劉紅艷，尹以瑞，楊力權(quán)，楊潤芬，桑 鵬

(大理大學農(nóng)學與生物科學學院，云南 大理 671003)

尿酸氧化酶(urate oxidase，Uox)是一類主要存在于大多數(shù)脊椎動物的肝臟、腎臟中，參與嘌呤代謝的氧化還原酶[1-2].尿酸由生物體嘌呤代謝產(chǎn)生，以尿酸鹽為其主要存在形式，溶解度低(0.5 mmol/L，37℃)[3]，在組織、關(guān)節(jié)等處易形成結(jié)晶[4].尿酸氧化酶可與氧分子結(jié)合，介導尿酸降解的酶促反應(yīng)[5]，將尿酸氧化為5-羥基異尿酸(5-HIU)，5-HIU不穩(wěn)定，轉(zhuǎn)化為尿囊素，尿囊素的溶解度是尿酸的5～10倍，溶于尿液經(jīng)腎臟排出[6-7].

1905年，Schittenhelm在牛腎中首次發(fā)現(xiàn)了尿酸氧化酶[8]，之后人們研究了源于豬、斑馬魚、產(chǎn)朊假絲酵母等許多物種的尿酸氧化酶，發(fā)現(xiàn)尿酸氧化酶在醫(yī)學診斷、疾病治療等方面具有重要作用[9].人以及部分高等靈長類動物(如猿類)的體內(nèi)沒有具有活性的尿酸氧化酶或不含完整的尿酸氧化酶基因[10-12]，尿酸在人體積累可引發(fā)多種尿酸代謝疾病.目前，尿酸氧化酶藥物的專利和技術(shù)大多被其他國家所掌握，國內(nèi)對尿酸氧化酶的研究較少，且臨床所用的重組尿酸氧化酶藥物普遍具有半衰期短、免疫原性高、價格高等缺陷，并且在人體內(nèi)環(huán)境條件下活性喪失嚴重，比活性一般小于60%[10-13].因此，廣泛研究不同生物來源尿酸氧化酶，尋找新的高產(chǎn)尿酸氧化酶菌株對研發(fā)新型尿酸氧化酶藥物意義重大.

本研究以云南大理蒼山地區(qū)土樣為材料，篩選出高產(chǎn)尿酸氧化酶菌株，對其16S rRNA基因序列及其酶學性質(zhì)進行探究，旨在為醫(yī)藥領(lǐng)域新備選產(chǎn)尿酸氧化酶菌株的開發(fā)應(yīng)用提供資源，為進一步開發(fā)利用該菌株提供基礎(chǔ)，也為進一步獲得產(chǎn)尿酸氧化酶基因的研究奠定基礎(chǔ).

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 土樣大理蒼山地區(qū)(海拔約2 214 m，東經(jīng)100.1°，北緯25.6°)，采集深度5～10 cm處土樣.

1.1.2 培養(yǎng)基及試劑尿酸基礎(chǔ)培養(yǎng)基(g/L)：MgSO4?7H2O 0.5，NaCl 0.1，K2HPO4?3H2O 0.5，KH2PO40.5，蛋白胨1，酵母提取物1，尿酸2，pH=7.0～8.0；固體菌株分離篩選培養(yǎng)基添加2%的瓊脂.

產(chǎn)尿酸氧化酶發(fā)酵培養(yǎng)基(g/L)：蛋白胨10，蔗糖20，NaCl 0.5，MgSO4?7H2O 1，KH2PO41，F(xiàn)eSO40.01，尿酸1.5，pH =7.0.

試劑：PBS( pH=7.6)，0.6 mmol/L硼酸-尿酸儲備液( pH=8.5)。為保證實驗精度，避免加強酸強堿對酶的影響，試驗中所用到的pH緩沖液均沒有使用酸堿pH試劑調(diào)pH，嚴格按照緩沖液配方配制緩沖液，經(jīng)pH計檢測準確后使用。磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液配制范圍為pH=3.0~8.0，氫氧化鈉-甘氨酸氫氧化鈉緩沖液配制范圍為pH=8.0～10.0。

1.1.3 實驗儀器設(shè)備艾柯超純水生成儀、電子分析天平、高壓蒸汽滅菌鍋(上海博迅醫(yī)療生物儀器股份有限公司)、超凈工作臺、Haier冰箱、紫外可見光分光光度計(上海菁華儀器公司)、高速冷凍離心機(上海安亭科學儀器公司)、SPX-250B-D型恒溫振蕩培養(yǎng)箱(上海一恒科學儀器有限公司)、Eppendorf PCR儀、BIO-RAD電泳儀(北京六一生物科技有限公司).

1.2 方法

1.2.1 菌株富集取蒼山土樣10 g于250 mL的無菌蒸餾水中，120 r/min振蕩12 h. 在無菌條件下，用移液槍吸取5 mL懸液于50 mL的尿酸基礎(chǔ)培養(yǎng)基中，置于37℃，轉(zhuǎn)速為180 r/min的恒溫震蕩培養(yǎng)箱中震蕩培養(yǎng)3～5 d，再靜置培養(yǎng)30 d.

1.2.2 菌株初篩將富集好的菌液搖勻后稀釋10-1、10-2、10-3、10-4和10-5，用移液槍分別吸取稀釋的菌液150μL接種在分離篩選培養(yǎng)基平板上，涂布均勻，于37℃，倒置培養(yǎng)24～48 h.觀察菌落生長情況，篩選單菌落.

1.2.3 菌株復(fù)篩將初篩得到的菌株單菌落再接種于分離篩選培養(yǎng)基平板上，采用四區(qū)劃線分離法，于37℃倒置培養(yǎng)2 d進行復(fù)篩，獲得純培養(yǎng).將復(fù)篩獲得純培養(yǎng)單菌落接種于200 mL液體發(fā)酵培養(yǎng)基中，37℃，180 r/min恒溫震蕩培養(yǎng)箱中震蕩培養(yǎng)，每10 h取菌液做后續(xù)測試.

1.2.4 菌株生長、尿酸降解量及胞內(nèi)外粗酶活檢測產(chǎn)酶發(fā)酵過程中每10 h取樣檢測菌體生長和尿酸降解量.菌體生長通過檢測發(fā)酵液OD600吸光值確定，尿酸降解量通過檢測發(fā)酵液上清OD290吸收值確定.菌株產(chǎn)尿酸氧化酶活性通過以發(fā)酵液或胞內(nèi)裂解液作為粗酶液，以尿酸為底物，檢測反應(yīng)前(OD對照)和反應(yīng)后(OD測試)290 nm下吸光值，以單位時間的尿酸減少量來確定酶活.將1 min 內(nèi)催化1μmol尿酸生成尿囊素所需要的酶量定義為尿酸氧化酶活力單位.具體公式如下：

式中，VT為反應(yīng)液總體積（mL），df為稀釋倍數(shù)，12.6為在290 nm波長下的微摩爾消光系數(shù)，VE為加入的酶液體積（mL），t為反應(yīng)時間（min）.

1.2.5 產(chǎn)酶菌株16S rRNA基因測序及鑒定根據(jù)北京天根生化科技有限公司提供的試劑盒以及說明書進行DNA的提取.使用通用引物27F：5′-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3′和1492R：5′-GGTTACCTTGTTACGACTT-3′擴增細菌16S rDNA[14-15].參考文獻[16-17]，進行PCR擴增，擴增條件為：預(yù)變性94℃，4 min，變性94℃，30 s，退火55℃，35 s，延伸72℃，90 s，32個循環(huán)后，最后延伸72℃，10 min.PCR產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳鑒定，120 V，20 min，紫外燈下觀察.瓊脂糖凝膠回收根據(jù)北京天根生化科技有限公司提供的試劑盒以及說明書進行PCR產(chǎn)物回收.將克隆子送昆明擎科生物科技有限責任公司測序，將獲得的序列提交GenBank (http://www.ncbi.nlm.nih.gov/genbank)，根據(jù)BLAST數(shù)據(jù)庫中細菌16S rRNA基因序列進行相似性比較分析，利用MEGA 7.1軟件進行系統(tǒng)進化分析.

1.2.6 酶學性質(zhì)收集最佳發(fā)酵時長條件下培養(yǎng)得到的菌體，經(jīng)超聲波細胞破碎(冰浴，30 mL pH 7.6 PBS，30 min)得到胞內(nèi)粗酶，用于后續(xù)實驗.

（1）pH對尿酸氧化酶活性的影響在最適酶活溫度下，配制不同pH值的緩沖液，磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液（pH=3.0～8.0），甘氫酸-氫氧化鈉緩沖液（pH=8.0～10.0），檢測不同的pH值(pH=3.0～10.0)對尿酸氧化酶酶活性的影響，以pH值增加0.6為1個梯度.每組實驗設(shè)置3個平行.

（2）溫度對尿酸氧化酶活性的影響將酶液分別在25～60℃條件下檢測尿酸氧化酶活性，每5℃為1個梯度.每組實驗設(shè)置3個平行.

（3）pH對尿酸氧化酶穩(wěn)定性的影響將酶液置于不同pH值的緩沖液中于4℃孵育12 h和24 h，以不做處理條件下所檢測到的活性為對照組，其余pH值的緩沖液處理后測得的酶活與其相比，并計算相對酶活，用相對酶活繪制出酶的pH穩(wěn)定性曲線.每組實驗設(shè)置3個平行.

（4）溫度對尿酸氧化酶穩(wěn)定性的影響將酶液分別置于不同的溫度(35、40、45℃)下保溫，在保溫20、40、60、80、100、120、140、160、180、200 min時測定酶活.以保溫0 min條件下所測得的酶活為對照組，其余溫度下所測得的酶活與其相比，并計算相對酶活，用相對酶活繪制出酶的熱穩(wěn)定性曲線.每組實驗設(shè)置3個平行.

1.2.7 尿酸氧化酶產(chǎn)酶條件優(yōu)化產(chǎn)尿酸氧化酶發(fā)酵培養(yǎng)基的組分為7個影響因素而作為研究對象，以尿酸氧化酶酶活為響應(yīng)值，進行試驗次數(shù)N=15的Plackett-Burman(PB)設(shè)計[18-19]，PB試驗設(shè)計的因素與水平見表1.

表1 Plackett?Burman試驗因素及水平設(shè)計Tab.1 Factors and levels of Plackett-Burman experiments(g/L)

2 結(jié)果與分析

2.1 產(chǎn)尿酸氧化酶菌株的篩選和鑒定通過分離篩選獲得具有尿酸降解能力的1株菌株，編號為DLCS-31，經(jīng)發(fā)酵初步酶活測試，酶活力為0.007 U/mL.經(jīng)16S rRNA基因測序，DLCS-31的序列長度為1 382 bp，將其16S rRNA基因序列(GenBank登錄號為NO.MW090726)與數(shù)據(jù)庫中的序列進行同源性比對，發(fā)現(xiàn)其與克雷伯菌屬的16S rRNA基因序列自然聚類，與Klebsiellasp.2392JX174269.1相似性超過99%，基于16S rRNA序列同源性構(gòu)建菌株DLCS-31的系統(tǒng)進化樹見圖1，從圖中可以看出DLCS-31與Klebsiellasp.菌株聚在一支，表明DLCS-31屬于Klebsiella屬的菌株.

圖1 基于16S r RNA序列同源性構(gòu)建菌株DLCS?31的系統(tǒng)進化樹Fig.1 Phylogenetic tree of strain DLCS-31 constructed based on the homology of 16S rRNA sequence

2.2 菌株生長和尿酸降解曲線實驗結(jié)果(圖2)顯示，DLCS-31經(jīng)發(fā)酵培養(yǎng)0～40 h生長量呈增長趨勢，尿酸殘余量在不斷降低，說明菌體在不斷增加，且降解著體系中的尿酸.40～50 h，生物量趨于平緩，無增大趨勢，尿酸殘余量也沒有再降低，說明菌體沒有再增加，酶不再降解尿酸.尿酸殘余量(以O(shè)D290表示)逐漸降低，在30～40 h期間，尿酸降解速度趨于平緩.

圖2 DLCS?31菌株生長和尿酸降解曲線Fig.2 Growth and uric acid degradation curves of DLCS-31 strain

2.3 胞內(nèi)胞外粗酶活測定按照實驗方法，檢測各發(fā)酵時長對應(yīng)胞內(nèi)胞外粗酶活(圖3).發(fā)酵20 h的胞內(nèi)酶酶活最高，因此選擇發(fā)酵20 h的胞內(nèi)粗酶做后續(xù)研究.

圖3 DLCS?31胞內(nèi)胞外粗酶活Fig.3 Extracellular and intracellular crude enzyme activity of DLCS-31

2.4 尿酸氧化酶酶學性質(zhì)分析

2.4.1 溫度和pH對尿酸氧化酶活的影響按照實驗方法，在不同pH和溫度條件下測定酶的活性，以相對酶活為縱坐標，pH和溫度為橫坐標做pH-酶活關(guān)系曲線，溫度-酶活關(guān)系曲線(圖4).

結(jié)果顯示(圖4)，反應(yīng)體系的pH從3.0升高到6.6過程中，尿酸氧化酶的相對酶活從0升高到100%，之后隨pH從6.6升高到10.0，酶活呈快速下降趨勢，該酶的最適pH應(yīng)在6.6左右.該酶的最適反應(yīng)溫度為40℃，從25℃到40℃該酶活總體呈現(xiàn)增大趨勢，過了40℃酶活快速減小，55℃檢測時已失活(圖4).

圖4 p H(a)和溫度(b)對菌株DLCS?31活性的影響Fig.4 Effects of pH (a)and temperature (b)on the activity of strain DLCS-31

2.4.2 pH和溫度對尿酸氧化酶穩(wěn)定性的影響以不經(jīng)處理條件下所測得的酶活為對照組，其余各pH和溫度條件下處理所測得的酶活與其相比并計算相對酶活，用相對酶活繪制出酶的pH和溫度穩(wěn)定性曲線(圖5).

結(jié)果顯示(圖5)，與最適pH測定時一致，pH=4.0以前，DLCS-31尿酸氧化酶活性較低，pH=10.0后，酶活逐漸消失；處理12 h的相對活性明顯高于處理24 h的，即隨處理時間增長，對應(yīng)酶活逐漸降低，但處理24 h整體趨勢仍保持pH對酶活性影響的一般趨勢，且處理24 h，最適pH附近酶活沒有損失，其余同一pH下活性損失不過半，說明該酶pH穩(wěn)定性較好.在35、40℃和45℃，該酶能夠在長時間內(nèi)維持超過60%的酶活，表明該酶熱穩(wěn)定性較好.隨保溫時長增加，相對酶活總體趨勢呈現(xiàn)降低趨勢，且溫度越高，失活越早，溫度耐受性質(zhì)符合一般酶的規(guī)律.

圖5 p H(a)和溫度(b)對菌株DLCS?31穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effects of pH (a)and temperature(b)on the stability of strain DLCS-31

2.5 尿酸氧化酶產(chǎn)酶條件優(yōu)化以產(chǎn)尿酸氧化酶發(fā)酵培養(yǎng)基組分為影響因素進行試驗次數(shù)N=15的Plackett-Burman(PB)設(shè)計，試驗的設(shè)計及結(jié)果見表2.

表2 Plackett?Burman試驗設(shè)計與結(jié)果Tab.2 Design and results of Plackett-Burman experiments

結(jié)果顯示(表2)，試驗號2、5、6、7、8、11、12、13、14和15酶活低于優(yōu)化前(0.007 U/mL)，試驗號1、3、4、9和10酶活明顯高于優(yōu)化前，其中試驗號4產(chǎn)酶條件優(yōu)化效果最好，酶活約提高了4.3倍，達到了明顯的優(yōu)化效果.表明試驗號4的條件設(shè)計為菌株DLCS-31的最佳產(chǎn)酶條件.

3 討論

微生物種類繁多，是尿酸氧化酶的重要來源之一，但99%以上的微生物在實驗室條件下無法培養(yǎng).克隆和表達不同來源微生物的尿酸氧化酶基因是研發(fā)高效重組尿酸氧化酶藥物的重要方法[20-21].尿酸氧化酶作為醫(yī)學檢測試劑和高尿酸相關(guān)疾病治療用酶，具有非常廣泛的市場應(yīng)用前景.目前已有黃曲霉菌(Actinomadura amylolytica)、產(chǎn)朊假絲酵母菌(Candida utilis)和枯草芽孢桿菌(Bacillus subtilis uricase)等微生物被用于尿酸氧化酶的商業(yè)化生產(chǎn)，但是存在產(chǎn)酶量普遍較低，無法滿足尿酸氧化酶生產(chǎn)的需求，且存在分離純化程序復(fù)雜、酶學性質(zhì)不穩(wěn)定、抗原性高等問題[2，13].臨床所用的重組尿酸氧化酶藥物普遍具有半衰期短、免疫原性高、價格高等缺陷，并且在人體內(nèi)環(huán)境條件下活性喪失嚴重，比活性一般小于60%[10-12].

本研究從蒼山土壤環(huán)境中篩選得到了具有尿酸降解能力的1株菌株，編號為DLCS-31，經(jīng)發(fā)酵初步酶活測試，酶活力為0.007 U/mL.經(jīng)PB設(shè)計優(yōu)化產(chǎn)酶條件，酶活約提高了4.3倍，為0.030 U/mL.經(jīng)16S rRNA基因測序分析，DLCS-31屬于Klebsiella屬的菌株.該酶的最適反應(yīng)溫度為40℃，在25～50℃條件下有活性，表明該酶有良好的溫度環(huán)境適應(yīng)性，與大理本地環(huán)境溫度較為相符.其最適pH為6.6，屬于中性尿酸氧化酶，在pH 4.0～10.0范圍內(nèi)該酶有活性，表明該酶pH適應(yīng)范圍較廣，對環(huán)境酸堿性不敏感，環(huán)境適應(yīng)性較強. 在35、40 ℃和45℃下，該酶能在100 min以內(nèi)保持超過60%的酶活，表明該酶熱穩(wěn)定性較好.隨保溫時長增加，相對酶活總體趨勢呈現(xiàn)降低趨勢，且溫度越高，失活越早，溫度耐受性質(zhì)符合一般酶的性質(zhì).不同pH條件下處理12、24 h，該酶在pH 4.0～9.0范圍內(nèi)，能維持70%以上的活性，說明該酶pH耐受性較好.但與江紹鋒、趙運勝和Bongaerts G.P.A早期報道的Klebsiella oxytoca[22]，B. fastidiouss[23-24]及劉廣楨等報道的Candida utilis[8]相比，酶活力較低，且最適溫度、pH等酶學性質(zhì)有一定的差異.此外，野生菌的生長和產(chǎn)酶依賴尿酸誘導，并且可同化的底物少，這就提高了尿酸氧化酶的生產(chǎn)及研究成本，尚需遺傳改良以提高產(chǎn)酶率及活性.野生菌株的遺傳背景相對復(fù)雜，提高酶活和改進酶學性質(zhì)存在一定難度.因此，提高酶活性及改進酶學性質(zhì)是我們下一步重點研究的方向.