李睿帆，陳玉保，王菊華，莊詩(shī)韻，張文杰，胡良棟

白菜渣汁混合高溫厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣及微生物群落結(jié)構(gòu)研究

李睿帆，陳玉保*，王菊華，莊詩(shī)韻，張文杰，胡良棟

(云南師范大學(xué)能源與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，昆明 650500)

為了探究蔬菜渣和蔬菜汁混合后對(duì)其厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣潛力的影響，并為混合蔬菜渣汁厭氧發(fā)酵工程的應(yīng)用提供合理性的分析與建議。采用批量式的發(fā)酵方式，選取白菜渣汁混合物為反應(yīng)原料，在高溫（55±1）℃下，底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%、白菜渣粒徑為0.85 mm，其中白菜渣加水的實(shí)驗(yàn)組3（白菜渣68.34 g，水331.66 mL接種物的量為120 mL）TS降解率、VS降解率、第2個(gè)日產(chǎn)氣高峰、最高CH4含量和累積總產(chǎn)氣量分別為56.13%、61.06%、525 mL、66.19%和3 390 mL，發(fā)酵前后pH值分別為7.2和7.6均在產(chǎn)甲烷菌的正常pH范圍，結(jié)果均優(yōu)于其他實(shí)驗(yàn)組的對(duì)應(yīng)指標(biāo)。利用100 L的發(fā)酵罐對(duì)其進(jìn)行連續(xù)攪拌厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣的小試放大實(shí)驗(yàn)并分析生物群落結(jié)構(gòu)，通過(guò)高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)在綱水平上，古菌主要以甲烷桿菌綱、甲烷微菌綱為主；在屬水平上，嗜熱彎曲甲烷熱桿菌屬是反應(yīng)器中最主要的產(chǎn)甲烷菌（占總菌量的55%～81%），甲烷八疊球菌屬是第二主導(dǎo)的產(chǎn)甲烷菌屬（占總菌量的16%～42%）。在連續(xù)攪拌過(guò)程中，甲烷主要由甲烷八疊球菌屬利用CO2和H2通過(guò)還原CO2產(chǎn)甲烷途徑和乙酸產(chǎn)甲烷途徑產(chǎn)生，即甲烷八疊球菌屬對(duì)連續(xù)攪拌實(shí)驗(yàn)組的甲烷產(chǎn)生起主導(dǎo)作用。

高溫；厭氧發(fā)酵；白菜渣汁；沼氣；微生物群落結(jié)構(gòu)

隨著我國(guó)農(nóng)村產(chǎn)業(yè)結(jié)構(gòu)的調(diào)整和城鎮(zhèn)居民生活水平的不斷提高，蔬菜作物的種植在農(nóng)業(yè)中的比重不斷增大，中國(guó)的蔬菜生產(chǎn)和消費(fèi)躍居世界第一，目前蔬菜已經(jīng)成為我國(guó)種植業(yè)中的第二大農(nóng)作物。據(jù)“2019年中國(guó)蔬菜產(chǎn)業(yè)大會(huì)”報(bào)道[1]，2018年我國(guó)蔬菜種植面積已突破3億畝，產(chǎn)量已達(dá)7億t以上。但大量質(zhì)量不佳的蔬菜和凈菜加工處理時(shí)產(chǎn)生的葉、根、莖和果實(shí)等都會(huì)最終成為固體廢棄物，造成資源浪費(fèi)環(huán)境污染[2]。蔬菜廢物不僅在生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生，在配送鏈中也會(huì)大量產(chǎn)生[3]。在收獲、運(yùn)輸、儲(chǔ)存、銷售和加工過(guò)程中，超過(guò)30%的蔬菜以蔬菜廢物的形式流失[4-5]。據(jù)估算，我國(guó)的各類蔬菜廢物產(chǎn)量每年可達(dá)6億t以上，生物質(zhì)資源利用率卻未能達(dá)到30%[6]。由于蔬菜廢物具有高含水量（＞80%）、高有機(jī)物含量（＞95%干燥基），對(duì)垃圾填埋場(chǎng)和焚燒系統(tǒng)產(chǎn)生嚴(yán)重的負(fù)面影響，殘留的生物降解導(dǎo)致滲濾液的產(chǎn)生和溫室氣體的排放[7]。目前，國(guó)內(nèi)外處理蔬菜廢物的方法主要有直接還田法、堆肥法、飼料法、填埋焚燒法和厭氧發(fā)酵處理技術(shù)等。相比其他方法，厭氧發(fā)酵技術(shù)能將蔬菜廢物轉(zhuǎn)化成沼氣，沼氣具有清潔、安全和優(yōu)質(zhì)的優(yōu)點(diǎn)，可用于農(nóng)業(yè)生產(chǎn)作為燃料供能還可用于發(fā)電和供熱等[8]。此外，厭氧發(fā)酵可將原料的質(zhì)量體積減少大約50 %，沼氣、沼渣作為副產(chǎn)物可直接用作土壤改良劑[9-10]或用作高質(zhì)量堆肥制備的原料[11-13]，實(shí)現(xiàn)資源的最大化利用，甚至可以減少或去除病原體[14]。劉芳等[15]利用各類蔬菜廢物與牛糞在中溫（35 ℃）條件下用2.5 L的發(fā)酵瓶進(jìn)行厭氧發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，結(jié)果發(fā)現(xiàn)蔬菜廢物單獨(dú)發(fā)酵時(shí)甘藍(lán)菜的平均CH4含量最高；CH4含量可通過(guò)添加牛糞的方式得以提高。國(guó)外，Ghosh等[16]報(bào)道了城市生活垃圾與污泥共發(fā)酵提高了沼氣產(chǎn)量和CH4含量。Wang 等[17]觀察到，共發(fā)酵過(guò)程中，果蔬廢物的比例增加5 %，CH4的產(chǎn)量增加22.4 %。Masebinu等[18]利用兩相半連續(xù)厭氧發(fā)酵法研究果蔬廢物最佳配比，結(jié)果發(fā)現(xiàn)果蔬廢物在2.2∶2.8的比例下厭氧發(fā)酵工藝運(yùn)行非常穩(wěn)定，平均CH4含量達(dá)57.58 %。董曉瑩等[19]利用兩相厭氧發(fā)酵反應(yīng)器研究了蔬菜廢物產(chǎn)沼氣情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)酸化相乙酸濃度可達(dá)66.58 %，甲烷相的甲烷產(chǎn)量可達(dá)0.36 m3·kg-1(VS)，工藝運(yùn)行穩(wěn)定。

目前多數(shù)實(shí)驗(yàn)采用多種果蔬廢物為原料進(jìn)行沼氣潛力分析，但以某一種蔬菜廢物渣汁的混合物為原料的研究目前鮮有報(bào)道。為了實(shí)現(xiàn)蔬菜廢物的充分利用以及對(duì)蔬菜廢物厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣有更深的了解，本研究利用白菜廢物渣汁的混合物為原料，在高溫條件下研究蔬菜渣汁混合，以及利用靜置12 h后的上層白菜廢汁和水補(bǔ)充發(fā)酵料液體積對(duì)蔬菜廢物厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣并通過(guò)小試放大及微生物群落結(jié)構(gòu)研究確定最佳工藝參數(shù)在工程應(yīng)用上的可行性，為蔬菜廢物厭氧發(fā)酵工業(yè)和市場(chǎng)化應(yīng)用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 原料與預(yù)處理

實(shí)驗(yàn)原料取自周邊菜市場(chǎng)的白菜廢物，白菜廢物經(jīng)過(guò)粉碎后，用濾布將白菜汁擠出，白菜渣的含水率控制為90.02 %，白菜渣粒徑為20目，放置在–20 ℃冰箱備用。白菜汁靜置12 h，將上層白菜汁和下層白菜汁分離，分別置于4 ℃冰箱備用。本實(shí)驗(yàn)的底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)控制為3 %，白菜渣和下層白菜汁按質(zhì)量比為1∶1混合。接種物取自云南大學(xué)長(zhǎng)期正常穩(wěn)定運(yùn)行的污水處理站活性污泥，并自行馴化6個(gè)月的活性污泥為接種物。白菜渣汁混合廢物和接種物的理化性質(zhì)見(jiàn)表1。

表1 白菜渣汁混合廢物和接種物的理化性質(zhì)

1.2 實(shí)驗(yàn)裝置

實(shí)驗(yàn)裝置為實(shí)驗(yàn)室自主研發(fā)的厭氧發(fā)酵裝置，批量式沼氣發(fā)酵實(shí)驗(yàn)裝置如圖1所示。發(fā)酵溫度為55 ℃，厭氧發(fā)酵在發(fā)酵瓶中進(jìn)行，通過(guò)排水集氣法，將產(chǎn)生的沼氣通過(guò)導(dǎo)氣管進(jìn)入集氣瓶，由于壓強(qiáng)的增大，集氣瓶中被壓至量筒內(nèi)，讀取量筒內(nèi)水的體積即為產(chǎn)生沼氣的體積。其小試放大實(shí)驗(yàn)選用課題組自行設(shè)計(jì)的100 L發(fā)酵罐進(jìn)行，裝置見(jiàn)圖2。發(fā)酵罐采用臥式放置，與水平面成30°。氣體采用下進(jìn)上出的方式，沼氣從上端排出至氣體流量計(jì)，以此記錄每天的產(chǎn)氣量，后進(jìn)入儲(chǔ)氣囊儲(chǔ)存。實(shí)驗(yàn)開(kāi)始前皆采用壓強(qiáng)法對(duì)裝置進(jìn)行密封性檢驗(yàn)。

1.出氣管；2.開(kāi)關(guān)；3.取樣器；4.導(dǎo)氣管；5.橡皮管；6.導(dǎo)水管；7.橡膠塞；8.加熱器；9.水槽；10.溫控儀。

Figure 1 Batch constant temperature anaerobic fermentation device

1.3 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

白菜渣汁混合厭氧發(fā)酵實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)：每組實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)3個(gè)平行實(shí)驗(yàn)，每組實(shí)驗(yàn)的接種量均為發(fā)酵料液的30 %，即120 mL接種物。設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)組1，2以渣汁混合為原料，是否加入上層汁液為變量，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)組3，4，以白菜渣為原料，是否加入上層汁液為變量，設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn)組5、6以下層白菜汁為原料，是否加入上層汁液為變量，實(shí)驗(yàn)探究以白菜廢物為原料在高溫條件下蔬菜渣汁混合的最佳比例及上層白菜汁是否能代替水進(jìn)行沼氣發(fā)酵實(shí)驗(yàn)為目的。具體實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)如表2。

1.顯示器；2.加熱器；3.發(fā)酵罐；4.進(jìn)料口；5.開(kāi)關(guān)閥；6.出氣管；7.取氣口；8.取氣器；9.氣體流量計(jì)；10.儲(chǔ)氣囊；11.出料口；12.電動(dòng)機(jī)；13.攪拌鏈條；14.進(jìn)氣管。

Figure 2 Simulated engineering anaerobic fermentation experiment device diagram

表2 白菜渣汁混合厭氧發(fā)酵實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

通過(guò)對(duì)比實(shí)驗(yàn)，選擇最好的實(shí)驗(yàn)條件利用100 L的發(fā)酵罐進(jìn)行蔬菜廢物厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣的小試放大實(shí)驗(yàn)研究，攪拌方式設(shè)計(jì)為連續(xù)攪拌（每天24 h攪拌）下，取不同發(fā)酵階段的樣品，經(jīng)離心后于-80 ℃冰箱內(nèi)保存，后送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序。

1.4 測(cè)定項(xiàng)目及方法

總固體含量（TS）測(cè)定采用烘干法，在真空干燥箱中（105±1）℃的條件下烘4～6 h。揮發(fā)性固體含量（VS）測(cè)定烘干法，將TS測(cè)定后的樣品在馬弗爐（550±1）℃的條件下烘2 h。日產(chǎn)氣量采用排水集氣法進(jìn)出測(cè)定，100 L發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)產(chǎn)氣量通過(guò)濕式氣體流量計(jì)測(cè)定。CH4含量采用福立GC9790Ⅱ氣相色譜儀測(cè)定，色譜儀配備TDX-01型不銹鋼填充柱。色譜條件：柱箱溫度105 ℃；檢測(cè)器溫度140 ℃；進(jìn)樣器溫度110 ℃；載氣為氮?dú)?，流速?0 mL·min-1。每2 d取一次氣體樣品進(jìn)行CH4含量測(cè)定。

2 結(jié)果與分析

2.1 白菜渣汁混合各實(shí)驗(yàn)組發(fā)酵TS、VS降解率分析

白菜渣汁混合厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣的各實(shí)驗(yàn)組TS、VS降解率及發(fā)酵前后的pH變化如表3和圖3所示。

由圖3和表3可知，加入上層白菜汁的實(shí)驗(yàn)組（實(shí)驗(yàn)組2、4、6）TS、VS降解率和pH均明顯小于未加入上層白菜汁的實(shí)驗(yàn)組（實(shí)驗(yàn)組1、3、5），可以得出上層白菜汁偏酸，發(fā)酵體系提前酸化，發(fā)酵反應(yīng)器處于酸化狀態(tài)導(dǎo)致發(fā)酵失衡，不利于厭氧發(fā)酵的降解和利用。未加入上層白菜汁的實(shí)驗(yàn)組1、3、5中，實(shí)驗(yàn)組3的TS和VS降解率較高，且其pH值在產(chǎn)甲烷菌的最佳pH的范圍內(nèi)，表明白菜渣單獨(dú)發(fā)酵更有利于厭氧發(fā)酵的進(jìn)行。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明用上層白菜汁代替水混合料液不利于蔬菜廢物厭氧發(fā)酵的降解和利用，所以在生產(chǎn)運(yùn)用中，建議用水補(bǔ)充發(fā)酵系統(tǒng)內(nèi)料液的體積。用水補(bǔ)充發(fā)酵料液以及含水率較低的蔬菜渣較適用于蔬菜廢棄物厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣的工程應(yīng)用，含水率越低，產(chǎn)沼氣性越好。

表3 白菜渣汁混合厭氧發(fā)酵前后pH變化

圖3 白菜渣汁混合厭氧發(fā)酵前后降解率

Figure 3 Degradation rate of cabbage residue juice before and after mixed anaerobic fermentation

圖4 白菜渣汁混合發(fā)酵每日產(chǎn)氣量變化曲線

Figure 4 Change curve of gas yield per day in mixed fermentation of cabbage residue juice

2.2 白菜渣汁混合厭氧發(fā)酵的每日產(chǎn)氣量

白菜渣汁混合厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣的每日產(chǎn)氣量變化曲線如圖4所示。

由圖4可知，各實(shí)驗(yàn)組在發(fā)酵開(kāi)始的第1天就開(kāi)始迅速產(chǎn)生沼氣，猜測(cè)是由于適應(yīng)性較好的細(xì)菌群落相對(duì)豐富，從而縮短了代謝周期。由于實(shí)驗(yàn)組3的白菜渣易獲得可溶性有機(jī)物，所以與其他實(shí)驗(yàn)組相比，實(shí)驗(yàn)啟動(dòng)的天數(shù)最少。在實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組3中皆有兩個(gè)日產(chǎn)氣高峰，不同的是實(shí)驗(yàn)組3達(dá)第2個(gè)日產(chǎn)氣高峰的時(shí)間較實(shí)驗(yàn)組1提前，且日產(chǎn)氣高峰值比實(shí)驗(yàn)組1高。而實(shí)驗(yàn)組2、4、5、6在第5天后的日產(chǎn)氣量基本維持在100 mL以下，未出現(xiàn)第2個(gè)產(chǎn)氣高峰，推測(cè)出現(xiàn)該現(xiàn)象的原因有兩個(gè)，一是靜置12 h后的上層白菜汁的pH值較低，使發(fā)酵反應(yīng)器酸化從而未能正常過(guò)渡到產(chǎn)甲烷階段，二是靜置12 h后的下層白菜汁中可供微生物利用的有機(jī)物較少。實(shí)驗(yàn)組2、4、5、6的日產(chǎn)氣高峰值分別為780 mL、1 075 mL、600 mL和900 mL；實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組3的第一日產(chǎn)氣量高峰值分別為645 mL、490 mL，第2個(gè)日產(chǎn)氣高峰值分別為325 mL和525 mL，可以看出，白菜渣汁混合發(fā)酵不如蔬菜渣單獨(dú)發(fā)酵的產(chǎn)沼氣效果好，這也說(shuō)明，在用蔬菜廢物進(jìn)行厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣時(shí)，含水率越低越有利于提高沼氣的產(chǎn)量。

圖5 白菜渣汁混合厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣的累積總產(chǎn)氣量變化曲線

Figure 5 Change curve of cumulative total gas yield of biogas produced by mixed anaerobic fermentation of cabbage residue juice

表4 微生物取樣時(shí)間和樣品編號(hào)

2.3 白菜渣汁混合厭氧發(fā)酵的累積總產(chǎn)氣量

白菜渣汁混合厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣的累積總產(chǎn)氣量變化曲線如圖5所示。

由圖5可知，在實(shí)驗(yàn)結(jié)束時(shí)，實(shí)驗(yàn)組1、2、4、5和6的累積總產(chǎn)氣量分別為2 839 mL、2 790 mL、2 535 mL、2 080 mL和2 056 mL。而實(shí)驗(yàn)組3的累積總產(chǎn)氣量為3 390 mL分別是其他實(shí)驗(yàn)組的1.19、1.22、1.34、1.63和1.65倍。從圖中可以看出實(shí)驗(yàn)組2、4、5和6在發(fā)酵的前5天累積總產(chǎn)氣量上升的迅速，說(shuō)明累積總產(chǎn)氣量加速期在發(fā)酵開(kāi)始后的5 d，對(duì)比實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組3的累計(jì)總產(chǎn)氣量加速期分別集中在第13～17天和第9～14天，由沼氣3階段理論可知實(shí)驗(yàn)組1和實(shí)驗(yàn)組3分別在此時(shí)期處在產(chǎn)甲烷階段，產(chǎn)甲烷菌活性較高，所以產(chǎn)氣量增快。結(jié)合表4，圖3—圖5可以看出，實(shí)驗(yàn)組3的條件更適合蔬菜廢物厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣的進(jìn)行，能夠提高累積總產(chǎn)氣量。

圖6 Rank-Abundance曲線和稀釋曲線

Figure 6 Curve of Rank-Abundance and dilution

表5 Alpha多樣性（OTU水平）

2.4 白菜渣汁在連續(xù)攪拌下高溫厭氧發(fā)酵微生物群落結(jié)構(gòu)研究

從白菜渣汁混合厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣的實(shí)驗(yàn)研究中得到底物質(zhì)量分?jǐn)?shù)為3%，原料粒徑為20目的白菜渣具有較好的沼氣潛力（即使用實(shí)驗(yàn)組3的條件），故利用100 L的發(fā)酵罐進(jìn)行蔬菜廢物厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣的小試放大實(shí)驗(yàn)研究，攪拌方式設(shè)計(jì)為連續(xù)攪拌（每天24 h攪拌）的條件下，取不同發(fā)酵階段的樣品，經(jīng)離心后于-80 ℃冰箱內(nèi)保存，后送至上海美吉生物醫(yī)藥科技有限公司進(jìn)行高通量測(cè)序。具體取樣時(shí)間和樣品編號(hào)見(jiàn)表4。

2.4.1 OTU及稀釋曲線分析 各實(shí)驗(yàn)組的Rank-Abundance曲線和稀釋曲線如圖6所示。

在Rank-Abundance曲線中橫坐標(biāo)代表OTU水平下的物種數(shù)目排序等級(jí)，縱坐標(biāo)表示OTU水平下物種的數(shù)目相對(duì)百分含量，樣本曲線的延伸終點(diǎn)橫坐標(biāo)位置為樣本的物種數(shù)量。曲線下降平滑代表樣本的物種多樣性越高，曲線快速且陡然下降代表樣本中優(yōu)勢(shì)菌群所占比例較高，多樣性較低。由圖6（a）可知LX1—LX6的曲線均是先快速陡然下降后趨于平滑下降的規(guī)律，這說(shuō)明各實(shí)驗(yàn)組先呈現(xiàn)較高比例的優(yōu)勢(shì)菌群，后微生物多樣性逐漸升高。這說(shuō)明菌群在發(fā)酵過(guò)程中大量出現(xiàn)并成為優(yōu)勢(shì)菌群，隨著反應(yīng)的進(jìn)行和原料的消耗優(yōu)勢(shì)菌群達(dá)到高峰后逐漸衰落。由于在厭氧發(fā)酵中原料被微生物利用存在明顯的順序性。通常水溶性物質(zhì)會(huì)首先被利用，此時(shí)水解和利用糖類的微生物會(huì)不斷生長(zhǎng)，隨著原料被分解代謝為乙酸，氫氣和二氧化碳等基質(zhì)，水解和利用糖類的微生物下降，而利用該基質(zhì)的產(chǎn)甲烷菌會(huì)逐漸代替水解菌成為優(yōu)勢(shì)菌群，就呈現(xiàn)出如圖先快速陡然下降后趨于平滑下降的規(guī)律。從圖6（b）可知橫坐標(biāo)代表隨機(jī)抽取的測(cè)序數(shù)據(jù)量；縱坐標(biāo)代表觀測(cè)到的物種數(shù)量（如Sobs）或多樣性指數(shù)（如Shannon指數(shù)），LX1—LX6的稀釋曲線斜率和置信區(qū)間逐漸下降，即稀釋曲線逐漸趨于平緩，說(shuō)明本次的測(cè)序數(shù)據(jù)量足夠。

2.4.2 Alpha多樣性分析 各實(shí)驗(yàn)組的Alpha多樣性結(jié)果如表5所示。由表5可知，不同發(fā)酵階段產(chǎn)甲烷菌群落的Alpha多樣性差異較大，這反映了發(fā)酵過(guò)程中構(gòu)建的生態(tài)反應(yīng)器對(duì)其環(huán)境條件變化的響應(yīng)。隨著發(fā)酵時(shí)間的增長(zhǎng)，產(chǎn)甲烷菌群落的豐富度（Chaol）從一開(kāi)始的明顯下降到后來(lái)的增加，這可能是由于氨氮和有機(jī)酸的積累在發(fā)酵前期抑制了部分水解類微生物的生長(zhǎng)，導(dǎo)致整個(gè)微生物結(jié)構(gòu)的豐富度相對(duì)較低，后期由于有機(jī)酸（主要是乙酸）的積累，有利于乙酸營(yíng)養(yǎng)性產(chǎn)甲烷菌的生長(zhǎng)致使其豐富度提高。從Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)可以看出樣本的物種多樣性。Shannon指數(shù)高物種分布均勻，多樣性更高。各樣品的Good，s coverage均達(dá)到99%以上，說(shuō)明測(cè)序的深度幾乎已經(jīng)能反應(yīng)樣品中所有原核微生物群落信息。

圖7 綱水平物種相對(duì)豐度

Figure 7 Relative abundance at class level

圖8 屬水平物種相對(duì)豐度

Figure 8 Relative abundance at genus level

2.4.3 產(chǎn)甲烷菌群落組成分析 各實(shí)驗(yàn)組微生物群落在綱和屬水平的分類如圖7和圖8所示。

由圖7可知，Illumina測(cè)序在整個(gè)連續(xù)攪拌發(fā)酵周期樣品中檢測(cè)到3個(gè)綱：甲烷菌綱（Methanobacteria）、甲烷微菌綱（Methanomicrobia）、熱原體綱（Thermoplasmata）。古菌群落結(jié)構(gòu)表明，古菌主要以甲烷菌綱（Methanobacteria）和甲烷微菌綱（Methanomicrobia）為主，其相對(duì)豐度在不同發(fā)酵階段樣品間存在差異。由圖8所示，為了進(jìn)一步研究不同發(fā)酵階段微生物群落結(jié)構(gòu)對(duì)甲烷含量的影響，對(duì)屬水平上微生物群落結(jié)構(gòu)分布及組成進(jìn)行了分析。其中，嗜熱彎曲甲烷熱桿菌屬（）是反應(yīng)器中最主要的產(chǎn)甲烷菌，占總菌量的55%～81%。其是嚴(yán)格厭氧嗜熱型產(chǎn)甲烷古菌，主要生存于40～70℃的高溫產(chǎn)甲烷環(huán)境中，可以利用H2/CO2或甲酸鹽生長(zhǎng)，最適生長(zhǎng)pH值為6.0～8.0[20]。嗜熱彎曲甲烷熱桿菌屬除了具有將CO2轉(zhuǎn)化為CH4的能力，其中的一些菌種還可以將乙酸作為生長(zhǎng)因子[21]。因此，乙酸的存在促進(jìn)了嗜熱彎曲甲烷熱桿菌屬的增長(zhǎng)。甲烷八疊球菌屬（）是反應(yīng)器中第二主導(dǎo)的產(chǎn)甲烷菌屬，占總菌量的16%～42%，作為一種具有多種代謝功能的甲烷源甲烷八疊球菌屬（）可通過(guò)3種代謝途徑產(chǎn)生CH4[22]，如利用CO2和H2通過(guò)產(chǎn)氫途徑或利用乙酸鹽作為底物通過(guò)產(chǎn)酸途徑生產(chǎn)CH4；此外，其還可以通過(guò)產(chǎn)甲烷途徑代謝甲醇等甲基化單碳化合物生產(chǎn)CH4[23]。在連續(xù)攪拌發(fā)酵過(guò)程中，甲烷八疊球菌屬（）相對(duì)豐度呈現(xiàn)先增加后降低的趨勢(shì)。此外，在水解和酸化過(guò)程中產(chǎn)生了大量的CO2和H2，甲烷主要由甲烷八疊球菌屬（）通過(guò)氫還原CO2產(chǎn)甲烷途徑和乙酸產(chǎn)甲烷途徑產(chǎn)生合成。這說(shuō)明甲烷八疊球菌屬（）對(duì)連續(xù)發(fā)酵過(guò)程中甲烷的產(chǎn)量起主導(dǎo)作用。甲烷桿菌屬（）在整個(gè)發(fā)酵周期中普遍存在，但它們的相對(duì)豐度較低，僅占0.1%到1.07%。甲烷鬃毛菌屬（）是所有樣品中含量最少的古菌（0%～0.64%），這與Garcia等[24]的報(bào)道一致。據(jù)報(bào)道，在厭氧發(fā)酵過(guò)程中，多達(dá)70%的甲烷形成是由甲烷八疊球菌屬（）引起的，而甲烷八疊球菌屬（）和甲烷鬃毛菌屬（）爭(zhēng)奪同一底物（乙酸）[25-26]。因此，其在發(fā)酵過(guò)程中逐漸消失。

3 討論與結(jié)論

在多數(shù)發(fā)展中國(guó)家每年產(chǎn)生蔬菜廢物占其廢物總量的30%，尤其在韓國(guó)，白菜的年總產(chǎn)量約為300萬(wàn)t，其中30%的白菜也被作為廢物丟棄[27]，故對(duì)白菜廢物發(fā)酵的處理研究就具有重要意義。通過(guò)研究白菜渣汁混合以及用水和靜置12 h后的上層白菜汁補(bǔ)充厭氧發(fā)酵料液對(duì)厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣的影響，分析產(chǎn)沼氣性能，對(duì)其進(jìn)行小試放大實(shí)驗(yàn)并對(duì)其微生物菌落結(jié)構(gòu)進(jìn)行了研究分析，研究發(fā)現(xiàn)含水率為90.02%的白菜渣、含水率為93.05%的白菜渣汁混合物、含水率為96.04%的下層白菜汁為原料進(jìn)行厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣的實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，含水率較低（90.02%）的白菜渣厭氧發(fā)酵TS降解率（56.23%）、VS降解率（61.06%）、日產(chǎn)氣量（525 mL）、甲烷含量（66.19%）、累積總產(chǎn)氣量（3 390 mL）均高于含水率較高的實(shí)驗(yàn)組，且含水率越低，產(chǎn)沼氣性能越好，故在沼氣發(fā)酵過(guò)程中，前處理中物料的脫水，降低原材料的含水率，用烘干或加干物料的方法，以降低沼氣原料處理成本和機(jī)械化水平。選用水補(bǔ)充厭氧發(fā)酵料液的產(chǎn)沼氣特性優(yōu)于用靜置12 h后的上層白菜汁補(bǔ)充的實(shí)驗(yàn)組。且含水率較低（90.02%）的白菜渣及用水補(bǔ)充厭氧發(fā)酵料液的實(shí)驗(yàn)組發(fā)酵前后pH值分別為7.2和7.6，均在產(chǎn)甲烷菌的正常pH范圍內(nèi)。所以用水補(bǔ)充發(fā)酵料液以及含水率較低的白菜渣較適用于蔬菜廢物厭氧發(fā)酵產(chǎn)沼氣的工程應(yīng)用。而后將其進(jìn)行小試放大實(shí)驗(yàn)，在連續(xù)攪拌的條件下，分別取第2、5、8、14、18、24天的樣品進(jìn)行微生物菌落結(jié)構(gòu)研究，在高通量測(cè)序發(fā)現(xiàn)，在綱水平上，古菌主要以甲烷菌綱和甲烷微菌綱為主；在屬水平上，嗜熱彎曲甲烷熱桿菌屬是反應(yīng)器中最主要的產(chǎn)甲烷菌，占總菌量的55%～81%；甲烷八疊球菌屬是反應(yīng)器中第二主導(dǎo)的產(chǎn)甲烷菌屬，占總菌量的16%～42%[28]，在連續(xù)攪拌的過(guò)程中，甲烷主要由甲烷八疊球菌利用CO2和H2通過(guò)還原CO2產(chǎn)甲烷途徑和乙酸產(chǎn)甲烷途徑產(chǎn)生，即甲烷八疊球菌屬對(duì)連續(xù)發(fā)酵過(guò)程中甲烷的產(chǎn)量起主導(dǎo)作用。

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Study on biogas production and microbial community structure by mixed thermophilic anaerobic fermentation of cabbage residue juice

LI Ruifan, CHEN Yubao, WANG JUhua, ZHUANG Shiyun, ZHANG Wenjie, HU Liangdong

(School of Energy and Environmental Science, Yunnan Normal University, Kunming 650500)

In order to explore the effect of mixed vegetable residue and vegetable juice on the potential of biogas production by anaerobic fermentation and to provide reasonable analysis and suggestions for the application of anaerobic fermentation engineering of mixed vegetable residue and juice. In this paper, the batch fermentation method was adopted which the mixture of Chinese cabbage residue and juice was selected as the reaction raw material. The mass fraction of substrate was 3% and the particle size of Chinese cabbage residue was 0.85 mm at high temperature (55±1) ℃. Among them, the TS degradation rate, VS degradation rate, the second daily gas production peak, the highest CH4content and the cumulative total gas production in the experimental group 3 (the amount of 331.66 mL inoculum with 68.34 g water of cabbage residue was 120 mL) were 56.13%, 61.06%, 525 mL, 66.19% and 3 390 mL, respectively, and the pH values before and after fermentation were 7.2 and 7.6, respectively, which were all in the normal pH range of methanogens and the results were better than those of other experimental groups. A small scale-up experiment of continuous stirring anaerobic fermentation to produce biogas was carried out in a 100 L fermentor and the biological community structure was analyzed. It was found that at the class level, the archaea were mainly methanobacteria and methanogens. At the genus level, Campylobacter thermophilus is the main methanogenic bacteria in the reactor (55%-81% of the total bacteria), and methanosarcina is the second dominant methanogenic bacteria (16%-42% of the total bacteria). In the process of continuous stirring, methane is mainly produced by methanosarcina using CO2and H2through the reduction of CO2methanogenic pathway and acetic acid methanogenic pathway, that is,

thermophilic condition; anaerobic fermentation; cabbage residue juice; biogas; microbial community structure

S216.4

A

1672-352X (2021)05-0822-07

methanosarcina plays a leading role in methane production in the continuous stirring experimental group.

10.13610/j.cnki.1672-352x.20211105.007

2021-11-9 8:45:09

[URL] https://kns.cnki.net/kcms/detail/34.1162.s.20211105.1128.014.html

2020-09-18

國(guó)家自然科學(xué)基金項(xiàng)目（21266032），國(guó)家國(guó)際科技合作專項(xiàng)（2015DFA60120），云南省基礎(chǔ)研究計(jì)劃重點(diǎn)項(xiàng)目（2019FA004）和云南省煙草化學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室項(xiàng)目（2019539200340163）共同資助。

李睿帆，碩士研究生。E-mail：1131906019@qq.com

通信作者:陳玉保，博士，副教授，博士生導(dǎo)師。E-mail：c20072007@163.com