朱淑斌，倪黎綱，陳章言，張君勝，周春寶，趙秀玲

（1. 江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院，江蘇泰州 225300；2. 姜曲海豬保種場，江蘇泰州 225300）

叉頭框（Forkhead box，F(xiàn)ox）蛋白家族有19 個亞族，F(xiàn)oxOs 是Fox 家族的重要成員，在哺乳動物中主要有FoxO1、FoxO3、FoxO4 和FoxO6 四種轉錄因子，均高度保守，分別表達于不同的組織器官[1]。FoxO轉錄因子作用復雜多樣，包括氧化應激、細胞代謝、DNA 修復、細胞周期阻滯、參與細胞凋亡和自噬等，與動物機體的很多組織細胞發(fā)育及代謝密切相關，如對肌肉組織、脂肪組織和肝臟等都有非常重要調(diào)控機能[2?3]。前人研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxO1和FoxO3都是維持肌肉能量穩(wěn)態(tài)的重要因素[4]。目前，對FoxO3基因研究多集中在人和小鼠方面，檢測到韓國人FoxO3基因存在7 個多態(tài)位點[5]。WANG 等[6]和COSKUN 等[7]報道了FoxO3基因多態(tài)性與長壽相關，且與性別有一定的相關性。劉源等[8]報道了小鼠FoxO3基因對骨形態(tài)發(fā)生蛋白15 啟動子區(qū)的轉錄活性有影響。在哺乳動物卵巢中，F(xiàn)oxO3基因可以通過促進卵巢顆粒細胞凋亡來調(diào)節(jié)卵泡的閉鎖有關[9]。有關FoxO3基因在家畜方面的研究很少。豬的FoxO3基因定位于1 號染色體，含有2 個外顯子和1個內(nèi)含子。于晶[10]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxO3基因在第2 個外顯子存在遺傳多態(tài)性，并與胴體性狀指標中的胴體體斜長、6～7 肋間背膘厚和大理石紋進行相關分析，結果顯示，該位點的多態(tài)性與這幾個胴體性狀間均存在顯著相關關系。王玲[11]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxO3基因在肉牛群體中分別存在8 個多態(tài)性位點，F(xiàn)oxO3基因單倍型組合與肌內(nèi)脂肪（Intramuscular fat，IMF）含量、肌肉嫩度、肌纖維直徑和肌纖維密度性狀之間存在不同程度的相關性。陳亞楠[12]對FoxO3基因進行克隆及序列比對，共檢測到3個多態(tài)位點與豬生長性狀有關聯(lián)。

姜曲海豬是江蘇省的一個歷史悠久的優(yōu)良地方豬種，具有產(chǎn)仔較多、性溫馴、早熟易肥、脂肪沉積能力強、肉質(zhì)鮮美等特點，是“北腿”（如皋火腿）的主要原料豬之一，是我國地方豬種的寶貴資源。但目前對姜曲海豬肉質(zhì)特性及其相關分子遺傳基礎了解甚少，不利于該珍貴遺傳資源的保護和開發(fā)利用。為此，利用序列特異引物引導的聚合酶鏈式反應（Polymerase chain reaction?sequence specific primer，PCR-SSP）方法檢測地方豬種姜曲海豬的FoxO3基因多態(tài)性，分析其對豬肉質(zhì)性狀的遺傳效應，并探索該基因的表達規(guī)律，旨在尋找與姜曲海豬肉質(zhì)性狀相關的遺傳標記，為提高肉質(zhì)的研究奠定基礎，并為姜曲海豬種質(zhì)資源特性及標記輔助選擇（Marker assisted selection，MAS）的研究提供參考。

1 材料和方法

1.1 試驗材料

112 頭姜曲海豬、40 頭蘇姜豬和30 頭杜長大豬由姜曲海種豬場提供，分別取約0.5 g 耳組織，于-20 ℃保存。試驗豬群飼養(yǎng)至8 月齡，選擇含有不同基因型的試驗豬屠宰，取左側胴體最后肋與第一、二腰椎間中心部位，帶回江蘇農(nóng)牧科技職業(yè)學院動物科技學院豬肉質(zhì)檢測實驗室進行肉質(zhì)性狀測定和肌肉組織學特性測定；選擇姜曲海豬30 只，其中0（初生）、1、2、4、6、8 月齡各5 只，屠宰后取心臟、肝臟、脾臟、腎臟、腹脂、皮下脂肪、背最長肌、比目魚肌、腓腸肌和半腱肌樣品，放入1.5 mL 離心管中，迅速置于液氮中，帶回實驗室后，置于-70 ℃冰箱中保存，以備總RNA的提取。

1.2 主要試劑

Trizol 為美國Invitrogen 公司產(chǎn)品；DEPC 處理水、瓊脂糖為大連寶生物技術有限公司產(chǎn)品；Tris堿、EDTA 為美國Sigma 公司產(chǎn)品；HiFi-MMLV cDNA 第一鏈合成試劑盒、SYBR PrimeScriptTMRTPCR Kit 和5×GoldstarTaqPCR Buffer 均為北京康為生物有限公司產(chǎn)品；氯仿、異丙醇和無水乙醇等分析純均為國藥集團化學試劑公司產(chǎn)品。

1.3 試驗方法

1.3.1 DNA、RNA 的提取和檢測 采用苯酚－氯仿法[10]提取豬耳組織基因組DNA，將其溶解在RNasefree ddH2O 中，-20 ℃保存?zhèn)溆谩２捎肦NA 提取試劑盒對心臟、肝臟、脾臟、腎臟、腹脂、皮下脂肪、背最長肌、比目魚肌、腓腸肌和半腱肌進行總RNA 提取。檢測樣本濃度和OD 值后，用1.5%的瓊脂糖凝膠電泳對DNA、RNA質(zhì)量進行檢測。

1.3.2 PCR 擴增及其產(chǎn)物分析 參照GenBank 中FoxO3基因第二外顯子序列，利用Primer Premier 5.0軟件設計引物（FC：5′-GTCATTGAGATTCATGG?TCC-3′；FT：5′-GTCATTGAGATTCATGGTCT-3′；R：5′-CGCCTGTCCCCCATCCTG-3′），引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR-SSP 擴增體系（20 μL）：5×GoldstarTaqPCR Buffer 4 μL，GoldstarTaqPCR Polymerase 1 μL，dNTPs 2 μL，H2O 9 μL，上下游引物各1 μL，模板DNA 2 μL；PCR擴增程序：95 ℃預變性10 min；95 ℃變性30 s，59 ℃退火30 s，72 ℃延伸1 min，35 個循環(huán)；72 ℃延伸7 min，冷卻至4 ℃。制備2%瓊脂糖凝膠（加入溴化乙錠至終質(zhì)量濃度0.5 mg/L），上樣量5 μL，以TAE為電泳緩沖液，100 V 電泳10 min，于紫外燈下觀察。

1.3.3 實時熒光定量PCR 根據(jù)NCBI 公布的豬FoxO3基因的cDNA 序列（NM_001135959.1），利用Primer Premier 5.0 軟件設計目的基因引物（上游引物：5′-CGCACTACGGCAACCAGACA-3′；下游引物：5′-TAGGCTGGGCGGCAAAGGAC-3′），β-actin基因（上游引物：5′-ACACGGTGCCCATCTACGAG-3′；下游引物：5′-GCTTCTCCTTGATGTCCCGC-3′）作為內(nèi)參，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。熒光定量PCR 反應體系20 μL：模板cDNA 2 μL，上下游引物各0.4 μL，UltraSYBR Mixture（2×）10 μL，ddH2O 7.2 μL。熒光定量PCR的反應條件：94 ℃預變性10 s；94 ℃15 s，60 ℃60 s，40個循環(huán)。

1.4 遺傳多態(tài)性分析

運用SHEsis 在線軟件（http://analysis.bio?x.cn/myAnalysis.php）計算基因型頻率、等位基因頻率、遺傳雜合度（He）、有效等位基因數(shù)（Ne）、多態(tài)信息含量（PIC）以及哈迪-溫伯格平衡（χ2）等。

1.5 肉質(zhì)性狀及肌肉組織特性測定

肉色、大理石紋、pH 值、失水率、肌內(nèi)脂肪含量和剪切力測定參考文獻[13]中的方法進行。將各肌肉組織樣品修成1 mm3大小，置于2.5%戊二醛溶液中固定，經(jīng)PBS 沖洗后，用鋨酸固定，梯度乙醇脫水，包埋聚合后進行超薄切片，醋酸鈾和檸檬酸鉛雙染色，進行透射電鏡觀察，測定肌原纖維直徑、肌節(jié)長度和肌纖維密度。

1.6 數(shù)據(jù)處理

實時熒光定量PCR 中，采用2-△△Ct方法計算FoxO3基因的相對表達水平中，采用SPSS 22.0 軟件分析FoxO3基因不同基因型對肉質(zhì)性狀的影響。

2 結果與分析

2.1 FoxO3 基因PCR擴增結果

每個樣品分別加入FC+R、FT+R 混合物進行PCR 擴增，通過電泳圖譜觀察基因分型結果，F(xiàn)oxO3基因型為TT、CC和TC（圖1）。

圖1 FoxO3基因PCR擴增結果Fig.1 PCR amplification results of FoxO3 gene

2.2 FoxO3 基因PCR-SSP遺傳多態(tài)性分析

利用PCR-SSP 方法檢測發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxO3基因在姜曲海豬、蘇姜豬和杜長大豬中均出現(xiàn)多態(tài)性（表1）。經(jīng)χ2適合性檢驗，姜曲海豬和杜長大豬群χ2均小于5.99，表明群體基因頻率和基因型頻率均處于哈迪-溫伯格平衡狀態(tài)（P>0.05），蘇姜豬未達到哈迪-溫伯格平衡狀態(tài)（P<0.05）。姜曲海豬、蘇姜豬和杜長大豬群中T 基因的頻率分別為0.424、0.538 和0.567，多態(tài)信息含量分別為0.369、0.374 和0.371，均屬中度多態(tài)（0.25

表1 FoxO3基因的PCR-SSP多態(tài)性分析Tab.1 Polymorphism of FoxO3 gene by PCR-SSP

2.3 FoxO3 基因的遺傳變異對肉質(zhì)的影響

從表2 可以看出，F(xiàn)oxO3基因500 bp 位點多態(tài)性與姜曲海豬、蘇姜豬和杜長大豬的大理石紋剪切力和肌內(nèi)脂肪含量均有關聯(lián)。姜曲海豬TC 基因型肌內(nèi)脂肪含量顯著高于CC 基因型，與TT 基因型差異不顯著；TC基因型剪切力顯著低于TT基因型，TT基因型與CC 基因型差異不顯著。蘇姜豬TC 基因型大理石紋得分和肌內(nèi)脂肪含量均顯著高于CC 基因型，TC 基因型與TT 基因型差異不顯著；杜長大豬TC 基因型大理石紋得分顯著高于CC 基因型，CC 基因型顯著高于TT 基因型；TC 基因型肌內(nèi)脂肪含量顯著高于TT 基因型，TT 基因型與CC 基因型差異不顯著。

表2 FoxO3 PCR-SSP基因型與肉質(zhì)性狀的關聯(lián)性分析Tab.2 Association of FoxO3 genetypes by PCR-SSP in with meat quality

2.4 FoxO3基因在內(nèi)臟和脂肪組織的表達差異分析

FoxO3基因在姜曲海豬內(nèi)臟和脂肪組織的差異表達見圖2。初生時，F(xiàn)oxO3基因在腹脂的表達量最高，其次是肝臟，在腎臟的表達量最低；1月齡時，F(xiàn)oxO3基因仍是在腹脂的表達量最高，顯著高于其他組織；2 月齡時，F(xiàn)oxO3基因在心臟的表達量最高，其次是腹脂和肝臟；4 月齡時，F(xiàn)oxO3基因在腹脂的表達量最高，其次是肝臟，在脾臟的表達量最低；6 月齡時，F(xiàn)oxO3基因在肝臟的表達量最高，其次是心臟，在脾臟的表達量最低；8 月齡時，F(xiàn)oxO3基因在肝臟的表達量最高，與在心臟和腹脂的表達量差異不顯著，與在腎臟、脾臟和皮脂中的表達量差異顯著。

圖2 姜曲海豬FoxO3基因在內(nèi)臟和脂肪中的表達差異Fig.2 Expression difference of FoxO3 gene in viscera and fat of Jiangquhai pig

姜曲海豬內(nèi)臟和脂肪組織中FoxO3基因在不同發(fā)育時期表達差異見圖3。在心臟中，F(xiàn)oxO3基因表達量在1 月齡時最低，6 月齡時達到最高；在肝臟中，F(xiàn)oxO3基因表達量1月齡時最低，除4月齡外，與其他各月齡均差異顯著，6月齡時表達量達到最高值；在脾臟中，F(xiàn)oxO3基因1 月齡時表達量最高，與初生和2 月齡時表達量差異顯著，6 月齡后表達量下降；在腎臟中，F(xiàn)oxO3基因1 月齡時表達量最高，與其他各月齡均差異顯著。在皮脂中，F(xiàn)oxO3基因表達量在初生時最高，8 月齡時最低；在腹脂中，F(xiàn)oxO3基因表達量在初生時最高，8月齡最低。

圖3 姜曲海豬內(nèi)臟和脂肪組織中FoxO3基因在不同發(fā)育時期的表達差異Fig.3 FoxO3 gene expression difference in viscera and adipose tissue of Jiangquhai pig at different developmental stages

2.5 FoxO3基因在骨骼肌中的表達差異分析

FoxO3基因在不同骨骼肌中的表達差異見圖4。初生時，F(xiàn)oxO3基因在腓腸肌中的表達量最高，其次是比目魚肌，在半腱肌中的表達量最低；1 月齡時，F(xiàn)oxO3基因在比目魚肌中的表達量最高，其次是腓腸??；2 月齡時，F(xiàn)oxO3基因在腓腸肌的表達量最高，其次是比目魚肌，在半腱肌中的表達量最低；4月齡時，F(xiàn)oxO3基因在腓腸肌中的表達量最高，其次是半腱肌，在比目魚肌中的表達量最低；6 月齡時，F(xiàn)oxO3基因在背最長肌中的表達量最高，其次是腓腸肌，在比目魚肌中的表達量最低；8 月齡時，在腓腸肌中的表達量最高，與背最長肌、半腱肌差異顯著，與比目魚肌差異不顯著。

圖4 姜曲海豬FoxO3基因在肌肉中的表達差異Fig.4 Expression difference of FoxO3 gene in muscles of Jiangquhai pig

姜曲海豬肌肉組織中FoxO3基因在不同發(fā)育時期表達差異見圖5。背最長肌中，F(xiàn)oxO3基因表達量在6 月齡時最高，4 月齡時最低；半腱肌中，F(xiàn)oxO3基因表達量在1 月齡時達到最高值，與其他各月齡相比均差異顯著，然后開始下降，4月齡時表達量達到最低值；比目魚肌中，F(xiàn)oxO3基因表達量在2月齡時最低，與其他各月齡相比均差異顯著；腓腸肌中，F(xiàn)oxO3基因表達量初生時最高，與其他各月齡均差異顯著，隨著月齡增加，表達量持續(xù)下降，4 月齡時表達量最低。

圖5 姜曲海豬肌肉組織中FoxO3基因在不同發(fā)育時期的表達差異Fig.5 FoxO3 gene expression difference in muscle tissue of Jiangquhai pig at different developmental stages

2.6 FoxO3基因表達量與肉質(zhì)性狀相關性分析

8 月齡時，姜曲海豬背最長肌中FoxO3基因表達量與肌纖維直徑、肌纖維密度、肌內(nèi)脂肪含量和剪切力的相關系數(shù)分別是-0.518、0.525、-0.148 和0.084，F(xiàn)oxO3基因表達量與肌纖維直徑和肌內(nèi)脂肪含量呈負相關，與肌纖維密度和剪切力呈正相關，但相關性均不顯著（P>0.05）。

2.7 FoxO3基因表達量與肌肉超微結構相關性分析

8 月齡時，姜曲海豬FoxO3基因表達量與背最長肌、比目魚肌、半腱肌和腓腸肌的肌原纖維直徑呈負相關，相關系數(shù)分別是-0.574、-0.408、-0.406和-0.937，其中與腓腸肌肌原纖維直徑呈顯著負相關（P<0.05）；FoxO3基因與背最長肌、比目魚肌、半腱肌和腓腸肌肌節(jié)長度呈負相關，相關系數(shù)分別是-0.874、-0.445、-0.386和-0.628，其中與背最長肌肌節(jié)長度呈顯著負相關（P<0.05）。

3 結論與討論

本研究首次利用PCR-SSP 檢測了姜曲海豬、蘇姜豬和杜長大豬FoxO3基因多態(tài)性，先將肉質(zhì)差異較大的樣品進行基因克隆測序，初步篩選SNP 位點，根據(jù)位點的實際情況，再選用適宜方法檢測單核苷酸多態(tài)性，姜曲海豬、蘇姜豬和杜長大豬中FoxO3基因均出現(xiàn)多態(tài)性，除了蘇姜豬的FoxO3基因的各種基因型頻率和基因頻率經(jīng)χ2檢驗未達到哈迪-溫伯格平衡狀態(tài)，其他各豬群的FoxO3基因的χ2均小于5.99，表明該群體基因頻率和基因型頻率都處于哈迪-溫伯格平衡狀態(tài)（P>0.05）。姜曲海豬FoxO3基因多態(tài)信息含量在0.25～0.50，屬中度多態(tài)。一般認為，多態(tài)性越高的群體，其遺傳多樣性越豐富。由此可知，姜曲海豬的遺傳多樣性不及蘇姜豬豐富，這可能與群體本身的遺傳結構和近年保種有關。群體的遺傳結構受群體大小、交配系統(tǒng)、祖先群體的多態(tài)性以及遷移、突變和選擇等許多因素的影響。

FoxO 轉錄因子功能極其廣泛，主要是由于FoxO 轉錄因子能夠調(diào)節(jié)PI3K/AKT或PI3K/PKB信號通路中的下游基因，而這些基因與細胞生理過程，如細胞凋亡、DNA 損傷/修復、應激等有關。此外，F(xiàn)oxO 轉錄因子對脂肪分化、肌肉生成等過程中也發(fā)揮著關鍵性的作用[14?15]。 NAKAO[16]和RATHBONE[17]報道了FoxO3基因通過上調(diào)p27基因抑制細胞的增殖，對巨核細胞與骨骼肌細胞的再生起負調(diào)節(jié)作用。本研究結果顯示，F(xiàn)oxO3基因500 bp 位點多態(tài)性對姜曲海豬、蘇姜豬和杜長大豬的大理石紋等分、剪切力和肌內(nèi)脂肪含量均有影響，且FoxO3基因不同基因型間肉質(zhì)性狀存在較大差異。于晶[10]利用PCR-RFLP 檢測了4 個地方豬種FoxO3基因第二外顯子77 bp位點的多態(tài)性，結果表明，第二外顯子77 bp 位點與胴體體斜長、6～7 肋間背膘厚、大理石紋存在顯著關聯(lián)，與失水率存在極顯著相關。由此可見，F(xiàn)oxO3基因多態(tài)性與豬肉質(zhì)有一定關聯(lián)。

本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxO3基因在姜曲海豬初生、1 月齡、2月齡、4月齡、6月齡和8月齡時的皮下脂肪、腹脂、心臟、肝臟、脾臟、腎臟、背最長肌、比目魚肌、半鍵肌和腓腸肌10 種組織中均有表達。姜曲海豬FoxO3基因在同一組織不同發(fā)育階段的差異表達，可能與FoxO3基因在不同組織不同發(fā)育階段的調(diào)控作用密切相關。MAMMUCARI 等[18]研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxO3基因調(diào)控骨骼肌的蛋白質(zhì)分解主要通過2 個途徑，即泛素-蛋白酶體和自噬/溶酶體途徑。綜上，F(xiàn)oxO3基因表達對動物體骨骼肌的發(fā)育有著重要的調(diào)控作用。

本研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)oxO3基因與肌纖維直徑和肌內(nèi)脂肪呈負相關，與肌纖維密度和剪切力呈正相關，但相關系數(shù)未達到顯著水平；FoxO3基因與4 個部位肌肉肌原纖維直徑和肌節(jié)長度均呈負相關，與腓腸肌肌原纖維直徑、背最長肌肌節(jié)長度均呈顯著負相關。王玲[11]研究發(fā)現(xiàn)，牛FoxO3基因表達量與肌纖維密度、面積、直徑顯著相關，其研究結果與本研究結果不完全一致，原因可能與畜種及月齡有關。

鑒于豬FoxO3基因表達、遺傳多態(tài)性與肉質(zhì)性狀存在相關性，進而推斷，在骨骼肌生長發(fā)育中，F(xiàn)oxO扮演了重要的角色。其主要原因是由于FoxO轉錄因子廣泛參與生理代謝[19]。EELEN 等[20]的研究結果顯示，F(xiàn)oxO3基因主要表達于骨骼肌中。祁樣正[21]報道了在肌肉分化過程中，F(xiàn)oxO3基因表達量一直保持較高水平，表達量變化不明顯，這可能與FoxO3基因對骨骼肌細胞的再生起負性調(diào)節(jié)作用有關。

受豬群規(guī)模限制，本研究的樣本數(shù)目有限，使得遺傳效應分析效果受到影響。后續(xù)研究中應繼續(xù)擴大樣本量，并在更多的豬群中開展深入分析研究，進一步探索FoxO家族基因對肌肉和脂肪性狀所起的作用，尋找有效的分子遺傳標記，加快優(yōu)良豬種的培育。