張藝新，戴蓓英，楊勇，陳真

(1.中國藥科大學藥學院，江蘇 南京 211198；2.中國藥科大學藥物科學研究院，江蘇 南京 211198；3.中國藥科大學基礎(chǔ)醫(yī)學與臨床藥學學院，江蘇 南京 211198)

細胞的生命活動基于錯綜復雜的信號傳導，其中多種信號分子的傳導依賴于正常運轉(zhuǎn)的核轉(zhuǎn)運系統(tǒng)(nuclear transport system，NTS)，如轉(zhuǎn)錄因子入核調(diào)控下游靶基因的表達以及靶基因產(chǎn)物出核發(fā)揮功能等。研究表明，核轉(zhuǎn)運異常會導致某些信號通路的持續(xù)激活或抑制，進而導致包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生。腫瘤的發(fā)生和發(fā)展常與多種信號蛋白異常的亞細胞定位相關(guān)，闡明信號蛋白的核轉(zhuǎn)運機制對于研究腫瘤發(fā)生發(fā)展過程至關(guān)重要。

1 核轉(zhuǎn)運系統(tǒng)的組成以及核轉(zhuǎn)運機制

核轉(zhuǎn)運系統(tǒng)主要由核孔復合體(nuclear pore complex，NPC)和核轉(zhuǎn)運受體(nuclear transport receptors，NTR)組成，可允許分子量大于40 kDa的大分子物質(zhì)進行選擇性的核-質(zhì)交換。NPC是鑲嵌在核膜上的一種運輸通道，由30多種核孔蛋白(nucleoporins，NUP)分別構(gòu)成胞質(zhì)纖絲、胞質(zhì)環(huán)、核質(zhì)環(huán)、核籃等NPC亞結(jié)構(gòu)[1]。約三分之一的NUPs都含有苯丙氨酸-甘氨酸(phenylalanine-glycine，F(xiàn)G)重復域，該結(jié)構(gòu)域可延伸至核孔的中央通道，用于構(gòu)建選擇性相關(guān)的網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)[1-2]。NTR主要由核蛋白-β(karyopherin-β)超家族組成，其中10個參與核輸入如importins，7個參與核輸出如exportins，2個參與雙向轉(zhuǎn)運，以及1個尚未鑒定的蛋白[3-4]。

通常，importin-α可識別貨物蛋白的核定位序列(nuclear localization sequence，NLS)并與之結(jié)合，然后與importin-β結(jié)合形成“NLS/importin-α/importin-β”三聚體[5]。此外，importin-β也可直接與NLS序列結(jié)合，而不依賴于importin-α。在這兩種情況下，importins和貨物蛋白復合體均可與NUP的FG重復域結(jié)合并通過NPC進入核內(nèi)，然后與Ran-GTP[Ran(ras-related nuclear protein)in complex with GTP]結(jié)合，從而使貨物蛋白與importins解離，隨后importins可與Ran結(jié)合，通過其特定的核輸出受體exportin-2重新穿梭至胞質(zhì)內(nèi)[6]，以進行下一次的核轉(zhuǎn)運。值得注意的是，有些蛋白可直接與NUP結(jié)合并轉(zhuǎn)運至核內(nèi)，而不依賴于NTR，如β-catenin、SMADs等[7]。在出核轉(zhuǎn)運過程中，貨物蛋白可通過其核輸出序列(nuclear export sequence，NES)與exportins和Ran-GTP在核內(nèi)形成三聚體，通過擴散作用出核。到達胞質(zhì)后，GTP被水解成GDP，貨物蛋白被釋放至胞質(zhì)內(nèi)[5,8]。

2 腫瘤相關(guān)信號分子的核轉(zhuǎn)運機制

2.1 p53信號通路 p53是一種腫瘤抑制蛋白，可通過調(diào)控細胞周期、細胞凋亡、DNA損傷修復等避免癌變的發(fā)生，因此其被稱為“基因組守護者”。臨床上約50%的腫瘤患者都存在p53的突變[9]。p53中NLS的泛素化可阻礙其與importin-α3結(jié)合，并抑制其向核內(nèi)轉(zhuǎn)運，滯留在胞質(zhì)內(nèi)的p53可被蛋白酶體降解，使得p53維持在較低的表達水平。在DNA損傷、癌基因異常激活等應(yīng)激條件下，p53泛素化水平降低，從而導致其NLS與importin-α3結(jié)合[10]，促進p53向核內(nèi)轉(zhuǎn)運，入核的p53可形成四聚體，使其NES被包裹在內(nèi)，并導致其不能與exportin-1結(jié)合而被滯留在核內(nèi)[11]，從而持續(xù)激活下游信號通路。綜上，早期importin-α3介導的p53主動轉(zhuǎn)運增強以及后期exportin-1介導的p53核輸出受阻均與DNA損傷、癌基因異常激活等應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)[12]。此外p53/MDM2調(diào)節(jié)因子RYBP的亞細胞定位對于p53功能的發(fā)揮十分重要[13]。Tan等[13]的研究表明，野生型RYBP主要定位于核內(nèi)，將其NLS進行突變后，RYBP則主要定位于胞質(zhì)內(nèi)。胞質(zhì)定位的RYBP突變體可顯著抑制MDM2介導的p53泛素化，從而抑制p53的降解并促使其向核內(nèi)轉(zhuǎn)運。因此，相比于野生型RYBP，定位于胞質(zhì)的RYBP突變體可顯著抑制細胞增殖并誘導其凋亡，這將為臨床腫瘤的治療提供新的思路[13]。

核轉(zhuǎn)運復合體除了可以介導p53的核轉(zhuǎn)運之外，還參與調(diào)控p53靶基因的表達，但這種功能不依賴于核轉(zhuǎn)運過程。例如exportin-2可以與p53靶基因(如TP53-AIP)的啟動子結(jié)合，從而誘導其表達[14]。此外，靶向RNAi篩選結(jié)果顯示，NUP98可通過與p21[15](CDKN1A，p53下游的細胞周期調(diào)控因子[16])mRNA的3′UTR區(qū)結(jié)合，從而在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)節(jié)p21的表達，避免p21被外泌體降解。p21在腫瘤生物學方面具有復雜的作用，既可抑制腫瘤的生長，但是在p53缺失的情況下又能促進腫瘤細胞的增殖。其復雜的生物學功能與多種決定因素相關(guān)，其中就包括p21的亞細胞定位[17-18]。作為p53的下游靶基因，核內(nèi)的p21通過其對細胞周期的調(diào)控作用抑制腫瘤細胞的增殖[17-19]，但是胞質(zhì)內(nèi)的p21可通過抑制pro-caspase 3、caspase 8,以及caspase 10發(fā)揮抗凋亡作用，因此胞質(zhì)內(nèi)的p21具有致癌性并可導致較差的預后[17-19]。Exportin-1可介導p21的核輸出[20]，因此exportin-1的過表達可促進p21在胞質(zhì)中的積累，從而發(fā)揮其促癌作用。

2.2 WNT/β-catenin信號通路CTNNB1外顯子3的錯義突變常會導致WNT級聯(lián)信號的異常激活。在這一過程中，β-catenin在核內(nèi)積聚，并與淋巴增強因子(LEF)/T細胞因子(TCF)相互作用，驅(qū)動MYC、CCND1等促癌基因的表達[21-22]，從而促進肝癌的發(fā)生。由于β-catenin不含有NLS，因此其核轉(zhuǎn)運不依賴于NTR和Ran-GTP[7]，而是通過直接與NUP62、NUP98、NUP153、NUP358結(jié)合并向核內(nèi)轉(zhuǎn)運[23]。截短體實驗表明，β-catenin通過其C端以及ARM重復序列(Armadillo repeats)與NUP結(jié)合被轉(zhuǎn)運至核內(nèi)[24]，同樣該區(qū)域可與Ran-BP3結(jié)合介導β-catenin的出核轉(zhuǎn)運[24-25]。盡管Ran-BP3是exportin-1的輔助因子，但是β-catenin的核輸出并不依賴于exportin-1[25]。綜上所述，β-catenin的入核和出核轉(zhuǎn)運均不依賴于NTR。

2.3 NF-κB信號通路 NF-κB信號通路在炎癥和免疫反應(yīng)中發(fā)揮重要作用，并且與炎癥相關(guān)型腫瘤的發(fā)生和發(fā)展密切相關(guān)。NF-κB作為轉(zhuǎn)錄因子可激活下游靶基因從而調(diào)控細胞增殖、凋亡、分化、應(yīng)激和免疫應(yīng)答等細胞活動[26]。NF-κB是由p50、p52、p65(RELA)、c-REL、RELB 5種亞基兩兩組合形成的二聚體，多數(shù)情況下是由p50和p65組成異二聚體[26]。IκBs(如IκBα、IκBβ)是NF-κB的抑制劑，其通過與NF-κB結(jié)合從而阻礙NF-κB的NLS序列與NTR結(jié)合，從而將NF-κB阻滯在胞質(zhì)內(nèi)[27]。當細胞受胞外信號刺激后，IκB激酶復合體使IκB磷酸化，隨后導致其泛素化并被蛋白酶體降解，從而暴露NF-κB的NLS，隨后NF-κB可迅速被轉(zhuǎn)運至核內(nèi)，誘導相關(guān)基因的表達[27]。

TNF-α可誘導NF-κB(p50/p65)向核內(nèi)轉(zhuǎn)運[27]，該轉(zhuǎn)運過程由importin-α3以及importin-α4介導。此外，NF-κB亞基與importin-α的結(jié)合具有特異性，如p52可直接與importin-α3、importin-α4、importin-α5、importin-α6結(jié)合；c-REL可與importin-α5、importin-α6、importin-α7結(jié)合；RELB可與importin-α5、importin-α6結(jié)合[27]。值得注意的是，NF-κB二聚體與importin-α結(jié)合的特異性僅取決于其中一個亞基，如RELB介導p52/RELB二聚體與importin-α的結(jié)合，p52則介導p52/p65二聚體與importin-α的結(jié)合[28]。NF-κB不僅可與NTR結(jié)合，同時還可與NUP88相互作用。過表達的NUP88可抑制NF-κB的核輸出，從而導致其在核內(nèi)積聚[29-31]。

2.4 Ras/MAPK和PI3K/AKT信號通路 受體酪氨酸激酶(RTK)如胰島素樣生長因子受體(IGF-R1)，可通過Ras/Raf/MEK/ERK信號通路促進細胞增殖和存活，亦可通過PI3K/AKT信號通路促進蛋白質(zhì)的合成以及葡萄糖代謝，最終發(fā)揮促腫瘤作用[32]。細胞外信號調(diào)節(jié)激酶(ERK1/2)的亞細胞定位對于Ras/Raf/MEK/ERK激酶級聯(lián)反應(yīng)至關(guān)重要。在生理條件下，MEK1/2可將ERK1/2錨定在細胞質(zhì)中[33]。當接受外界刺激后，MEK1/2對于ERK1/2的磷酸化修飾導致其構(gòu)象發(fā)生改變并與MEK1/2亞基分離，隨后importin-7識別ERK1/2激酶插入?yún)^(qū)中磷酸化的SPS(Ser-Pro-Ser)基序[34]，從而將ERK1/2轉(zhuǎn)運至核內(nèi)而不依賴于importin-α。也有研究證明ERK2可通過NTR依賴的方式入核[35-36]，其核輸出依賴于exportin-1[37]。胞質(zhì)內(nèi)Ca2+濃度也可影響ERK2的亞細胞定位，高濃度的Ca2+可增加ERK2與NUP153的結(jié)合，使ERK2滯留在核膜上從而抑制其向核內(nèi)轉(zhuǎn)運[38]。

在PI3K/AKT信號通路中，磷酸化的AKT可抑制TSC1和TSC2，從而激活mTORC1。激活的mTORC1對真核細胞翻譯起始因子(eIF4E)結(jié)合蛋白(4E-BPs)進行磷酸化修飾，使其與eIF4E分離。游離的eIF4E可使NPC胞質(zhì)側(cè)的成分發(fā)生重排，從而促進eIF4E下游靶基因mRNA(如CyclinD1、c-MYC、MDM2)向胞質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)運并翻譯成蛋白質(zhì)[39-40]。有研究表明，在上述過程中，eIF4E可促進Ran-BP1以及DDX19的表達，抑制NUP358/Ran-BP2表達，并能使NUP214重新定位。相反，NUP358/Ran-BP2過表達可抑制eIF4E靶基因mRna的核輸出，從而阻止腫瘤惡化[40]。

2.5 JAK/STAT信號通路 JAK/STAT信號通路可介導多種細胞因子，如表皮生長因子(EGF)、粒細胞/巨噬細胞集落刺激因子(GM-CSF)、白介素(IL)、干擾素(INF)等的信號傳導，從而參與調(diào)節(jié)細胞增殖、分化、免疫等重要的生物學過程。JAK/STAT信號通路在多種血液瘤和實體瘤中均處于持續(xù)激活狀態(tài)[41]。當上述細胞因子與胞膜上相應(yīng)的受體結(jié)合時，后者形成二聚體，從而激活胞內(nèi)的酪氨酸激酶(JAK)?；罨腏AK可使轉(zhuǎn)錄因子STAT磷酸化并形成二聚體，隨后被轉(zhuǎn)運至核內(nèi)，從而調(diào)節(jié)下游靶基因的表達。

STAT1和STAT3可以較高的親和力直接與importin-α5結(jié)合[42]，同時STAT3與importin-α7也存在較弱的相互作用，而STAT5a以及STAT5b則不與importin-α結(jié)合[43]。Riku等[42]的研究表明，STAT1與importin-α5的結(jié)合依賴于STAT1 DNA結(jié)合域中410～413位的氨基酸。STAT3與importin-α5的結(jié)合則依賴于STAT3中214和215位的精氨酸，其414和417位的精氨酸雖不直接參與STAT3與importin-α5的結(jié)合，但對于維持STAT3二聚體的構(gòu)象至關(guān)重要[43]。

在出核轉(zhuǎn)運方面，STAT1中400～409位氨基酸，以及其卷曲螺旋結(jié)構(gòu)域中302～314位的氨基酸均可充當NES與exportin-1結(jié)合，從而促進STAT1向胞質(zhì)內(nèi)轉(zhuǎn)運[42,44]。值得注意的是STAT1 400～409位的NES與其410～413位的NLS相鄰，因此STAT1中NES的突變不僅能影響其與exportin-1的結(jié)合，同時也可能干擾其NLS與importin-α5的相互結(jié)合[42]。

2.6 TGF-β信號通路 TGF-β超家族配體與TGF-β受體Ⅱ結(jié)合，后者可催化Ⅰ型受體的絲氨酸殘基磷酸化并使其活化，活化的Ⅰ型受體可使SMAD蛋白磷酸化并轉(zhuǎn)運至核內(nèi)，從而與核內(nèi)的其他輔因子一起調(diào)節(jié)靶基因的轉(zhuǎn)錄[45]。由于TGF-β信號通路通常會抑制細胞的生長，因此該通路的失活可促進腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[45]。此外，TGF-β受體和SMAD蛋白的突變在腫瘤中均有報道[45]。

TGF-β誘導的SMAD2、3磷酸化可降低其與SARA(定位于細胞質(zhì)的SMAD保留因子)的結(jié)合，從而促使其向核內(nèi)轉(zhuǎn)運[46]，但是SMAD2、3的入核轉(zhuǎn)運并不依賴于該磷酸化過程[46]。SMAD2、3的MH2結(jié)構(gòu)域含有3個疏水口袋，該疏水口袋可與CAN/NUP214、NUP153的FG重復域結(jié)合，從而促進SMAD2、3的入核轉(zhuǎn)運[46]。雖然SMAD2的核轉(zhuǎn)運不依賴于NTR，但是importin-β可通過與CAN/Nup214的競爭性結(jié)合抑制SMAD2向核內(nèi)轉(zhuǎn)運[47]。磷酸酶PPM1A可將p-SMAD2、3去磷酸化，以促進RanBP3與SMAD2、3的結(jié)合，從而促進SMAD2、3的出核轉(zhuǎn)運[48]。

SMAD蛋白家族包括R-SMAD、Co-SMA、I-SMAD 3個亞家族，分別為SMAD1-9[49]。與SMAD2、3相似，SMAD4的入核轉(zhuǎn)運同樣不依賴于NTR，是由CAN/NUP214以及NUP153介導的，但是該過程不受SARA的影響[46]。SMAD4的出核轉(zhuǎn)運依賴于exportin-1。磷酸化的SMAD2、3或其他轉(zhuǎn)錄輔助因子可通過與SMAD4結(jié)合，從而干擾SMAD4與exportin-1的相互作用，導致SMAD4在細胞核中積聚[46]。

2.7 人端粒酶催化亞基(hTERT) 端粒是真核染色體末端的核蛋白復合物，對于維持染色體的完整性至關(guān)重要。高度保守的端粒DNA在每次復制后都會縮短，當端粒縮短至一定程度，細胞則停止分裂。因此，端粒的長短和穩(wěn)定性決定了細胞的壽命，并與細胞的衰老和癌變密切相關(guān)[50]。染色體末端端粒重復序列的從頭合成需要端粒酶的催化，該酶在成人體細胞中不表達，但腫瘤細胞可通過激活端粒酶的表達來躲避“端粒危機”，從而獲得永生化。

腫瘤細胞內(nèi)端粒酶的活化依賴于人端粒酶催化亞基(hTERT)的入核轉(zhuǎn)運。有研究表明，在hTERT的222～224位以及236～240位的氨基酸可作為其NLS，同時，這兩個NLS之間的227位絲氨酸的磷酸化對于hTERT的入核轉(zhuǎn)運也是必需的[51]。NLS的磷酸化可導致hTERT構(gòu)象改變并暴露其NLS[51-52]，后者可與importin-α1、3、5以及importin-β結(jié)合，并以Ran依賴的方式將hTERT轉(zhuǎn)運至核內(nèi)[51]。其次，hTERT磷酸化導致的構(gòu)象轉(zhuǎn)換也可能暴露其與其他因子結(jié)合的位點，例如，AKT激酶對hTERT的磷酸化可促進hTERT與NF-κB p65亞基的結(jié)合，二者結(jié)合后可迅速轉(zhuǎn)移至核內(nèi)，從而激活端粒酶并使端粒得到延長[53]。

hTERT 970-981位的NES通過與exportin-1結(jié)合從而將hTERT轉(zhuǎn)運至胞質(zhì)內(nèi)[54]。有研究表明，14-3-3蛋白可通過其C端與hTERT的C端結(jié)合，抑制hTERT的NES與exportin-1的結(jié)合，從而抑制hTERT向核外轉(zhuǎn)運[54]。

2.8 JNK/c-Jun信號通路 JNK可被多種細胞因子(如腫瘤壞死因子α、白介素-1、表皮生長因子)、應(yīng)激條件(如氧化損傷，電離輻射)等多種因素激活并轉(zhuǎn)運至核內(nèi)，核內(nèi)的JNK可調(diào)節(jié)包括c-Jun在內(nèi)的多種轉(zhuǎn)錄因子的活性，轉(zhuǎn)錄因子c-Jun可通過激活其下游靶基因從而調(diào)控腫瘤的發(fā)生和發(fā)展[55]。在腫瘤中，異常激活的c-Jun可使PI3K、ERK介導的增殖相關(guān)通路持續(xù)活化[56]，并可使p53、Bcl-2介導的凋亡通路受阻，從而加速腫瘤的生長。在此過程中，c-Jun的活化依賴于其在細胞核中的定位，因此c-Jun在細胞核中的異常積累是導致腫瘤發(fā)生和發(fā)展的重要因素。

c-Jun有兩種入核方式。首先，它可通過其273～276位的NLS與多種NTR(如importin-5、importin-7、importin-8、importin-9、importin-13、importin-β和transportin)結(jié)合，并以Ran依賴的方式轉(zhuǎn)運至核內(nèi)，這使得c-Jun的核轉(zhuǎn)運不依賴于某種特定的NTR，從而確保其能穩(wěn)定地轉(zhuǎn)運至核內(nèi)發(fā)揮作用[57]。但是importin-α會抑制c-Jun向核內(nèi)轉(zhuǎn)運[58]。值得注意的是，在NLS中，273和275位氨基酸的突變會顯著降低c-Jun與importin-5、importin-9、importin-13以及importin-β的結(jié)合，而幾乎不影響其與importin-7或transportin的結(jié)合[58]。其次，c-Jun可通過“搭載”機制轉(zhuǎn)運至核內(nèi)。c-Jun可與其他含有堿性亮氨酸拉鏈的內(nèi)源性蛋白(如 c-Fos)形成異源二聚體，然后通過這些蛋白的NLS與importins結(jié)合，從而轉(zhuǎn)運至核內(nèi)[57-58]。這些異二聚體在通過NPC時可能需要多種轉(zhuǎn)運蛋白的參與[73]。

有研究表明，c-Jun的入核不依賴于JNK介導的磷酸化以及二者的相互作用[57]。但是，c-Jun與JNK的結(jié)合可促進JNK向核內(nèi)轉(zhuǎn)運[57]。c-Jun在核內(nèi)的積累不依賴于其DNA結(jié)合能力，其核輸出也不依賴于exportin-1[57]。

3 總結(jié)與展望

以往對腫瘤發(fā)生發(fā)展的機制研究，大多集中在信號蛋白的異常表達或基因的異常轉(zhuǎn)錄上，而較少關(guān)注蛋白在亞細胞定位方面的差異。本文著重介紹了8種經(jīng)典的腫瘤相關(guān)蛋白的核轉(zhuǎn)運機制，這將有助于了解腫瘤發(fā)生和發(fā)展的機制，并對腫瘤治療及預后評估至關(guān)重要。未來需要進一步的研究來闡明核轉(zhuǎn)運蛋白作為診斷、預后標志物，以及臨床治療靶標的潛力。