陳艷，趙月，何楝楝，王僚陽，王曉川

中國科學院大學深圳醫(yī)院藥學部，廣東深圳518107

急性胰腺炎(AP)是一種常見的腹部炎癥性疾病，常由膽管疾病、過量飲酒、藥物、膽管和胰管的侵入性手術引起，導致胰酶異常激活消化胰腺自身組織，吸引免疫細胞浸潤到損傷部位，釋放大量的細胞因子，如白細胞介素1β(IL-1β)、腫瘤壞死因子α(TNF-α)等，從而造成局部胰腺組織和相關臟器損傷，激活核轉錄因子κB(NF-κB)信號通路釋放炎癥因子進一步加重炎癥反應，嚴重時可發(fā)生全身炎癥反應綜合征，甚至導致多器官功能衰竭[1-3]。目前臨床治療AP主要采用液體復蘇、營養(yǎng)支持和鎮(zhèn)痛等對癥支持療法，但效果不理想。山萘酚是一種天然黃酮，廣泛存在于茶、西蘭花、蘋果、草莓和豆類中，具有抗炎、抗感染、抗氧化、抗癌、心臟保護、神經(jīng)保護和抗糖尿病等特性[4-5]。但對AP的治療作用還不明確。2020年8月—2021年3月，本研究觀察了山萘酚對雨蛙素誘導小鼠AP的干預作用，并探討山萘酚相關機制，為AP臨床治療提供新的方法。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與主要材料 24只C57BL/6雄性小鼠購自北京維通利華公司，鼠齡8～10周，體質量20～22 g。雨蛙素購自美國Sigma公司。BCA蛋白濃度測定試劑盒購自北京索萊寶公司。GAPDH抗體購自上海碧云天公司。NF-κB抗體購自美國CST公司。血清淀粉酶購自上海酶聯(lián)生物科技有限公司。TNF-α、IL-1β檢測試劑盒購自美國Proteintech公司。

1.2 模型制作及給藥方法 小鼠適應性飼養(yǎng)1周，隨機分為對照組、模型組、實驗組，每組8只。模型組和實驗組制作AP模型，腹腔注射雨蛙素(50 μg/kg，溶于PBS)8次，每次間隔1 h；實驗組在雨蛙素注射前1 h腹腔注射山萘酚(20 mg/kg，溶于DMSO)。對照組不制作模型，注射等量PBS，造模12 h后處死小鼠。

1.3 胰腺病理組織觀察 取胰腺組織，4%多聚甲醛固定，石蠟包埋，切成4 μm厚切片，用HE染色，光學顯微鏡下觀察胰腺形態(tài)并對胰腺組織進行病理損傷評分[6]。

1.4 血清淀粉酶及炎癥因子檢測 采用ELISA法檢測血清淀粉酶及TNF-α、IL-1β，按試劑盒說明書操作。

1.5 胰腺組織中TNF-α、IL-1β、NF-κB蛋白檢測 采用免疫組化法檢測胰腺組織中的TNF-α、IL-1β。石蠟切片經(jīng)二甲苯脫蠟、乙醇梯度水化(100%、95%、85%、75%的乙醇)，H2O2孵育阻斷內(nèi)源過氧化物酶活性；抗原修復，封閉，一抗孵育并4 ℃過夜，加二抗孵育；3,5-二氨基聯(lián)苯胺顯色，顯微鏡下觀察顯色反應；蘇木精復染10 min，乙醇梯度脫水(75%、85%、95%、100%的乙醇)，二甲苯浸泡，封片，光學顯微鏡下觀察，并用Image J軟件進行定量分析平均光密度。采用Western blotting法檢測胰腺組織中的NF-κB蛋白。小鼠胰腺組織剪碎提取蛋白，BCA法測定蛋白濃度；每孔加入20 μg蛋白，電泳(80 V電泳30 h，150 V電泳50 min)、300 mA恒流濕轉1 h、封閉1 h凝膠電泳；加一抗孵育4 ℃過夜(1∶1 000)，洗膜3次，二抗室溫孵育1 h，洗膜3次，化學發(fā)光法顯影。以GADPH為內(nèi)參，采用Image J軟件進行分析，以目的蛋白條帶與內(nèi)參條帶灰度值比值表示目的蛋白相對表達量。

2 結果

2.1 各組小鼠胰腺組織病理變化 模型組小鼠胰腺組織水腫、炎細胞浸潤和細胞壞死，實驗組小鼠胰腺損傷程度明顯減輕。模型組胰腺組織水腫、炎細胞浸潤、腺泡細胞壞死評分低于對照組，實驗組胰腺組織水腫、炎細胞浸潤、腺泡細胞壞死組織學評分低于模型組(P均<0.01)。見表1、圖1。

表1 各組小鼠胰腺組織病理評分比較(分，

圖1 各組小鼠胰腺組織病理變化(HE染色，100×)

2.2 各組小鼠血清淀粉酶、TNF-α、IL-1β水平比較 模型組血清淀粉酶、TNF-α、IL-1β水平高于對照組，實驗組血清淀粉酶、TNF-α、IL-1β水平低于模型組(P均<0.01)。見表2。

表2 各組小鼠血清淀粉酶、TNF-α、IL-1β水平比較

2.3 各組小鼠胰腺組織中TNF-α、IL-1β、NF-κB蛋白表達比較 模型組胰腺組織中TNF-α、IL-1β、NF-κB蛋白表達高于對照組，實驗組TNF-α、IL-1β、NF-κB蛋白表達低于模型組(P均<0.05)。見表3、圖2。

表3 各組小鼠胰腺組織中TNF-α、IL-1β、NF-κB蛋白表達比較

圖2 各組小鼠胰腺組織中TNF-α、IL-1β、NF-κB蛋白表達情況(免疫組化法)

3 討論

AP是胰腺的一種急性炎癥性疾病，除了胰腺局部病變外，還常伴有明顯的全身炎癥反應，甚至伴有多器官損傷[7-8]。目前臨床上AP的治療多為液體復蘇和對癥支持治療，尚無特異性藥物[8-9]。越來越多的證據(jù)表明，炎癥反應是疾病進展的主導因素[10-11]，因此，探討AP早期炎癥機制，尋找一種針對炎癥過程的潛在治療方法具有重要的臨床意義。

山萘酚是一種天然黃酮具有抗炎、抗感染、抗氧化、抗腫瘤、心臟保護、神經(jīng)保護和抗糖尿病等特性[4-5]。然而，山萘酚在AP中的藥理作用尚不清楚。雨蛙素是一種縮膽囊素類似物，本研究用雨蛙素誘導AP小鼠模型，該模型穩(wěn)定且已被廣泛應用于實驗性AP的研究[12-13]。本研究結果顯示，山萘酚能明顯減輕雨蛙素誘導的小鼠AP，明顯減輕AP引起的胰腺組織病理損傷，小鼠胰腺組織病理學評分(壞死、空泡化、炎細胞浸潤)及血清淀粉酶水平明顯降低，血清炎癥因子TNF-α、IL-1β水平降低，并下調(diào)胰腺組織中NF-κB的表達，提示山萘酚可能通過抑制NF-κB信號通路的激活來抑制胰腺炎癥反應。

炎癥是AP發(fā)展的一個主要過程，胰腺局部和全身器官損傷的嚴重程度取決于促炎細胞因子的表達水平。TNF-α、IL-1β等促炎因子在AP發(fā)生發(fā)展中起重要作用。研究表明，抑制炎癥因子表達有利于減輕疾病嚴重程度[14-15]。當有害刺激作用于胰腺時，胰腺腺泡細胞內(nèi)酶原的過早激活可引起腺泡細胞損傷，引起局部炎癥反應；另一方面，胰腺腺泡細胞受損后，本身產(chǎn)生炎癥因子、趨化因子等，吸引免疫細胞浸潤到損傷部位，釋放大量細胞因子，如TNF-α、IL-1β、IL-6等，從而造成局部胰腺組織和相關臟器損傷[16-17]。本研究結果與相關研究一致，模型組小鼠血清TNF-α、IL-1β水平高于對照組，而山萘酚可顯著抑制血清及胰腺組織中TNF-α和IL-1β的表達，因此認為山萘酚可以減少炎癥因子的產(chǎn)生，以減輕雨蛙素誘導的AP。

NF-κB通路是調(diào)節(jié)AP炎癥介質轉錄和生物合成的重要信號通路，在AP的發(fā)展中發(fā)揮了關鍵作用。通常情況下，NF-κB在細胞質中與IκB結合處于非活動狀態(tài)，當細胞受到炎癥因子及其他有害物質等的刺激時，IκBs降解，NF-κB核易位信號暴露，NF-κB轉錄因子進入細胞核與其同源DNA序列結合并誘導靶基因轉錄，介導多種炎癥介質表達[18]。多種AP實驗模型表明，NF-κB激活與小鼠AP的嚴重程度有關[19-20]，藥物抑制NF-κB信號通路的激活可顯著減輕AP[21]。本研究發(fā)現(xiàn)，模型組NF-κB通路被激活,而NF-κB在實驗組中表達被顯著抑制，因此，我們推測山萘酚減輕AP炎癥反應可能是通過抑制NF-κB信號通路激活來實現(xiàn)的。

綜上所述，本研究表明，KF可以通過減輕AP小鼠的炎癥反應，抑制NF-κB炎癥通路的激活改善AP預后，而其在AP中的特異性作用靶點有待進一步研究。