蔣文文，張媛潔，李高攀，宋煜，吳水生

(福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院，福建 福州 350122)

常綠鉤吻堿(sempervirine，SPV，見(jiàn)圖1)為鉤吻中微量的育亨賓型生物堿，1949年從鉤吻中首次分離，其化學(xué)結(jié)構(gòu)和特征陸續(xù)被Nature、JACS等文獻(xiàn)報(bào)道[1-2]，也逐漸因其具有顯著抗腫瘤、鎮(zhèn)痛抗炎等生物活性而被廣泛關(guān)注[3-5]。課題組前期對(duì)鉤吻生物堿單體進(jìn)行抗腫瘤活性評(píng)價(jià)，發(fā)現(xiàn)SPV具有顯著抗神經(jīng)膠質(zhì)瘤的作用，其有效抗腫瘤質(zhì)量濃度低至0.273 μg·mL-1[6]。此外，課題組在給小鼠口服灌胃SPV 2 g·kg-1時(shí)發(fā)現(xiàn)小鼠于給藥后1周內(nèi)一直存活，且它對(duì)蟾蜍鼻纖毛也無(wú)毒性作用，提示其可能具有良好的安全性。因此，無(wú)論從有效性還是安全性方面皆證實(shí)SPV的成藥性潛力巨大。截至目前SPV未有上市的產(chǎn)品，為了便于SPV的臨床應(yīng)用，課題組欲將SPV進(jìn)行劑型開(kāi)發(fā)，但國(guó)內(nèi)外很少有關(guān)于SPV理化性質(zhì)和生物學(xué)性質(zhì)的研究報(bào)道。故本文對(duì)SPV進(jìn)行了理化參數(shù)的研究，考察了SPV在不同pH磷酸鹽緩沖溶液中的平衡溶解度和正辛醇-PBS系統(tǒng)的油水分配系數(shù)、并測(cè)定了SPV的解離常數(shù)，從而有助于預(yù)測(cè)藥物在體內(nèi)的吸收情況，并為其劑型設(shè)計(jì)提供依據(jù)。

圖1 SPV的結(jié)構(gòu)式

1 儀器與試藥

Waters Acquity UPLC system超高效液相色譜儀(配有四元溶劑管理器、樣品管理器和PDA檢測(cè)器，沃特世公司)；pH計(jì)(常州奧豪斯儀器有限公司)；ZHWY-200D恒溫培養(yǎng)振蕩器(上海智城分析儀器制造有限公司)；H2050R高速冷凍離心機(jī)(湖南湘儀實(shí)驗(yàn)室儀器開(kāi)發(fā)有限公司)；ME204E型萬(wàn)分之一電子天平(上海梅特勒-托利多儀器有限公司)；GT-2120QTS智能超聲波清洗機(jī)(廣東固特超聲股份有限公司)；Milli-Q型超純水儀(美國(guó)Millipore公司)；紫外可見(jiàn)分光光度計(jì)(上海尤尼柯儀器有限公司)。

常綠鉤吻堿對(duì)照品(武漢天植生物技術(shù)有限公司，批號(hào):CFS201902，規(guī)格:5 mg，純度≥98%)；常綠鉤吻堿樣品(由福建中醫(yī)藥大學(xué)藥學(xué)院3408實(shí)驗(yàn)室提供，純度≥98%)；正辛醇(上海麥克林生物化學(xué)有限公司，批號(hào)：C12180043)，甲醇、乙腈、甲酸為色譜純，其他試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 色譜條件 Acquity UPLC BEN C18色譜柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)，流動(dòng)相:乙腈-0.5%甲酸水，流速:0.25 mL·min-1，檢測(cè)波長(zhǎng):242 nm，柱溫:45 ℃，進(jìn)樣量:2 μL，色譜圖見(jiàn)圖2。

A.SPV對(duì)照品色譜圖；B.SPV樣品色譜圖

2.2 對(duì)照品溶液的制備 精密稱取SPV對(duì)照品1.0 mg置5 mL容量瓶中，用甲醇定容，即得對(duì)照品溶液。

（1）改變經(jīng)濟(jì)發(fā)展模式，大大優(yōu)化農(nóng)業(yè)產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)。在水價(jià)政策的推動(dòng)下，轉(zhuǎn)變村民的理念，大力發(fā)展以節(jié)水增收為原則的溫室大棚，以養(yǎng)羊?yàn)橹鞯臏嘏铮约疤厣a(chǎn)業(yè)如釀酒，紅棗，枸杞等特色產(chǎn)業(yè)的發(fā)展。

2.5 線性范圍考察 分別取2.2項(xiàng)下SPV對(duì)照品溶液0.125、0.375、0.625、0.875、1.25、1.5 mL，置于10 mL容量瓶中，用甲醇稀釋并定容至刻度，搖勻。按“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定，以峰面積為縱坐標(biāo)(Y)，濃度為橫坐標(biāo)(X)進(jìn)行回歸，得回歸方程Y=30 048X-62 693(r=0.999 9)，線性范圍2.5～30 mg·L-1。

2.4 專屬性試驗(yàn) 對(duì)照品溶液、供試品溶液、空白溶液在“2.1”項(xiàng)下色譜條件下乙腈-0.5%甲酸水溶劑測(cè)定無(wú)干擾，專屬性良好。

2.6 精密度試驗(yàn) 精密吸取對(duì)照品溶液，甲醇稀釋到適當(dāng)濃度，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)進(jìn)樣6次，精密度的RSD值為1.10%，表明儀器精密度良好。

pKa=pH + lg[(A-Au)/(Ai-A)]

Au為分子狀態(tài)下的吸光度，Ai為解離狀態(tài)下的吸光度，A為混合狀態(tài)下的吸光度。

隨機(jī)通達(dá)教學(xué)的基本原理是：對(duì)于同一教學(xué)內(nèi)容，要在不同時(shí)間，在重新安排的情境下。帶著不同的目的，從不同的角度多次學(xué)習(xí)，由此來(lái)達(dá)到高級(jí)知識(shí)獲得的目標(biāo)。（李明振等，2007））這就要求教師教學(xué)活動(dòng)設(shè)計(jì)要靈活變換形式，每次知識(shí)點(diǎn)的呈現(xiàn)都有不同的學(xué)習(xí)目的，不同的側(cè)重點(diǎn)，而并非知識(shí)的簡(jiǎn)單重復(fù)，此外，還要注重知識(shí)的情境性。

2.9 回收率試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液用甲醇稀釋到高、中、低濃度，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件分別進(jìn)樣3次，測(cè)得回收率分別為99.47%、99.76%、100.37%，RSD分別為0.85%、1.02%、1.44%，符合測(cè)定要求。

3 平衡溶解度的測(cè)定

步驟3 根據(jù)上層模型決策變量Wli的值Wlit，代入上層模型的目標(biāo)函數(shù)中，獲得上層函數(shù)目標(biāo)g值，當(dāng)g符合滿意值范圍時(shí)(上層約束條件)，轉(zhuǎn)入步驟4；當(dāng)g不符合滿意值范圍時(shí)，轉(zhuǎn)入步驟1，置t=t+1,重新選取區(qū)域醫(yī)療衛(wèi)生資源(醫(yī)生、醫(yī)療床位)配置的決策變量的值，直g到符合滿意值范圍為止；

按照《中國(guó)藥典》2020年版(四部)通則[7]，分別配制pH分別為1.2、2.0、4.0、6.8、7.4的磷酸鹽緩沖液，取過(guò)量SPV于5 mL具塞離心管中，分別加入不同pH(1.2、2.0、4.0、6.8、7.4)的磷酸鹽緩沖液，超聲20 min，在37 ℃恒溫振蕩器振搖48 h后迅速取出，于離心機(jī)37 ℃，15 000 r·min-1離心10 min，取上清液用甲醇適當(dāng)稀釋，過(guò)0.22 μm濾膜，吸取續(xù)濾液，在“2.1”項(xiàng)下色譜條件下測(cè)定，平行操作3次，記錄峰面積，計(jì)算其濃度。結(jié)果見(jiàn)圖3，結(jié)果表明SPV在pH 1.2～6.8的磷酸鹽緩沖液中的溶解度隨pH的增大而增大，在pH 6.8～7.4的磷酸鹽緩沖液中的溶解度隨著pH增大逐漸減小。

隨著信息學(xué)的高速發(fā)展，人們對(duì)信息的交互和傳遞的需求越來(lái)越大。每天都會(huì)有海量的數(shù)據(jù)進(jìn)行交互和傳遞，因此，數(shù)據(jù)的安全成為一個(gè)非常重要的話題。RSA數(shù)字簽名算法有效保證了消息的真實(shí)性、完整性、不可否性，起到了巨大的作用。但是RSA數(shù)字簽名算法本身仍然存在一些不足之處，也值得我們進(jìn)一步深入研究。

圖3 SPV在不同pH磷酸鹽緩沖液中溶解度(n=3)

4 油水分配系數(shù)的測(cè)定

精密吸取含SPV的水飽和正辛醇2 mL，置5 mL具塞離心管中，分別加入不同pH(1.2、2.0、4.0、6.8、7.4)的磷酸鹽緩沖液，37 ℃超聲溶解20 min，將具塞離心管放入恒溫振蕩器中，控制溫度(37±0.5)℃,振搖48 h直至平衡，離心10 min(15 000 r·min-1，37 ℃)，取上清液用甲醇稀釋到適當(dāng)濃度，經(jīng)0.22 μm濾膜濾過(guò)，吸取續(xù)濾液，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，平行操作3次，記錄峰面積。分別計(jì)算其濃度，并計(jì)算表觀油水分配系數(shù)Papp，計(jì)算公式如下：

Papp=Co/Cw

公式(1)

Co為平衡時(shí)SPV在正辛醇中的濃度，Cw為平衡時(shí)SPV在水相中的濃度。

SPV在pH 1.2～6.8的磷酸鹽緩沖液中的油水分配系數(shù)隨pH的增大而減小，在pH 6.8～7.4的磷酸鹽緩沖液中的油水分配系數(shù)趨于平緩，隨著pH增大逐漸增大，結(jié)果見(jiàn)圖4。

啟發(fā)教學(xué)實(shí)踐中，教師最重要的就是要擺正自己的主導(dǎo)位置，把課堂的主動(dòng)權(quán)交付給學(xué)生，讓學(xué)生變成課堂教學(xué)的主動(dòng)參與者，而教師則是負(fù)責(zé)引導(dǎo)學(xué)生進(jìn)行探究性學(xué)習(xí)，充分肯定學(xué)生在課堂上的積極表現(xiàn)，鼓勵(lì)學(xué)生大膽自主創(chuàng)新，激發(fā)學(xué)生創(chuàng)造力。

圖4 SPV在不同pH磷酸鹽緩沖液中油水分配系數(shù)(n=3)

5 解離常數(shù)的測(cè)定

精密稱取SPV 5 mg置于10 mL容量瓶中，加入適量甲醇超聲溶解后用甲醇定容至刻度，搖勻后作為儲(chǔ)備液備用。取0.5 mL儲(chǔ)備液于25 mL容量瓶中，加入不同pH的磷酸鹽緩沖液定容至刻度，室溫下進(jìn)行200～400 nm范圍內(nèi)紫外掃描[8-10]。測(cè)定藥液在254 nm和274 nm處的吸光度(A)值，計(jì)算pKa。計(jì)算公式如下：

2.7 重復(fù)性試驗(yàn) 供試品的制備方法制備6份供試品溶液，甲醇稀釋到適當(dāng)濃度，按“2.1”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣，計(jì)算RSD值為1.48%，表明方法重復(fù)性良好。

公式(2)

2.8 穩(wěn)定性試驗(yàn) 取對(duì)照品溶液用甲醇稀釋到高、中、低濃度，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件連續(xù)7 d進(jìn)樣，檢測(cè)峰面積并計(jì)算RSD分別為1.33%、0.94%、0.62%。RSD均小于2%，表明常綠鉤吻堿在7 d內(nèi)基本保持穩(wěn)定。

[9]...goals for the country’s development,“common prosperity”,is looking far harder to attain.Even if richer provinces were to slow down,they reckoned,the high growth potential of inland regions would compensate for that.（2016-10-01）

2.3 供試品溶液的制備 取樣品溶液適量(制備方法見(jiàn)平衡溶解度測(cè)定)，經(jīng)0.22 μm濾膜濾過(guò)，取續(xù)濾液，加甲醇稀釋一定倍數(shù)得供試品溶液。

由圖5可知SPV在pH 9.99～10.37范圍內(nèi)吸光度無(wú)明顯變化，可看作離子狀態(tài)；在pH 10.37～11.16吸光度隨pH增加而增大，此時(shí)為離子和分子的混合狀態(tài)；在pH 11.64～11.99范圍內(nèi)在同一波長(zhǎng)下的紫外吸收行為一致，可看作分子狀態(tài)。將所測(cè)得的A值代入上述解離常數(shù)pKa公式，結(jié)果見(jiàn)表1，得SPV的pKa值為11.10±0.15。

圖5 SPV在不同pH磷酸鹽緩沖液中的吸光度(n=3)

表1 SPV的pKa值測(cè)定結(jié)果

6 討論

由于人體正常溫度在37 ℃左右，所以選擇37 ℃作為藥物溶解度和油水分配系數(shù)的測(cè)定溫度。SPV平衡時(shí)間分別考察了12、24、48和72 h，結(jié)果發(fā)現(xiàn)SPV在48 h時(shí)達(dá)到溶解平衡，故選擇48 h為平衡時(shí)間。正辛醇的溶解度參數(shù)與細(xì)胞膜的溶解度參數(shù)相近，對(duì)藥物透過(guò)細(xì)胞膜能力有一定的參考性[11]，因此選擇正辛醇-PBS體系測(cè)定藥物的油水分配系數(shù)。

平衡溶解度是評(píng)價(jià)藥物溶解性能的重要參數(shù)[12]，從測(cè)定結(jié)果可以看出，在pH 1.2～7.4磷酸鹽緩沖液中，SPV的平衡溶解度為285.356～557.945 mg·L-1，SPV在此pH環(huán)境內(nèi)溶解度均較低。

相對(duì)于一般決策，在偵查過(guò)程中，偵查工作有著很強(qiáng)的時(shí)限性，絕大多數(shù)偵查決策都需要在十分有限的時(shí)間內(nèi)作出決策。如在案件發(fā)生后，有目擊者反映犯罪分子的體貌特征、逃跑路線等，作為偵查指揮人員，需要在短時(shí)間內(nèi)作出決策，是完全相信目擊者的證言還是對(duì)其證言保留懷疑呢?是進(jìn)行通緝通報(bào)還是進(jìn)行追緝堵截呢?而這時(shí)偵查人員所能夠收集到的信息不可能是充分的，更不可能將所有能夠收集的信息都收集到后再?gòu)娜葑鳑Q策。決策時(shí)間緊迫決定了偵查決策必然具有很大的風(fēng)險(xiǎn)。

油水分配系數(shù)是反映藥物透膜吸收、評(píng)價(jià)藥物脂溶性大小的重要指標(biāo)[13]，研究表明藥物口服最佳吸收范圍的油水分配系數(shù)為-1

解離常數(shù)是反映藥物在不同pH環(huán)境下的解離狀態(tài)，通常藥物以分子形態(tài)透過(guò)細(xì)胞膜進(jìn)行藥物吸收，解離后的離子狀態(tài)不易透過(guò)細(xì)胞膜，難以吸收[15]。本研究采用紫外分光光度法測(cè)得SPV的解離常數(shù)為11.10，分子結(jié)構(gòu)中有季銨鹽結(jié)構(gòu)，屬于堿性化合物。因此，SPV在體內(nèi)生理pH環(huán)境中可能多以解離型形式存在，而非易于透膜吸收的分子形態(tài)，推測(cè)其解離狀態(tài)將會(huì)影響其透膜吸收能力。

綜上所述，本研究通過(guò)對(duì)SPV平衡溶解度、油水分配系數(shù)和pKa的考察，推測(cè)SPV在生物膜上的滲透性和體內(nèi)吸收。根據(jù)平衡溶解度結(jié)果可知，SPV雖然有一定的親脂性，然而它溶解度低，且絕大多數(shù)以離子形式存在，它在生理pH的環(huán)境中吸收有限[16]。因此，在SPV的新制劑設(shè)計(jì)開(kāi)發(fā)時(shí)，須采用藥劑學(xué)手段進(jìn)一步提升其溶解度，如可考慮通過(guò)制成微乳[17]等劑型的方法提高溶解度，促進(jìn)滲透吸收，增加藥物生物利用度。本研究結(jié)果為SPV劑型的開(kāi)發(fā)和研究提供理論參考依據(jù)。