胡偉，曹磊，董巖，付生軍，楊立

(蘭州大學(xué)第二醫(yī)院泌尿外科，蘭州 730030)

缺血再灌注損傷(ischemia reperfusion injury，IRI)是臨床常見(jiàn)的病理性損害，多發(fā)生于休克、嚴(yán)重創(chuàng)傷以及器官移植等手術(shù)過(guò)程中[1]。而再灌注后的炎癥可進(jìn)一步加重IRI[2]，甚至造成不可逆性損害。炎癥損傷是影響缺血組織再灌注治療獲益的主要原因，也是影響移植器官早期功能恢復(fù)及患者長(zhǎng)期存活的獨(dú)立危險(xiǎn)因素[3]。IRI是一種無(wú)菌性炎癥，以往可通過(guò)清除自由基、減輕鈣超載及抗炎等減輕這種炎癥損傷[4]。近年來(lái)，中藥因不良反應(yīng)小、治療窗寬、價(jià)格低廉等特點(diǎn)在抗炎治療方面優(yōu)勢(shì)顯著。紫草及其制劑在中醫(yī)臨床治療中廣泛應(yīng)用，而紫草素是一種從紫草根中提取的萘醌類(lèi)活性單體成分[5]，目前尚未應(yīng)用于臨床治療。隨著國(guó)家對(duì)中醫(yī)藥研究的積極推動(dòng)，關(guān)于紫草素藥用價(jià)值的理論研究已成為研究熱點(diǎn)，目前主要集中于皮膚、肝臟、腫瘤防治等領(lǐng)域。紫草素在腫瘤細(xì)胞凋亡、壞死、自噬等過(guò)程中發(fā)揮重要作用，另外，紫草素在減輕組織器官I(mǎi)RI的研究報(bào)道也日益增多，但目前研究主要處于細(xì)胞和動(dòng)物實(shí)驗(yàn)階段[6-8]?，F(xiàn)就紫草素在IRI中的應(yīng)用研究予以綜述。

1 紫草素

紫草素主要以新疆紫草、內(nèi)蒙紫草和滇紫草為來(lái)源[5]。臨床上常用紫草素治療急、慢性肝炎；局部應(yīng)用紫草素可治療皮膚燒傷、促進(jìn)傷口愈合；紫草素油型制劑還可用于治療皮炎、濕疹等；眼科常用紫草素治療單純皰疹病毒性角膜炎；紫草及其衍生物亦常被作為藥物、化妝品及食品的著色劑[9-10]。

紫草素不易溶于水，可溶于無(wú)水乙醇等有機(jī)溶劑，與非離子表面活性劑調(diào)配后可制成水溶液，在堿性溶液中溶解度較高，遇酸則沉淀析出[10-11]。同位素放射示蹤實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，紫草素進(jìn)入小鼠體內(nèi)后迅速發(fā)生代謝轉(zhuǎn)化，經(jīng)灌胃或肌內(nèi)注射1 min后即可在血漿中測(cè)得放射性，5～7 min達(dá)高峰，但首關(guān)效應(yīng)明顯，因此經(jīng)口服或腹腔注射的生物利用度較低，僅為34.3%[12]。食物對(duì)紫草素的吸收有促進(jìn)作用[13]，紫草素入血后與血漿蛋白結(jié)合率高，聯(lián)合用藥時(shí)可能與其他藥物產(chǎn)生競(jìng)爭(zhēng)作用，影響藥效的發(fā)揮；另外，紫草素在小鼠不同組織或器官之間的分布隨給藥時(shí)間的不同而存在較大差異，提示可能存在二次吸收再分布現(xiàn)象[14]，臨床用藥或動(dòng)物實(shí)驗(yàn)時(shí)應(yīng)考慮這一點(diǎn)。有學(xué)者指出，攝入較高劑量[15 mg/(kg·d)]的紫草素會(huì)對(duì)小鼠產(chǎn)生一定的毒性作用[15]。紫草素經(jīng)肝臟分解后主要隨膽汁進(jìn)入糞便排泄，以腎-尿液排泄為輔，僅有小部分以原形藥從尿液及糞便中排出[12-13]。

紫草素具有抗炎、鎮(zhèn)痛、抗腫瘤、抗病原微生物、免疫調(diào)節(jié)、保肝、止血、心血管保護(hù)等藥理作用，其抗癌作用的主要機(jī)制包括參與細(xì)胞凋亡、壞死、自噬相關(guān)的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)以及癌細(xì)胞的侵襲、轉(zhuǎn)移和抗腫瘤血管生成等[16]。目前認(rèn)為，紫草素的抗炎機(jī)制與白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-1β、IL-6、腫瘤壞死因子-α(tumor necrosis factor-α，TNF-α)、核因子κB、CC趨化因子及其受體、環(huán)加氧酶2等密切相關(guān)[5]。炎癥損傷是許多IRI疾病的重要病理機(jī)制之一，抑制過(guò)度炎癥是治療IRI的重要靶點(diǎn)[17]。紫草素在抗炎、免疫調(diào)節(jié)、血管保護(hù)等方面的優(yōu)勢(shì)作用可以為其預(yù)防或治療IRI提供參考。

2 IRI的發(fā)病機(jī)制

IRI是指組織器官在缺血后重新獲得血液供應(yīng)時(shí),組織或器官的功能未恢復(fù)，反而出現(xiàn)代謝功能障礙及結(jié)構(gòu)破壞加重，甚至發(fā)生不可逆性損傷的病理現(xiàn)象[4,18]。心、腦、腎或機(jī)體其他組織器官均可發(fā)生IRI，其主要的發(fā)病機(jī)制概括為以下幾點(diǎn)。

2.1自由基大量生成 再灌注為組織提供血液和氧氣的同時(shí)，還產(chǎn)生大量自由基。自由基指外層電子軌道上存在不配對(duì)的單個(gè)電子的原子或分子等物質(zhì)，其中由氧誘發(fā)的自由基稱(chēng)為氧自由基，包括超氧陰離子、羥自由基等，過(guò)氧化氫等活性氧類(lèi)雖不屬于自由基，但其在IRI中發(fā)揮重要作用，因此常一并討論[19]。由于活性氧類(lèi)和自由基具有不穩(wěn)定且活潑的化學(xué)性質(zhì)，因此具有較強(qiáng)的破壞DNA雙鏈結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)變性失活、脂質(zhì)過(guò)氧化等能力[20]。生物體內(nèi)有兩大抗氧化應(yīng)激防御系統(tǒng)，即酶性抗氧化劑和非酶性抗氧化劑。正常情況下，體內(nèi)活性氧類(lèi)等自由基水平與超氧化物歧化酶、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶、泛素、維生素A等自由基清除物質(zhì)水平處于動(dòng)態(tài)平衡[21]。當(dāng)缺血缺氧時(shí)，組織器官內(nèi)次黃嘌呤等物質(zhì)大量堆積，再灌注時(shí)瞬間涌入的過(guò)量氧氣分子提供的電子受體將次黃嘌呤經(jīng)黃嘌呤氧化酶轉(zhuǎn)化為尿酸[22]，在此反應(yīng)過(guò)程中，超氧陰離子、羥自由基、過(guò)氧化氫等氧化應(yīng)激產(chǎn)物大量產(chǎn)生。當(dāng)機(jī)體處于缺氧等應(yīng)激條件下時(shí)，體內(nèi)兒茶酚胺水平不斷升高，而兒茶酚胺可在單胺氧化酶的作用下，生成超氧陰離子，導(dǎo)致體內(nèi)自由基水平進(jìn)一步升高[23]。值得注意的是，在白細(xì)胞尤其是中性粒細(xì)胞聚集、招募和浸潤(rùn)過(guò)程中同樣伴隨氧自由基的大量生成[24]。此外，由于自由基破壞、鈣超載等因素對(duì)線粒體膜的影響，導(dǎo)致線粒體內(nèi)電子傳遞效能降低，正常的自由基清除系統(tǒng)無(wú)法及時(shí)有效發(fā)揮作用，同時(shí)線粒體內(nèi)的氧自由基大量堆積[25]，最終導(dǎo)致體內(nèi)抗氧化物質(zhì)消耗殆盡、自由基與清除系統(tǒng)的平衡被打破，造成組織損傷。

2.2細(xì)胞內(nèi)鈣超載 正常情況下，胞內(nèi)游離鈣離子(Ca2+)濃度僅約為胞外的1/10 000，其中作為第二信使的游離鈣僅占胞內(nèi)Ca2+的0.005%[26]。組織器官缺血缺氧導(dǎo)致機(jī)體代謝產(chǎn)物堆積、pH值升高、細(xì)胞內(nèi)酸中毒、離子交換異常，使Na+-Ca2+交換增加[27]。此外，胞內(nèi)鈣超載引起組織器官I(mǎi)RI的作用機(jī)制還包括：①氧自由基等對(duì)生物膜的破壞致使胞外Ca2+內(nèi)流增加[24]；②線粒體氧化磷酸化功能受到抑制，ATP依賴(lài)的離子泵功能障礙，導(dǎo)致胞內(nèi)多余的Ca2+無(wú)法及時(shí)轉(zhuǎn)運(yùn)出去，進(jìn)一步加重IRI對(duì)細(xì)胞的損害[28]。研究表明，細(xì)胞內(nèi)Ca2+積聚過(guò)多可通過(guò)各種途徑引起線粒體通透性轉(zhuǎn)運(yùn)孔道開(kāi)放，促進(jìn)凋亡相關(guān)基因激活，導(dǎo)致組織細(xì)胞死亡[29-30]。而且，缺氧等應(yīng)激可激活下丘腦-垂體-腎上腺皮質(zhì)軸，導(dǎo)致兒茶酚胺大量產(chǎn)生，通過(guò)α、β腎上腺素受體分別促進(jìn)細(xì)胞內(nèi)鈣庫(kù)釋放Ca2+和胞外Ca2+內(nèi)流，導(dǎo)致細(xì)胞產(chǎn)生不可逆性損傷[31]。

2.3白細(xì)胞聚集活化及炎癥反應(yīng)過(guò)度激活 動(dòng)物實(shí)驗(yàn)和臨床觀察均證明，白細(xì)胞尤其是中性粒細(xì)胞在IRI區(qū)域大量聚集，與白細(xì)胞呼吸暴發(fā)及炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)相互促進(jìn)、相互影響[6,32-33]，其具體機(jī)制目前尚未完全闡明，可能與中性粒細(xì)胞、內(nèi)皮細(xì)胞中的黏附分子、趨化因子表達(dá)增強(qiáng)有關(guān)[24,34]。中性粒細(xì)胞聚集、活化過(guò)程中伴隨著大量炎癥細(xì)胞因子釋放，如IL-1β、IL-6和TNF-α等[35]，而這些細(xì)胞因子會(huì)激活更多的炎癥效應(yīng)細(xì)胞，導(dǎo)致炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)，加重IRI[36]。

3 紫草素對(duì)IRI的保護(hù)作用

3.1減輕組織水腫、壞死 各種組織或器官缺血再灌注均可造成相應(yīng)細(xì)胞變性、壞死，破壞細(xì)胞膜屏障功能，造成細(xì)胞內(nèi)空泡形成、細(xì)胞間隙增寬、細(xì)胞崩解死亡，表現(xiàn)為組織水腫、壞死的廣泛形成，因此減輕上述病理?yè)p害被視為干預(yù)或治療IRI的有效依據(jù)[27]。在肝臟節(jié)段性IRI模型中，缺血再灌注組大鼠肝組織廣泛壞死、水腫，經(jīng)不同劑量紫草素預(yù)處理后，再灌注后3個(gè)時(shí)間觀察點(diǎn)的肝組織水腫均顯著改善，且壞死區(qū)域明顯減少，尤以再灌注后6 h的改善效果最為顯著，同時(shí)血清天冬氨酸轉(zhuǎn)氨酶和丙氨酸轉(zhuǎn)氨酶水平均顯著降低[6]。缺血性腦血管病給患者的生活和家庭造成了嚴(yán)重影響，早期干預(yù)可以減輕腦水腫，減小腦梗死面積。在一項(xiàng)針對(duì)小鼠腦IRI模型的研究中，再灌注導(dǎo)致神經(jīng)元細(xì)胞核萎縮、胞質(zhì)嗜酸粒細(xì)胞增多和細(xì)胞水腫等IRI特征性病理?yè)p害，而紫草素干預(yù)治療可減輕缺血再灌注導(dǎo)致的上述組織病理?yè)p害，同時(shí)可降低神經(jīng)元的萎縮程度和速度[37]，可能為缺血性腦血管病患者的治療提供幫助。另外，在心肌缺血再灌注中，經(jīng)紫草素預(yù)處理后，小鼠心肌梗死面積、血清心肌肌鈣蛋白Ⅰ、肌酸激酶同工酶MB等心肌損傷標(biāo)志物水平也均顯著改善，且這種作用呈劑量依賴(lài)性[8]。

3.2抑制炎癥細(xì)胞聚集和激活 再灌注后的炎癥瀑布反應(yīng)是導(dǎo)致IRI的病理基礎(chǔ)之一，而炎癥細(xì)胞的聚集和激活在其中起關(guān)鍵作用。研究表明，再灌注可激活TNF-α、IL-1β等炎癥細(xì)胞因子受體，而TNF-α、IL-1β等與對(duì)應(yīng)受體結(jié)合后可激活眾多炎癥相關(guān)細(xì)胞因子信號(hào)通路，進(jìn)而引發(fā)炎癥級(jí)聯(lián)反應(yīng)[38-39]。白細(xì)胞浸潤(rùn)，特別是中性粒細(xì)胞聚集是炎癥反應(yīng)的典型特征之一，而髓過(guò)氧化物酶的活性與中性粒細(xì)胞的浸潤(rùn)程度及數(shù)量呈正相關(guān)[40]。在急性肺損傷[41-42]、急性肝損傷[43]等所致的組織炎癥反應(yīng)中均可觀察到大量中性粒細(xì)胞聚集以及TNF-α、IL-1β、髓過(guò)氧化物酶水平升高。以上實(shí)驗(yàn)表明，紫草素提前干預(yù)或再灌注后及時(shí)治療均可抑制髓過(guò)氧化物酶活性，減少中性粒細(xì)胞聚集和炎癥細(xì)胞因子激活。

3.3減少炎癥細(xì)胞因子釋放和氧化應(yīng)激水平 再灌注可造成炎癥因子相關(guān)基因和信號(hào)通路激活，刺激炎癥細(xì)胞聚集和激活，引發(fā)炎癥反應(yīng)，反映在分子水平上就是氧化應(yīng)激產(chǎn)物或炎癥細(xì)胞因子的大量釋放。相關(guān)研究表明，在肝臟缺血再灌注后6 h，IL-1β、IL-6和TNF-α等炎癥細(xì)胞因子水平達(dá)峰值，而紫草素預(yù)處理可顯著降低炎癥細(xì)胞因子水平，且降低程度隨紫草素劑量增加而增大[6]。

氧化代謝對(duì)組織細(xì)胞的生存至關(guān)重要，這與活性氧的產(chǎn)生密切相關(guān)[37]，活性氧類(lèi)等自由基清除不利可進(jìn)一步造成脂質(zhì)過(guò)氧化、蛋白質(zhì)變性失活等損害，加重IRI。在急性肝損傷模型中，對(duì)乙酰氨基酚實(shí)驗(yàn)組小鼠體內(nèi)谷胱甘肽被大量消耗、超氧化物歧化酶活性降低，同時(shí)脂質(zhì)過(guò)氧化產(chǎn)物丙二醛大量產(chǎn)生，而紫草素干預(yù)組小鼠體內(nèi)的谷胱甘肽和超氧化物歧化酶水平降低則并不顯著，丙二醛的產(chǎn)生量也較少，肝組織出血、細(xì)胞變性壞死等均顯著改善[43-44]，表明紫草素在改善對(duì)乙酰氨基酚所致肝臟氧化應(yīng)激損傷方面具有強(qiáng)大作用。

紫草素改善氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)主要涉及的信號(hào)通路包括磷脂酰肌醇-3-激酶/蛋白激酶B信號(hào)通路[6,8,43,45]、核因子κB信號(hào)通路[42,45]、促分裂原活化的蛋白激酶信號(hào)通路[42]以及IL-1β/c-Jun氨基端激酶/磷酸化c-Jun氨基端激酶信號(hào)通路[39]等，但目前哪條信號(hào)通路在其中占主導(dǎo)地位尚不明確，這些通路相互交叉、相互影響，共同決定體內(nèi)炎癥反應(yīng)的發(fā)展方向。上述研究為紫草素作為治療IRI的新型藥物提供了參考，也為探究紫草素在改善和保護(hù)器官I(mǎi)RI方面的機(jī)制研究提供了新的思路和方向。

3.4減少細(xì)胞凋亡和自噬 過(guò)強(qiáng)的氧化應(yīng)激或炎癥反應(yīng)最終導(dǎo)致組織或器官的不可逆性損傷，造成細(xì)胞凋亡或死亡，引起器官功能障礙。細(xì)胞死亡與器官I(mǎi)RI密切相關(guān)，凋亡作為一種程序性細(xì)胞死亡方式，在缺血再灌注中尤其常見(jiàn)，主要受B細(xì)胞淋巴瘤-2、胱天蛋白酶等基因家族調(diào)控；自噬的主要特點(diǎn)是形成自噬小體或自溶酶體，目前認(rèn)為自噬主要受Beclin-1、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3和p62等基因調(diào)控，通過(guò)透射電子顯微鏡可以觀察到特征性的自噬小體[6,39]。在肝IRI動(dòng)物模型中，與缺血再灌注組相比，紫草素治療組中的抗凋亡蛋白B細(xì)胞淋巴瘤-2水平在各指定檢測(cè)點(diǎn)均上調(diào)，而促凋亡蛋白B細(xì)胞淋巴瘤-2相關(guān)X蛋白、胱天蛋白酶9和胱天蛋白酶3水平均下調(diào)；經(jīng)紫草素預(yù)處理后，Beclin-1、微管相關(guān)蛋白1輕鏈3和p62蛋白的表達(dá)均受到抑制，通過(guò)透射電子顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，紫草素預(yù)處理組的溶酶體和自噬小體數(shù)量均顯著減少；另外，肝組織免疫化學(xué)染色與聚合酶鏈反應(yīng)及蛋白質(zhì)印跡的結(jié)果一致，為上述結(jié)果提供了更進(jìn)一步的有力證據(jù)支持[6]。黃澤林[46]研究表明，紫草素預(yù)處理可抑制大鼠肢體IRI中的細(xì)胞凋亡，上調(diào)B細(xì)胞淋巴瘤-2水平，下調(diào)B細(xì)胞淋巴瘤-2相關(guān)X蛋白水平。紫草素拮抗促凋亡蛋白表達(dá)、促進(jìn)抗凋亡蛋白表達(dá)的作用在低氧-復(fù)氧誘導(dǎo)的心肌細(xì)胞損傷模型[47]以及心肌IRI動(dòng)物模型[8]中均得到了證實(shí)。

4 小 結(jié)

近年預(yù)防或治療IRI已成為研究熱點(diǎn)。紫草素作為一種天然的脂溶性萘醌類(lèi)藥物，在腫瘤的抗炎和免疫調(diào)節(jié)等方面顯示出巨大作用，甚至可能作為一種新型的免疫抑制劑用于臨床移植[48]。IRI主要由自由基生成增多、細(xì)胞內(nèi)鈣超載和炎癥反應(yīng)過(guò)度激活引起。了解紫草素在急性組織損傷、缺血性疾病以及心、腦和肝IRI等方面的研究現(xiàn)狀，探究紫草素減輕IRI、保護(hù)組織器官功能的作用機(jī)制，可為進(jìn)一步深入研究紫草素在器官I(mǎi)RI方面的詳細(xì)作用機(jī)制提供幫助，也為其作為IRI的潛在預(yù)防和治療藥物提供新思路，未來(lái)紫草素可能用于減輕器官移植圍手術(shù)期缺血再灌注造成的臟器損害，但具體方案有待進(jìn)一步深入研究。