 若進(jìn)一步通過酶工程改造，獲得“始終激活”的突變酶，可能會實(shí)現(xiàn)“非鹽脅迫”合成相容性物質(zhì)。(2)藍(lán)藻細(xì)胞相容性物質(zhì)的積累是在高鹽條件下，細(xì)胞內(nèi)合成和降解代謝動態(tài)平衡的結(jié)果。因此，單純敲除競爭途徑，胞內(nèi)相容性物質(zhì)積累的濃度足以與細(xì)胞外的滲透壓平衡時，其濃度就難進(jìn)一步提高。由此可見，進(jìn)一步實(shí)現(xiàn)相容物的胞外分泌也是十分必要的，如在S.elongatusPCC 7942工程菌株中進(jìn)一步中引入蔗糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白CscB，實(shí)現(xiàn)蔗糖分泌，明顯提高了工程菌株的蔗糖產(chǎn)量。綜合上述分析，我們應(yīng)該針對不同藍(lán)細(xì)菌底盤細(xì)胞合成相容性物質(zhì)特異性調(diào)控策略進(jìn)行相應(yīng)地基因工程改造，通過系統(tǒng)性、差異性地調(diào)控轉(zhuǎn)錄、翻譯、酶活、分泌等過程，來進(jìn)一步挖掘藍(lán)細(xì)菌相容性物質(zhì)生物合成的應(yīng)用潛力。

未來，隨著對藍(lán)細(xì)菌鹽誘導(dǎo)相容性物質(zhì)調(diào)控機(jī)制的深入解析，光合固碳調(diào)控網(wǎng)絡(luò)等方面認(rèn)識的不斷加深，以及合成生物學(xué)和代謝工程手段的豐富和完善，光驅(qū)固碳高效定向生物合成相容性物質(zhì)的研究將會取得新的突破。