孫強，邵立功，劉斌，牛家豐

(1.山東省食品藥品審評查驗中心,山東 濟南 250012；2.泰安市食品藥品檢驗檢測研究院，山東 泰安 271000；3.棗莊市食品藥品檢驗檢測中心,山東 棗莊 277299)

《中國藥典》2015年版中規(guī)定[1]漏蘆(RadixRhapontici)為菊科植物祁州漏蘆的干燥根，祁州漏蘆又名為野蘭、和尚頭、狼頭花，是多年生草本植物，廣泛分布于中國東北、西北、華中地區(qū)。具有清熱解毒、消癰、下乳的功效，常用于治療乳癰腫痛、乳汁不通等婦科病[2]。在漏蘆的日常檢驗中發(fā)現(xiàn)多批樣品為漏蘆偽品大火草根(AnemonetomentosaRoot)或與其摻雜在一起。大火草俗稱甘肅白頭翁為毛茛科銀蓮花屬多年生草本植物，主要分布在四川、甘肅、河南等地[3]，常用于治療痢疾、各種頑癬、瘡癤癰腫，也可作小兒驅(qū)蟲藥，有一定的毒性。

通常大火草根飲片可以通過性狀和顯微進行有效的鑒別，但少量混入漏蘆中的樣品卻不易被發(fā)現(xiàn)，查詢相關(guān)文獻，沒有發(fā)現(xiàn)相關(guān)鑒別的報道。本文開發(fā)了超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法測定大火草根中齊墩果酮酸含量的檢測方法，通過該方法能夠快速有效的篩查漏蘆摻偽的樣品或相關(guān)中成藥樣品，為以后漏蘆藥材真?zhèn)舞b別以及相關(guān)中成藥的質(zhì)量控制提供參考依據(jù)。

1 儀器與試藥

1.1 儀器 島津LCMS-8050型超高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜儀，配島津LC-30AD超高效輸液泵，LC solution工作站；XS205DU十萬分之一電子天平(Mettler Toledo)；Milli-Q純水器(美國密理博公司)；KQ-250DE型數(shù)控超聲波清洗儀(昆山舒美)。

1.2 試藥 齊墩果酮酸對照品(上海源葉生物科技有限公司，批號：c03m8q30462)；漏蘆對照藥材(中檢院，批號：121036-201603)；15批漏蘆樣品在市場采購后，經(jīng)泰安市食品藥品檢驗檢測研究院展雪峰主任藥師鑒定后進行編號(1～8號為未摻偽樣品，9～11號為摻偽樣品，12～15號為偽品)；甲醇(HPLC級別，F(xiàn)isher Chemical)；水為Milli-Q制水。

2 試驗方法

2.1 色譜和質(zhì)譜條件 色譜柱：Shim-pack FC-ODS C18色譜柱(4.6 mm×150 mm，2.7 μm)；柱溫：40 ℃；進樣量：2 μL；流動相：甲醇-1.0 mmol·L-1醋酸銨水溶液(85∶15)；流速：0.2 mL·min-1；離子源：電噴霧離子源(ESI)；掃描方式：負離子模式；工作模式：多反應檢測模式，MRM參數(shù)見表1；霧化氣：3 L·min-1；加熱氣：10 L·min-1；干燥氣：10 L·min-1。

2.2 溶液的制備

2.2.1 對照品溶液的制備 精密稱取齊墩果酮酸對照品適量，分別加甲醇制成質(zhì)量濃度為512 μg·mL-1的對照品貯備液。精密量取貯備液適量，加甲醇分別制成濃度為2 560、1 280、512、256、128、25.6 ng·mL-1標準曲線對照溶液。

2.2.2 漏蘆樣品溶液的制備 精密稱定漏蘆對照藥材1.0 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理(功率300 W，頻率50 kHz)20 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，精密量取上清液1 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.22 μm)濾過，即得漏蘆供試液。

2.2.3 漏蘆根莖溶液的制備 單獨挑取2、7號樣品中混入的根莖，研細，精密稱取1.0 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理(功率300 W，頻率50 kHz)20 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，精密量取上清液1 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.22 μm)濾過，即得漏蘆根莖供試液。

2.2.4 漏蘆偽品溶液的制備 取偽品研細過三號篩，精密稱定1.0 g，置具塞錐形瓶中，精密加入甲醇25 mL，稱定重量，超聲處理(功率300 W，頻率50 kHz)20 min，放冷，再稱定重量，用甲醇補足減失的重量，搖勻，精密量取上清液1 mL，置50 mL量瓶中，加甲醇定容至刻度，搖勻，用微孔濾膜(0.22 μm)濾過，即得偽品供試液。

3 方法學驗證

3.1 專屬性考察 分別取空白試劑溶液、漏蘆對照樣品溶液、漏蘆根莖溶液、齊墩果酮酸對照品溶液、漏蘆偽品溶液按“2.1”項下色譜和質(zhì)譜條件進樣，TIC結(jié)果見圖1，MRM色譜圖見圖2。通過TIC總離子流圖可見空白試劑溶液、漏蘆對照樣品溶液、漏蘆根莖溶液沒有相關(guān)干擾峰，偽品含齊墩果酮酸的定量離子與定性離子與對照品一致。

A.空白試劑溶液(blank sample)；B.漏蘆對照藥材(reference crude drug of Radix Rhapontici)；C.漏蘆根莖(Radix Rhapontici Root and Stem)；D.齊墩果酮酸(oleanonic acid)；E.大火草根(Anemone tomentosa Root)

圖2 齊墩果酮酸離子對色譜圖

3.2 線性關(guān)系、LOD及LOQ 取“2.2.1”項下的標準曲線對照溶液，按“2.1”項下的色譜質(zhì)譜條件進樣進行采集，記錄色譜圖并計算相應的色譜峰面積。以濃度(ng·mL-1)為橫坐標，峰面積為縱坐標進行線性回歸，齊墩果酮酸的回歸方程分別為：Y=1.616×105X+0.985×103(r=0.996)。結(jié)果表明齊墩果酮酸在25.6～2 560 ng·mL-1范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。取不含齊墩果酮酸的空白溶液，加入對照品適量按“2.1”項下的色譜和質(zhì)譜條件進樣進行采集，LOD及LOQ分別以三倍S/N和十倍S/N計，其結(jié)果分別為0.6、2.0 μg·L-1。

3.3 精密度及重復性試驗 取512 ng·mL-1對照品溶液，重復進樣6次，測定峰面積，以峰面積考察精密度，齊墩果酮酸的RSD為0.6%；按“2.2.2”項下，平行制備同一樣品(編號為11)6份，依上述色譜條件依法進行測定，并分別計算含量，齊墩果酮酸的含量平均值分別為0.66 mg·g-1，RSD為0.6%。

3.4 回收率試驗 精密稱取11號樣品1.0 g，分成9份，分別精密加入對照貯備液0.65、1.3、1.95 mL，照“2.2.2”項下方法制成加樣回收供試液，依上述色譜質(zhì)譜條件依法進行測定，并分別計算回收率，結(jié)果見表1。

表1回收率試驗結(jié)果

3.5 樣品測定 按“2.2.2”項下方法制備供試品溶液，按上述色譜質(zhì)譜條件，注入質(zhì)譜儀，記錄色譜圖，用外標法計算樣品中齊墩果酮酸的含量。結(jié)果按1～15編號計分別為1～8號均未檢出(低于檢出限)、9～11號0.45～0.66 mg·g-1、12～15號0.99～1.27 mg·g-1。

4 討論

4.1 指標化合物的篩選 漏蘆為菊科植物而大火草為毛茛科植物，兩個不同科屬的植物肯定含有不同化合物，通過對比漏蘆和大火草根的化學成分[4-6]，初步篩選出來過氧麥角甾醇、齊墩果酮酸、異秦皮啶等多種化合物。這些化合物均在存在于大火草根中而不存在于漏蘆中，可以作為鑒別用的指標性成分。

4.2 檢測器的篩選 通過第一步化合物的篩選后進行相關(guān)檢測器的選擇，有些化合物紫外吸收強烈而有的在蒸發(fā)光檢測器中吸收強度高[7-8]。通過配制混合對照品溶液、漏蘆樣品和大火草根樣品溶液，分別用DAD及ELSD檢測器進行檢測，通過篩查發(fā)現(xiàn)齊墩果酮酸在大火草根的ELSD中的吸收較高而在漏蘆中未檢出，為了進一步對其進行定性及定量分析故采用高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法對其進行測定。

4.3 通過對市場的考察發(fā)現(xiàn)，漏蘆中摻偽大火草根的情況還是常見的，制定相關(guān)檢驗鑒別的方法是十分必要和重要的。使用本法測定其結(jié)果準確性、靶向性高，可有效地控制漏蘆的質(zhì)量，為漏蘆藥材真?zhèn)舞b別及其中成藥的摻偽鑒別有一定的借鑒意義。