許瀚仁,王繼納,楊橙,許明(復旦大學附屬中山醫(yī)院泌尿外科,上海市器官移植重點實驗室,上海 200032)
BK 多瘤病毒(BK polyomavirus, BKV)是隸屬于多瘤病毒科的雙鏈DNA 病毒,在免疫力正常的人群中缺乏臨床癥狀,潛伏在腎臟腎小管上皮細胞和尿路上皮細胞中,處于休眠期。在腎移植患者使用大劑量免疫抑制治療后,會激活休眠期BKV 的活性,運輸?shù)饺四I小管上皮細胞(human renal proximal tubular epithelial cells, HRPTEC)內(nèi)大量復制,細胞損傷、脫落,產(chǎn)生輸尿管潰瘍導致基底膜的破壞,病毒進而進入腎實質(zhì)和血液循環(huán),發(fā)展成為病毒血癥,進一步發(fā)展可引起輸尿管狹窄和BKV 相關性腎?。˙K virus associated nephropathy, BKVAN),而BKV 從潛伏再激活會造成腎小管上皮細胞和尿路上皮細胞病變,從而導致腎小管上皮脫落加快BKV 傳播速度和反復感染[1]。因此,了解BKV 與腎小管上皮細胞的最新研究進展能為今后臨床上BKV 感染的診斷及治療方案的選擇提供一定的參考。本文將著重探討B(tài)KV 與HRPTEC 的感染途徑機理及關鍵因素、HRPTEC 相關的治療新靶點和BKV 感染HRPTEC 的臨床診斷及治療。
臨床上為了治療BKV 感染,大多時候是選擇減少免疫抑制劑和使用抗病毒藥物的治療方案,但是如此的治療方案無法有效阻止BKV 內(nèi)轉運到HRPTEC,病毒仍然可以感染細胞并復制,損傷脫落時感染其余的尿路上皮細胞,加重移植腎功能損傷。初次BKV 感染后,病毒仍潛伏在不同的泌尿系統(tǒng)部位上,特別是腎臟及尿道的上皮細胞[2]。潛伏期可能會在正常人中無癥狀性尿毒癥,但在免疫抑制情況下,BKV 再激活從膀胱沿尿道上皮細胞上升感染,引起輸尿管狹窄,進而導致BKV 在輸尿管位置以上反復感染及自身復制,包含膀胱與腎臟等上下尿路途徑。尿道上皮細胞中HRPTEC 作為BKV 感染的主要天然靶細胞,了解BKV 感染HRPTEC 的機制有助于研發(fā)早期抑制BKV 復制的治療辦法。
早期研究發(fā)現(xiàn)BKV 經(jīng)小窩介導的內(nèi)吞機制進入Vero 細胞(非洲綠猴腎細胞)細胞膜質(zhì)膜內(nèi),Vero細胞作為靶細胞可以解釋BKV 早期感染細胞其中一種過程[3]。但是HRPTEC 是整倍體細胞,而Vero 細胞作為非整倍體細胞不利于BKV 感染研究。由于HRPTEC 在自然狀態(tài)下就是BKV 感染的主要靶細胞,因此用HRPTEC 作為病毒感染靶細胞能減少細胞層面的誤差[4],實驗結果與臨床實際情況更加貼切。
有研究發(fā)現(xiàn)BKV 能經(jīng)小窩介導的內(nèi)吞作用進入HRPTEC 細胞膜內(nèi),小窩蛋白-1(Caveolin-1,Cav-1)是小窩的標志蛋白質(zhì),經(jīng)由siRNA 介導敲除CaV-1 基因表達和消耗細胞膽固醇減少小窩介導的內(nèi)吞機制能夠抑制BKV 感染HRPTEC[5]。
通過電鏡對BKVAN 患者的腎穿刺組織進行超微結構觀察發(fā)現(xiàn)病毒顆粒是以無被膜形式進入HRPTEC,這從形態(tài)學上支持BKV 能經(jīng)網(wǎng)格蛋白包被小窩介導的內(nèi)吞機制進入靶細胞[6]。而Sorokin 實驗室的結果表明,敲除Cav-1 基因可抑制BKV 感染HRPTEC,而敲除網(wǎng)格蛋白基因沒法抑制BKV 感染。BKV 似乎是通過小孔而不是通過網(wǎng)格蛋白介導的途徑進入HRPTEC,此研究進一步支持小窩內(nèi)吞機制是BKV 感染HRPTEC 的重要機制[4]。BKV 在附著于HRPTEC 的細胞表面后,BKV 顆粒沿細胞表面移動,并在感染后4 h 被轉運至小窩之中。經(jīng)由小窩介導的細胞內(nèi)吞作用后,若胞內(nèi)微管運動正常,BKV 能沿著微管穿過內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum, ER)運輸至細胞核中,內(nèi)運輸過程與運動蛋白的作用無關,該研究能證明BKV 是小窩介導的內(nèi)吞機制后是經(jīng)沿著細胞微管結構轉運進靶細胞內(nèi)。
有研究證明BKV 可以入侵至外泌體-細胞外囊泡(extracellular vesicle,EV)中,從而使BKV 顆??梢允褂锰娲緩竭M入HRPTEC,提供了BKV 發(fā)病機理的新觀點。盡管在比較EV 相關顆粒和裸BKV粒子時,我們沒有發(fā)現(xiàn)對中和抗體的敏感性降低,但該研究也提出有關基于誘導或施用中和抗體制定預防策略的重要問題[7]。
BKV 在感染后6 ~ 8 h 到達ER,繞過高爾基體(Golgi apparatus, GA)或迅速通過GA。然后BKV顆粒進入細胞核中進行病毒復制,并且在細胞破碎后子病毒被轉運至其他細胞。BKV 感染HRPTEC的過程相對緩慢,感染周期至少需要24 ~ 48 h,與多瘤病毒的SV40 感染非常相似。這是第一份證明BKV 感染獨特時程并提供BKV 主要自然靶點HRPTEC 中BKV 細胞內(nèi)運輸機制的證據(jù)的報告。每種細胞類型的病毒生命周期都非常不同,因此,使用HRPTEC 闡明BKV 感染的精確機制和動力學非常重要。
上文闡述3 種BKV 感染途徑,包含無被膜形式進入細胞內(nèi)、經(jīng)小窩介導的內(nèi)吞機制運輸至細胞內(nèi)和入侵胞外的外泌體經(jīng)替代途徑感染HRPTEC。破譯這種新的釋放途徑可以使治療靶標的識別能夠更好的預防BKVAN 發(fā)生。
腎臟中病毒感染的特征是病毒和/或細胞毒性淋巴細胞直接誘發(fā)的腎小管損傷,損傷脫落BKV 感染的HRPTEC 通過不斷地復制和轉染其他尿路上皮細胞,BKV 進一步擴散感染尿路上皮細胞,感染程度加重發(fā)展成BKVAN[8]。
如前文所述,已知BKV 是通過小窩介導的內(nèi)吞機制和微管結構進入至細胞中,是BKV 感染HRPTEC 的關鍵步驟[5],降低膽固醇的藥物能夠可抑制細胞膜上小窩介導的內(nèi)吞機制,進而 干 預BKV 感 染HRPTEC。 在Moriyama 研 究中,HRPTEC 與BKV 和普伐他汀共培養(yǎng),發(fā)現(xiàn)BKV 感染的HRPTEC 比例與對照組相比明顯下降。而普伐他汀抑制BKV 感染細胞的機制是由于普伐他汀通過抑制膽固醇的合成降低Cav-1 的水平,從而阻礙BKV 經(jīng)細胞內(nèi)吞機制運輸至細胞內(nèi)。平時用來治療高膽固醇血癥的他汀類藥物在體外實驗能夠抑制HRPTEC 小窩介導的內(nèi)吞機制,同時證實降低膽固醇能有效降低BKV 感染的風險[9]。盡管已經(jīng)證實普伐他汀能降低Cav-1水平,但仍有研究顯示他汀類藥物抑制BKV 感染可能與降低HRPTEC 中Cav-1 的表達并干擾內(nèi)在標記化BKV 顆粒來抑制BKV 的內(nèi)運輸[9]。
研究發(fā)現(xiàn),HRPTEC 表達3 種dsRNA:Toll 樣受體3(TLR3)、黑素瘤分化相關基因5(MDA5)和視黃酸誘導基因I(RIG-I),以及雙鏈RNA 的所有傳感器。而研究證明巨細胞病毒(cytomegalovirus,CMV)或BKV 感染期間腎臟移植活檢中這3 種dsRNA 傳感器的表達增加。在初級腎小管上皮細胞中,dsRNA 傳感器的激活誘導了促炎性TNF-α 和抗病毒IFN-β 的產(chǎn)生。值得注意的是,dsRNA 還增強了促凋亡蛋白的表達。然而,由于抗凋亡蛋白的表達,單獨的dsRNA 并不會導致細胞死亡。dsRNA 使HRPTEC 對由抗Fas 受體激動性抗體誘導進行凋亡,這是一種清除被BKV 感染細胞的凋亡途徑。這些發(fā)現(xiàn)表明,HRPTEC 至少需要兩個信號才能進行凋亡,即使在炎性條件下也可以幫助保持腎小管的完整性。因此,病毒dsRNA 的傳感器可促進HRPTEC 中的抗病毒作用、促炎和促凋亡反應,協(xié)調(diào)腎臟中BKV 感染的控制[10]。
如今已知降膽固醇藥物能抑制CaV-1 相關的感染途徑、BKV 的dsRNA 傳感器表達有助于抗病毒作用,針對HRPTEC 抗BKV 感染新機制的研究進展將能啟發(fā)治療BKV 相關性疾病的新方法,為病毒特異性的拮抗劑奠定了基礎。
3.1 臨床診斷:對于BKV 感染腎小管上皮細胞后的病毒擴增最好用以下感染模型解釋:BKV 在腎臟中開始復制,然后尿路上皮擴增和腎小管上皮細胞脫落交叉發(fā)生,在約10 周后達到動態(tài)平衡。將腎內(nèi)復制減少50%無效,并且在7 周內(nèi)清除病毒血癥需要>80%,但病毒尿持續(xù)超過14 周。減少>90%的病毒血癥和病毒血癥分別在3 周和10 周時清除。該模型在前瞻性監(jiān)測的KT 患者中進行了臨床驗證,支持減少80%以上的最佳干預措施[11]。
目前主流BKV 感染性和發(fā)病機制的研究焦點主要集中在HRPTEC 上,大多數(shù)研究已將其作為導致BKVAN 纖維化的主要病毒庫和致病性途徑的主要驅動力[5]。這些報告得出結論,在免疫抑制的腎移植患者中,腎小管上皮細胞是病毒潛伏和再激活的主要部位[1]。發(fā)現(xiàn)來自幾項研究的證據(jù)支持以下觀點:腎小管上皮細胞感染、移植腎功能丟失,腎小管壞死是與BKVAN 相關的腎纖維化的必要先決條件。
腎移植功能下降是最常見的表現(xiàn)時間?;颊邿o癥狀,血清進行性升高肌酐[12]。間質(zhì)性腎炎與BKV 感染有關很難與急性細胞排斥反應區(qū)分開。后續(xù)的纖維化改變可導致慢性同種異體腎病。有報道顯示膀胱區(qū)的上行BKV 感染可導致移植腎輸尿管狹窄和尿路梗阻,隨后同種異體移植物阻塞。實驗室檢查可發(fā)現(xiàn)BKV 在尿中和血中的復制增加,即較高水平的BKV 也與出血性膀胱炎,可能是BKV 的最初表現(xiàn)腎移植受者的腎?。?2]。在出現(xiàn)血清肌酐升高之前,BKV 尿癥和BKV 血癥兩者均與BKVAN 有一定的相關性,但僅有部分BKV 感染患者會加重病情發(fā)展成BKVAN。其他臨床表現(xiàn)包括尿路梗阻和出血性膀胱炎,并可能成為BKVAN 的首發(fā)表現(xiàn)[13]。研究證明,體外細胞實驗中BKV 原發(fā)性HRPTEC 感染均未觸發(fā)抗病毒反應基因也不會誘導炎癥介質(zhì),因此尿液中白細胞升高和炎癥因子增多的臨床表現(xiàn)與BKV 感染的相關性有待商榷[14]。
Decoy 細胞是指細胞內(nèi)含有BKV 包涵體的脫落腎小管上皮細胞在BKV 感染患者的尿液中能檢測到Decoy 細胞,能證明移植腎內(nèi)有病毒復制并感染腎小管上皮細胞,但僅據(jù)此還不能診斷BKVAN。尿中檢出Decoy 細胞對診斷BKVAN 僅有29%的陽性預測價值[7]。然而,鏡下觀察Decoy 細胞不利于診斷BKV感染,人工操作容易誤判,操作流程耗時長,不利于長期隨訪和大量樣本檢測。國內(nèi)有研究團隊長期觀察BKV 感染患者的尿沉淀標本,發(fā)現(xiàn)免疫組化雙標志物染色能明確檢測出尿沉淀中出現(xiàn)腎小管上皮細胞來源和膀胱上皮細胞來源的Decoy 細胞,一定程度預測BKVAN 發(fā)生[15]。除了細胞學檢測以外,臨床檢驗中可經(jīng)血漿和尿液中的病毒DNA 檢測或病毒蛋白1( Viral Protein-1, VP-1) mRNA 做PCR定量檢測,是一種無創(chuàng)檢測BKV 感染的診斷性方法[7]。目前診斷BKV 感染的標準為:尿BKV DNA定量> 107拷貝/ml 或血漿BKV DNA 定量>104拷貝/ml ,此標準與證實BKVAN 的活檢結果有明顯相關性[16]。移植腎活檢是BKVAN 診斷的金標準,其病理特征包括以下特點: 腎小管上皮細胞、腎小球、集合管細胞出現(xiàn)細胞學改變及SV40 細胞標記陽性,腎間質(zhì)內(nèi)纖維組織增生和腎小管萎縮[17]。BKVAN 組織學改變可能是局灶的,或僅局限于髓質(zhì),所以移植腎活檢如果僅取材1 處,有近33%的臨床病例可能會出現(xiàn)漏診情況[18]。SV40 大T 抗原免疫組化染色有助于鑒別移植腎穿刺標本診斷為BKVAN 或是屬于移植后急性排斥反應[19]。然而移植腎穿刺對于其本身也存在損傷腎臟的風險,目前提出針對細胞學和PCR 定量檢測血液尿液標本針對的無創(chuàng)性診斷BKVAN方式有助于提升患者移植腎的存活時間[15-16]。3.2 治療:目前BKV 感染的治療主要目的是抑制病毒復制、增加自身免疫防御機制同時預防急性及慢性移植排斥反應發(fā)生、保護移植腎功能,多數(shù)情況下選擇減量免疫抑制劑的使用。各中心具體免疫抑制劑減量的方案不盡相同,一般是停用或減量嗎替麥考酚酯(mycophenolate Mofetil,MMF)用量,改用含有抗病毒作用的免疫抑制劑方案,也有調(diào)整鈣調(diào)磷酸酶抑制劑(calcineurin inhibitor,CNI)的免疫抑制藥用藥。
研究顯示,在臨床相關濃度下,CI 藥物中的西羅莫司(Sirolimus,SIR)能抑制BKV 復制,而他克莫司(Tacrolimus,Tac)則會反向激活BKV 復制。差異之處在于兩者需要同時競爭FKBP-12 蛋白位點,F(xiàn)KBP-12 是一種已知與任何一種藥物結合的小型宿主細胞蛋白,而SIR 通過與FKBP-12 結合和抑制mTOR 通路達到抑制HRPTEC 中BKV 的復制,Tac 與FKBP-12 結合后則是會促進mTOR 通路從而誘導BKV 的復制[20]。有研究表明SIR 和來氟米特聯(lián)合用藥后能降低BKV 的大T 抗原表達并減少BKV 復制。西羅莫司和來氟米特聯(lián)合抑制蛋白激酶途徑(PDK1、Akt、哺乳動物雷帕霉素信號轉導靶點和p70S6K),可能是抑制BK 病毒激活的有效途徑。由于SIR和來氟米特均具有免疫抑制活性,因此,聯(lián)合用藥可減少BK 發(fā)病機制,同時保持適當?shù)拿庖咭种扑剑?1]。而市面上常用的抗病毒藥物包含西多福韋(Cidofovir, CDV)和來氟米特(Lefluno-mide,LEF)[18],臨床上能作為MMF 藥物替代使用。
在抗病毒藥物當中, LEF 經(jīng)常用于治療BKVAN,LEF 的活性表征影響HRPTEC 中BKV 的生命周期。LEF 可將細胞外BKV 負荷降低90%,但具有顯著抑制宿主細胞的作用。尿苷類化合物的添加在很大程度上抵消了宿主細胞和抗病毒作用,這暗示非特異性嘧啶的消耗是來氟米特的主要抗BKV 感染的主要機制,證明來氟米特能抑制BKV 復制,但同時也抑制HRPTEC 的增生作用[22]。CDV 能抑制HRPTEC 細胞內(nèi)BKV 基因復制的水平達到抑制HRPTEC 的BKV 復制周期,并在較小的程度上抑制病毒體的組裝和釋放。CMV 目前已用于臨床上小病例的系列研究,研究顯示 CDV 是以劑量依賴的方式抑制病毒后代的產(chǎn)生,在40 lg / ml 時降低90%的病毒量。BKV 與受體結合和進入細胞等早期步驟似乎并未受到CDV 藥物影響,初期大T 抗原轉錄和表達也未受影響,但隨后的HRPTEC 內(nèi)BKV復制減少90%以上,晚期BKV 的mRNA 和相應的蛋白質(zhì)水平也降低90%。研究結果考慮為CDV 抑制大T 抗原表達下游的BKV DNA 復制,并涉及明顯的細胞毒性影響宿主細胞。在當前的治療和藥物開發(fā)中應考慮到這一項副作用[23]。
有臨床研究報道靜滴人免疫球蛋白(Intravenous immunoglobulin,IVIG)聯(lián)合免疫抑制劑減量能有效抑制BKV 活化復制[18]。IVIG 制劑的劑量范圍為從0.1 到2.0 g/kg,同時免疫抑制。的IVIG 制劑含有高滴度的BKV 有效中和抗體。盡管IVIG 不能穿透HRPTEC 細胞膜內(nèi)抑制BKV 復制,但其對BKV 的中和作用和過多的間接免疫調(diào)節(jié)作用可能有助于改善BKV 感染情況[24]。國內(nèi)研究也發(fā)現(xiàn)免疫抑制劑咪唑立賓在體外實驗能有效抑制BKV 感染HRPTEC。在高藥物濃度情況下僅抑制BKV 在細胞內(nèi)的活性,不會出現(xiàn)抑制HRPTEC 增殖再生的作用,臨床上有能保護正常移植腎功能和抑制BKV 感染的潛力[25]。
如今為止抗病毒治療的療效有限,臨床上尚未有明確的有效治療方案,并且抗病毒藥物大多含有腎毒性,會損失HRPTEC 以及移植腎功能,今后BKV 感染的治療方向針對BKV 運輸至HRPTEC 的初始步驟進行干預。
BKV 在HRPTEC 內(nèi)活化復制是BKV 感染以及BKVAN 發(fā)病的主要因素,對該病毒的免疫逃逸和預防發(fā)病的機制仍然知之甚少,目前,腎移植患者感染BKV 后仍然缺乏有效的治療選擇,針對抗BKV感染HRPTEC 的藥物治療將會是未來臨床治療研究方向的主流。