周小倩，井剛，王睿怡，張文遠，王文靜，唐小牛，孫恩濤

1．皖南醫(yī)學院衛(wèi)生檢驗與檢疫學教研室，安徽 蕪湖 241002； 2．皖南醫(yī)學院醫(yī)學寄生蟲學教研室

變應(yīng)原是指能夠誘導機體產(chǎn)生特異性IgE(specific IgE,sIgE)抗體進而引起過敏反應(yīng)的抗原性物質(zhì)[1]。變應(yīng)原引起的過敏性疾病是目前全球公認的健康問題，近年來，過敏性疾病的發(fā)病率呈上升趨勢[2]。過敏性疾病廣泛影響人們的生活，嚴重時可危及生命[3]。根據(jù)變應(yīng)原引起機體發(fā)生變態(tài)反應(yīng)的途徑不同，可以分為食入性變應(yīng)原和吸入性變應(yīng)原等[4-6]。因此，明確變應(yīng)原對于過敏性疾病的預防和診療具有重要意義。由于變應(yīng)原體內(nèi)檢測存在安全風險等問題，變應(yīng)原的體外檢測逐漸成為近年來的研究熱點。本文主要對變應(yīng)原的體外檢測技術(shù)進行了綜述。

1 血清sIgE檢測

目前，血清sIgE的檢測已經(jīng)被認為是最有效的體外變應(yīng)原檢測方法[7]。該檢測方法能夠避免體內(nèi)試驗可能出現(xiàn)的嚴重過敏反應(yīng)，對患者絕對安全。檢測方法主要包括放射變應(yīng)原吸附試驗、酶聯(lián)免疫吸附試驗、熒光酶免疫分析、納米磁微?；瘜W發(fā)光法、免疫印跡法、液相芯片法等。

1．1放射變應(yīng)原吸附試驗(radioallergosorbent test，RAST) 1967年Wide等[8]首次建立了RAST，用于檢測血清中sIgE。RAST基本原理是血清中sIgE抗體可以與固相載體上包被的變應(yīng)原發(fā)生特異性結(jié)合，sIgE與放射性核素標記的抗IgE抗體反應(yīng)，sIgE的含量與放射強度成正比關(guān)系，根據(jù)放射強度，在標準曲線上計算出sIgE抗體含量。該檢測方法具有較高的靈敏度與特異度[9]，但由于核素具有放射性，容易造成環(huán)境污染，且檢測成本高、周期長，同時還不適用于藥物、細菌、真菌等變應(yīng)原的檢測，因此，相比于其他的體外檢測方法，該方法的使用逐漸減少。

1．2酶聯(lián)免疫吸附試驗(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA) 自從Engvall和Perlman在20世紀70年代首次報道建立酶聯(lián)免疫吸附試驗以來，由于ELISA具有快速、敏感、簡便、易于標準化等優(yōu)勢而被廣泛應(yīng)用，并且隨著方法的不斷改進、材料的不斷更新，尤其是基因工程技術(shù)、計算機技術(shù)的推動，使得制備包被抗原，針對某一抗原表位的單克隆抗體進行阻斷等過程的特異性都大大提高。使用間接ELISA法檢測血清sIgE[10]，其原理是將變應(yīng)原包被在固相載體上，血清中的sIgE抗體可與相應(yīng)的變應(yīng)原發(fā)生特異性結(jié)合，sIgE再與酶標記的抗IgE抗體反應(yīng)，最后加入酶的顯色底物就可使反應(yīng)體系顯色，而顏色的深淺與sIgE的含量成正比，依據(jù)反應(yīng)體系吸光度的變化，根據(jù)標準曲線計算出相應(yīng)sIgE的含量。與RAST相比，ELISA對環(huán)境無污染，在一定的條件下，酶的活性較穩(wěn)定，價格更便宜，結(jié)果重復性高[11]，具有較高的靈敏度[12]，檢測范圍廣[13]。但是，完成一種變應(yīng)原sIgE的檢測需要50 μL血清[14]，因血清用量大，嬰幼兒患者不太適用。

1．3熒光酶免疫分析(fluoro enzyme immunoassay，F(xiàn)EIA) 基于FEIA建立的檢測系統(tǒng)以UniCAP為代表。UniCAP檢測系統(tǒng)將變應(yīng)原包被在一種與變應(yīng)原有著較強結(jié)合能力的新型固相載體纖維素衍生物ImmunoCAP上。變應(yīng)原捕獲樣本中的sIgE，再用β-半乳糖苷酶的多克隆和單克隆抗IgE抗體與sIgE結(jié)合，最后直接檢測熒光，熒光強度與sIgE的含量成正相關(guān)。Angelo[15]使用該方法對韓國首爾中重度變應(yīng)性鼻炎患者進行檢測，結(jié)果顯示該方法對中重度變應(yīng)性鼻炎患者sIgE的檢測水平最低為0．53 kU/L，而且檢測過程主要由UniCAP100全自動檢測儀完成。該儀器可檢測500多種變應(yīng)原，檢測時間短，能夠避免人為的操作誤差，對技術(shù)人員的操作水平要求較低。該方法也是目前公認的檢測sIgE的“金標準”[16]，對不同年齡段患者均適用，但儀器試劑昂貴，且每次試驗只能檢測一種變應(yīng)原，檢測成本高，不易在臨床廣泛開展。

1．4納米磁微粒化學發(fā)光法(magnetic nanoparticle chemiluminescence immunoassay，NM-CLIA) 化學發(fā)光免疫分析(chemiluminescence immunoassay，CLIA)興起于20世紀70年代中期，發(fā)展至今已經(jīng)成為一種成熟先進的超微量活性物質(zhì)檢測技術(shù)，NM-CLIA是將納米磁微粒技術(shù)與化學發(fā)光檢測技術(shù)相結(jié)合建立起來的一種新型的檢測血清sIgE的方法。該方法的基本原理是借助生物素-鏈霉親和素生物放大系統(tǒng)，將變應(yīng)原包被在徑粒直徑為100 nm的磁微粒上，用以捕獲血清中sIgE，而sIgE會與辣根過氧化物酶標記(HRP)的鼠抗人IgE抗體結(jié)合，最后HRP催化發(fā)光底物魯米諾和過氧化氫脲，光信號的強度可被檢測系統(tǒng)捕捉，進而計算出sIgE的含量。王瓊等[17]用該方法檢測腐食酪螨sIgE抗體，顯示靈敏度達80．95%，特異度為100%。該方法最低檢測限達pg級，還具有檢測范圍廣、檢測時間短、操作簡單等優(yōu)點。此外，該方法使用中國的變應(yīng)原原料，檢測成本低[18]，對不同的過敏性疾病人群均適用。

1．5免疫印跡法(immunoblotting test，IBT) 免疫印跡法是20世紀70年代末80年代初發(fā)展起來的蛋白質(zhì)測定技術(shù)，其發(fā)明者為美國斯坦福大學的喬治·斯塔克[19]。該方法是將抗原抗體的反應(yīng)固定在固相膜載體上，通過酶催化底物反應(yīng)，使得固相膜上發(fā)生顏色的變化，進而對血清sIgE進行定量。基于該方法建立的檢測系統(tǒng)以Mediwiss敏篩定量檢測系統(tǒng)為代表。該系統(tǒng)使用了生物素親和素放大技術(shù)，檢測靈敏度較高，只需250 μL血清即可檢測20多種變應(yīng)原sIgE[20]。并且，Mediwiss敏篩檢測系統(tǒng)與UniCAP檢測系統(tǒng)均有很好的一致性[21]。此外，Mediwiss敏篩檢測系統(tǒng)在過敏性疾病的變應(yīng)原初篩、小兒食入性與吸入性過敏原sIgE檢測方面有著廣泛應(yīng)用[22-23]，為小兒變應(yīng)原初篩提供了新選擇。

1．6液相芯片法(liquid phase chip method) 液相芯片技術(shù)是美國Luminex公司開發(fā)的一種多重多功能檢測平臺，液相芯片法將液相芯片技術(shù)與博敏達液相芯片反應(yīng)動力學專利結(jié)合，利用這個系統(tǒng)可以對一個樣品中的多種不同分子同時進行檢測。這種檢測技術(shù)是1997年被開發(fā)出來的[24-25]，其基本原理是將不同的變應(yīng)原偶聯(lián)在熒光物質(zhì)編碼的聚苯乙烯微球上，從而捕獲血清中sIgE，生物素標記的抗IgE抗體可與sIgE結(jié)合，最后加入鏈霉親和素標記的藻紅蛋白。使用兩種不同波長的激光照射經(jīng)過檢測儀通道的反應(yīng)終產(chǎn)物，當微球和藻紅蛋白都能檢測到熒光信號才視為有效，分別測得各自的熒光值，根據(jù)熒光值可對sIgE進行定量檢測[26]。液相芯片法只需50 μL血清即可檢測常見的60多種變應(yīng)原，靈敏度較高，最低檢測限達3 pg/mL[27]，檢測時間短，且對各年齡段患者均適用。

2 變應(yīng)原直接檢測的生物共振法

根據(jù)物質(zhì)波理論，任何物質(zhì)都伴隨著波而存在[28]。生物共振技術(shù)的治療基石是法國科學家德布羅意提出的量子物質(zhì)波理論，該理論于1929年獲諾貝爾獎[29]。該理論認為組成人體的各個器官也具有本身特有的物質(zhì)波，如腦電[30]、心電[31]。在過敏性疾病發(fā)生時，不同變應(yīng)原會引起不同波信號的改變，運用BICOM2000生物共振檢測儀能夠檢測這些特異性的波信號，從而達到檢測變應(yīng)原的目的。BICOM2000不僅能夠檢測塵螨、花粉、化學物質(zhì)、食物等490多種變應(yīng)原，還能對藥品進行快速檢測[32]，適用于皮膚科、耳鼻喉科、小兒科、呼吸科、消化科等科室的臨床診療工作[33]。該設(shè)備檢測效率高，僅需20 min就能確定變應(yīng)原，安全無創(chuàng)，簡單快捷，患者易接受[34]。樓潔[35]用BICOM生物共振檢測儀和UniCAP100全自動體外變應(yīng)原檢測系統(tǒng)對包括吸入性(塵螨)、食物性(花生、魚類、桃)、真菌等7類變應(yīng)原進行了檢測，發(fā)現(xiàn)兩者的檢測結(jié)果相符合，且該方法對老年人或幼齡兒童的變應(yīng)原初篩尤為適用。但由于該類檢測應(yīng)用了物質(zhì)波理論，檢測過程容易受到外界環(huán)境、操作人員、受檢測人員自身干擾波影響，誤差難以避免，且本儀器為手動操作，實驗重復性差，較依賴操作人員的經(jīng)驗。目前，對于該方法使用存在較大爭議，還有待進一步的驗證。

3 結(jié) 語

本文對基于血清sIgE檢測與基于變應(yīng)原直接檢測的生物共振法進行了綜述?；谘錽IgE的幾種檢測方法各有優(yōu)缺點。在檢測費用方面，ELISA與RAST的檢測靈敏度與特異度相當，但ELISA更無污染且價格合理；而UniCAP檢測系統(tǒng)雖然是目前公認的血清sIgE檢測的“金標準”，但是儀器較為昂貴，僅部分大型醫(yī)療機構(gòu)有條件引進該檢測系統(tǒng)，而且由于檢測費用較高，主要適用于經(jīng)濟條件較好的患者。在檢測速度方面，納米磁微?；瘜W發(fā)光法檢測時間短，結(jié)果可靠，重復性好，靈敏度達pg級；Mediwiss敏篩也只需250 μL血清即可檢測20多種變應(yīng)原sIgE，在小兒變應(yīng)原初篩方面應(yīng)用較多。其余檢測方法，如液相芯片法雖具有高通量、檢測范圍廣等優(yōu)點，但對操作技能要求高；而生物共振檢測法可以直接體外檢測確定變應(yīng)原種類，無任何痛苦，但檢測結(jié)果不穩(wěn)定，容易受到外界條件的干擾。因此，基于上述不同檢測方法的優(yōu)缺點，在臨床診療中，醫(yī)務(wù)人員可以為不同人群選擇合適的變應(yīng)原體外檢測方法。綜上，過敏性疾病對人類生命健康的影響越來越廣泛，隨著體外檢測技術(shù)的進一步發(fā)展，預防和診治過敏性疾病將更加方便快捷。