寧柳心，郝思國

上海交通大學醫(yī)學院附屬新華醫(yī)院血液科，上海200092

1988 年，一位患范科尼貧血（Fanconi anemia）的5 歲患兒首次應(yīng)用人類白細胞抗原（human leukocyte antigen，HLA）相合的同胞臍血移植獲得成功，患者獲得長期的無病生存［1］，由此拉開了臍血移植（cord blood transplantation，CBT）臨床應(yīng)用的序幕。此后非血緣的CBT 不僅在非惡性血液病患者中被應(yīng)用，而且在惡性血液病患者中也取得了令人滿意的效果。近數(shù)十年來，CBT在全球獲得推廣應(yīng)用。

CBT 不僅來源豐富、采集方便，同時具有病毒污染概率小、供體無風險、可快速獲得、能滿足急需移植患者的需求等優(yōu)點。另外，移植后移植物抗宿主?。╣raft versus host disease，GVHD）特別是慢性GVHD（chronic GVHD，cGVHD）的發(fā)生率低且程度輕。然而，雖然CBT 的GVHD 程度較輕，但其誘導的移植物抗白血?。╣raft-versus-leukemia，GVL）效應(yīng)并不減弱。近年的研究［2］顯示，急性白血病患者接受CBT 后復發(fā)率顯著低于非血緣外周血干細胞移植（peripheral blood stem cell transplantation，PBSCT）。動物模型研究［3］顯示，臍血中的T細胞較外周血T細胞具有更強的抗腫瘤效應(yīng)。在動物模型中，外周血T 細胞所誘導抗腫瘤效應(yīng)與異種反應(yīng)性（xenoreactivity）相關(guān)，而臍血T 細胞的抗腫瘤效應(yīng)則是由同種異體反應(yīng)性（alloreactivity）所誘導。在臍血T細胞處理的動物模型中，腫瘤浸潤淋巴細胞（tumorinfiltrating lymphocytes，TILs）主要為CD8+T 細胞，是抗腫瘤的主要效應(yīng)細胞，CD8+TILs 分泌的細胞因子主要為腫瘤壞死因子-α 和穿孔素，CD4+TILs 主要為輔助性T細胞1；而外周血T 細胞處理的動物模型中，TILs 中CD8+T細胞的比例明顯降低，CD8+TILs分泌的腫瘤壞死因子-α 和穿孔素顯著減少，CD4+TILs 主要為輔助性T 細胞2。這些研究結(jié)果提示臍血T 細胞抗腫瘤效應(yīng)顯著強于外周血T 細胞。但是，由于單份臍血中造血干/祖細胞（hematopoietic stem/progenitor cell，HSPC） 數(shù)目較少，單份臍血所含的有核細胞（total nucleated cell，TNC）數(shù)僅為骨髓移植（bone marrow transplantation，BMT）或PBSCT 的1/20～1/10，導致行CBT 后造血系統(tǒng)和免疫系統(tǒng)重建較BMT或PBSCT明顯延遲，發(fā)生植入失敗、感染及移植相關(guān)并發(fā)癥的風險較大［4］。因此，如何彌補臍血這些不足是提高CBT 治療效果的關(guān)鍵，目前的策略主要有以下4個方面。

1 雙份臍血移植

為了提高臍血的TNC 數(shù)量，20世紀90年代明尼蘇達大學研究小組首先嘗試了雙份臍血移植（double CBT，DCBT） 研究［5］，結(jié)果顯示6 個月的移植相關(guān)死亡率（transplantation related mortality，TRM）為22%，1 年的無病生存（disease free survival，DFS）率為57%，證明了DCBT 的可行性和安全性。但所有DCBT 中只有1 份臍血植活，這份植入的臍血稱為優(yōu)勢植入臍血。同時該研究結(jié)果提示，接受DCBT 的患者表現(xiàn)出快速造血恢復。此外，該研究組于2009 年首次發(fā)表了單份臍血移植（single CBT，SCBT）和DCBT 比較的單中心研究［6］結(jié)果：2組患者中性粒細胞和血小板植入時間相似，植入率也無明顯差異；但是DCBT 組急性GVHD（acute GVHD，aGVHD）和cGVHD 的發(fā)生率顯著高于SCBT 組，而5 年白血病復發(fā)率顯著低于SCBT 組（P=0.04），尤其是急性淋巴細胞白血病患者；2 組患者無白血病生存期（leukemia free survival，LFS） 和 總 體 生 存 期（overall survival， OS） 沒 有 差 異。 歐 洲 臍 血 移 植 協(xié) 作 組（Eurocord）對SCBT 和DCBT 也進行了比較分析，結(jié)果顯示2組移植后非復發(fā)死亡率及白血病復發(fā)率差異均無統(tǒng)計學意義，但是DCBT 組患者的aGVHD 和cGVHD 發(fā)生率顯著高于SCBT 組，而DCBT 組的LFS 顯著優(yōu)于SCBT組［7］。因此，SCBT和DCBT究竟孰優(yōu)孰劣，尚存爭議。

此外，明尼蘇達大學Wagner 教授領(lǐng)銜開展了首個國際多中心SCBT 和DCBT 的隨機對照研究［8］。結(jié)果顯示，DCBT 組和SCBT 組患者1 年總體生存率分別為65%和73%（P=0.17），而且2 組移植患者的DFS、中性粒細胞植入時間、TRM、移植后疾病復發(fā)率、免疫重建時間、Ⅱ～Ⅳ度aGVHD 以及感染發(fā)生率等差異均無統(tǒng)計學意義；不過有趣的是，SCBT 組血小板的植入更快，Ⅲ、Ⅳ度aGVHD 以及廣泛型cGVHD 的發(fā)生率更低。為了驗證這一發(fā)現(xiàn)，法國Michel 等［9］也進行了一項多中心的隨機對照研究，研究包括數(shù)據(jù)完整的患者137 例，其中SCBT 組68 例、DCBT 組69 例。結(jié)果顯示，DCBT 組在中性粒細胞和血小板植入時間、OS、DFS 方面顯示出略微優(yōu)勢，但與SCBT 組相比差異均無統(tǒng)計學意義；2 組患者的移植后復發(fā)率無明顯差異，但DCBT組的復發(fā)時間較SCBT組顯著延遲（P=0.04），DCBT組的中位復發(fā)時間為282.4 d，而SCBT 組為164.9 d。同時亞組分析顯示，在應(yīng)用含氟達拉濱、環(huán)磷酰胺聯(lián)合全身照射預(yù)處理的患者中，DCBT的復發(fā)率（7.1%）低于SCBT（21.9%，P=0.05）；2 組的GVHD 發(fā)生率無顯著差異，不過DCBT 組廣泛型cGVHD的發(fā)生率高于SCBT組。

2 臍血HSPC體外擴增

體外擴增是解決臍血HSPC數(shù)量不足的重要策略，多年來血液學家一直致力于臍血HSPC體外擴增的研究。但擴增的難題主要在于增加TNC 數(shù)量的同時，HSPC 也不可避免地發(fā)生了分化，導致擴增產(chǎn)物中較為原始的HSPC數(shù)量較少，從而影響擴增產(chǎn)物的植入。因此，如何在擴增HSPC 數(shù)量的同時避免HSPC 的過度分化是提高臍血HSPC 擴增質(zhì)量的關(guān)鍵。目前，優(yōu)化臍血HSPC 體外擴增的方式主要有以下5個方面。

2.1 含Notch配體的擴增體系

Notch 信號通路是重要的信號轉(zhuǎn)導通路之一，Notch配體可通過結(jié)合HSPC 表面的Notch 1～4 調(diào)節(jié)其生長和增殖過程［10］。在純化的CD34+細胞中加入重組的Notch 配體Delta 1，與干細胞因子、白介素-3、白介素-6、血小板生成素和Fms 樣酪氨酸激酶3 配體（Fms-related tyrosine kinase 3 ligand， FLT-3L）共同培養(yǎng)16 d，CD34+細胞平均擴增倍數(shù)可達222 倍［11］。應(yīng)用此擴增體系進行首次臨床試驗，對10 位患者進行DCBT，將其中一份臍血的CD34+細胞分離并進行體外擴增，另一份臍血未經(jīng)處理；在未經(jīng)處理的臍血輸注4 h 后，輸注擴增的CD34+細胞。結(jié)果顯示，患者的中性粒細胞和血小板植入的中位時間分別為16 d和26 d，但3個月后外周血嵌合度分析結(jié)果表明維持造血功能的細胞大多來源于未經(jīng)處理的臍血，提示擴增的臍血細胞可以促進臍血的早期植入，但擴增的細胞主要為較晚期的HSPC［11］。

2.2 含銅螯合劑的擴增體系

銅離子作為多種細胞酶的輔助因子，在細胞增殖和分化過程中發(fā)揮重要作用。高親和力銅螯合劑四乙基五胺（TEPA）能夠抑制細胞因子驅(qū)動的早期HSPC 分化，可在不影響HSPC分化能力的前提下增加其自我更新的能力。研究［12］證實，使用TEPA 處理臍血HSPC 后，可增強其長期擴增潛能。TEPA 通過降低細胞內(nèi)銅離子濃度，延遲HSPC 分化，提高擴增產(chǎn)物中原始的HSPC 含量和增殖活性從而促進臍血植入［13］。一項大規(guī)模多中心的臨床研究［14］采用經(jīng)特殊處理的SCBT 治療惡性血液病患者101 例，移植結(jié)果與同期接受DCBT 的295 例患者進行了比較。SCBT 中的部分臍血（20%～50%） 使用含有TEPA、FLT-3L、白介素-6、血小板生成素和干細胞因子的培養(yǎng)體系擴增培養(yǎng)3 周后進行移植，結(jié)果顯示中位TNC 數(shù)和CD34+細胞分別擴增至原先的400 倍和77 倍，CD34+細胞平均輸注量達9.7×105/kg。中性粒細胞植入時間（21 d vs 28 d，P＜0.000 1）和血小板植入時間（54 d vs 105 d，P=0.008） 與同期DCBT 組相比顯著縮短，100 d的存活率顯著提高（84.2%vs 74.6%，P=0.035），表明用TEPA 聯(lián)合細胞因子進行擴增的臍血可顯著縮短植入時間、改善患者預(yù)后。

2.3 含煙酰胺的擴增體系

煙酰胺（nicotinamide，NAM）是維生素B3 的衍生物、煙酰胺腺嘌呤二核苷酸（nicotinamide adenine dinucleotide，NAD）的前體和NAD 分解酶的有效抑制劑。臨床前研究［15］已證實采用NAM 聯(lián)合細胞因子培養(yǎng)臍血CD34+細胞可使其顯著擴增，并可抑制其在體外過度分化。一項近期的臨床試驗研究［16-17］中，36 例患者采用清髓性預(yù)處理（myeloablative conditioning，MAC）方案后行DCBT，同時輸注一份未經(jīng)處理的臍血和另一份采用NAM 擴增21 d 的臍血。結(jié)果顯示，與國際血液和骨髓移植研究中心統(tǒng)計的行CBT （80% 為DCBT，20% 為SCBT）且臨床特征相近的患者（n=146）的移植結(jié)果相比，接受經(jīng)NAM 擴增處理臍血的患者，中性粒細胞和血小板植入的中位時間分別為11.5 d 和34 d，分別縮短了9.5 d（P＜0.001）和12 d（P＜0.001）。該研究證實了NAM擴增體系用于離體擴增臍血的可行性、安全性和有效性。另一項研究［18］同樣也表明應(yīng)用NAM 擴增體系擴增的臍血移植后中性粒細胞植入更快，感染發(fā)生率更低，100 d內(nèi)住院時間更短。

2.4 含StemRegenin-1的擴增體系

StemRegenin-1（SR1）是一種嘌呤衍生物，通過拮抗HSPC 中高表達的芳烴受體（aryl hydrocarbonreceptor，AHR）調(diào)控造血干細胞的自我更新和增殖［19］。明尼蘇達大學的研究小組［20］報道，用含SR1 的擴增體系培養(yǎng)HSPC 可使CD34+細胞擴增50 倍，提高小鼠移植模型的植入率。Wagner 等［21］報道了一項使用SR1 擴增臍帶血的臨床研究結(jié)果，17 名患者在MAC 后接受了DCBT，在移植前15 d 從細胞數(shù)量較少的臍血中分離出CD34+細胞，用SR1 聯(lián)合FLT-3L、血小板生成素和白介素-6 共同培養(yǎng)，而剩下的CD34-細胞則重新冷凍保存。移植當天，先將另一份未處理的細胞數(shù)量較多的臍血解凍并輸入患者體內(nèi)，4 h 后將擴增后的CD34+細胞和解凍的CD34-細胞一起輸注。結(jié)果顯示，擴增的臍血TNC 數(shù)量中位數(shù)擴增了854 倍，CD34+細胞擴增了330 倍。所有患者均成功植入，擴增的臍血在65%（11/17）的患者中成功植入，并且具有持久的植入（中位隨訪時間272 d），未處理的臍血在剩余6 名患者中成功植入。和歷史對照相比，中性粒細胞（中位天數(shù)：15 d vs 24 d）和血小板（中位天數(shù)：49 d vs 89 d，P=0.001）的植入時間顯著縮短，住院時間亦顯著縮短，并且在aGVHD、TRM 和OS方面無顯著差異。這一研究結(jié)果提示擴增的臍血同樣可以長期植入。

2.5 含間充質(zhì)干細胞的共培養(yǎng)擴增體系

間充質(zhì)干細胞（mesenchymal stem cells，MSCs）是造血微環(huán)境中重要的細胞成分，可通過直接接觸或分泌細胞因子等方式調(diào)控造血細胞的增殖和分化。通過MSCs來模擬體內(nèi)造血環(huán)境，可避免擴增培養(yǎng)中HSPC的過度分化［22］。最近的相關(guān)研究［23-24］發(fā)現(xiàn)臍帶血HSPC 在低氧條件下與MSCs 共培養(yǎng)更能保持其干性。本研究組［25］早在21 世紀初就曾嘗試應(yīng)用MSCs 擴增體系來擴增臍血，含有MSCs 的擴增組在各時間點的TNC 數(shù)均顯著高于對照組，TNC 中CD34+細胞、CD133+細胞、CD34+CD38-細胞以及CD34+CD133+細胞的比例也顯著高于對照組；而且含有MSCs的擴增組各時間點各種祖細胞集落的種植率顯著高于對照組，提示該擴增體系中較為原始的HSPC含量較高。de Lima 等［26］對31 例患者進行了相關(guān)臨床研究，將一份擴增的臍血與另一份未擴增的臍血同時輸注，7位患者MSCs來源于親緣相關(guān)的半相合供體，其余患者接受第三方工業(yè)化生產(chǎn)的MSCs產(chǎn)品。雙份臍血中細胞數(shù)量較少的一份在移植前2 周解凍，與MSCs 共培養(yǎng)，并加入干細胞因子、FLT-3L、血小板生成素和粒細胞集落刺激因子。結(jié)果顯示，CD133+CD33+細胞和CD34+CD38-細胞顯著增加；培養(yǎng)2 周后，TNC 和CD34+細胞分別擴增至12.2 倍和30.1 倍。與未擴增的臍血相比，擴增臍血輸注的TNC和CD34+細胞中位數(shù)量增加了1倍以上。將未處理的臍血在移植當天解凍并輸注，然后輸注擴增的臍血。與歷史對照相比，中性粒細胞和血小板的中位植入時間縮短了1 周或1 周以上，差異均有統(tǒng)計學意義；而aGVHD和cGVHD的發(fā)生率無顯著差異。但移植后6個月時檢測提示僅有13%的患者體內(nèi)存在擴增的臍血，而超過1 年的檢測提示患者體內(nèi)造血細胞均來自未擴增的臍血，提示含MSCs 的擴增體系中HSPC 仍難以維持長期造血，只能維持短期造血重建［27］。

3 促進臍血HSPC的歸巢

CBT 除了通過DCBT 以及離體擴增來解決單份臍血HSPC 數(shù)量不足的問題外，促進臍血HSPC 歸巢也可改善臍血植入［28］。目前該方面的研究主要集中在以下2 個方向。

3.1 骨髓腔內(nèi)直接注射臍血

目前，CBT 通常通過靜脈輸注的方式，但在靜脈輸注的過程中，臍血HSPC易被宿主通過多種機制扣留，導致歸巢至骨髓的有效細胞數(shù)量減少，將臍血直接注射到骨髓腔可以加快HSPC的歸巢［29］。Murata等［30］開展了一項骨髓腔內(nèi)直接注射單份臍血的Ⅱ期臨床研究，共納入21 例惡性血液病患者，沒有觀察到與骨內(nèi)注射有關(guān)的嚴重不良事件，結(jié)果顯示中性粒細胞和血小板植入的中位時間分別為17 d 和32 d，Ⅱ～Ⅳ級和Ⅲ～Ⅳ級aGVHD 的發(fā)生率分別為44%和19%，證明了骨髓腔內(nèi)直接輸注臍血的安全性。此外，Okada 等［31］也開展了相關(guān)臨床研究，共納入40 例血液系統(tǒng)惡性腫瘤患者，在局部麻醉后分別將臍血注射到髂骨的4 個部位（每側(cè)2 個部位），每個部位大約注射6 mL臍血，結(jié)果顯示86.8%的患者獲得植入，中性粒細胞和血小板植入的累積發(fā)生率分別為86.4%和85.5%，植入的中位時間分別為17.5 d 和44 d，重度aGVHD 的發(fā)生率為47.5%，廣泛型cGVHD 的累積發(fā)生率為3%，這些結(jié)果表明骨髓腔內(nèi)直接注射臍血可改善造血系統(tǒng)重建并降低cGVHD 的發(fā)生率。最近，一項前瞻性臨床研究［32］統(tǒng)計了23 例接受單份臍血骨髓腔內(nèi)注射的患者，結(jié)果顯示注射后28 d 中性粒細胞植入的累積發(fā)生率為（77.3±9.0）%，90 d 中性粒細胞＞0.5×109/L 和血小板＞50×109/L 的累 積發(fā)生率分別為（82±9）%和（70±10）%，所有患者均未出現(xiàn)嚴重的aGVHD。該研究進一步證明了骨髓腔內(nèi)注射臍血移植是可行的，可以促進血液系統(tǒng)造血功能的恢復；同時證明了將臍血干細胞直接輸注到缺氧的造血干細胞壁龕中有助于保留其干性。

3.2 前列腺素E2的應(yīng)用

前列腺素E2（prostaglandin E2，PGE2）具有刺激多系祖細胞增殖和歸巢的潛能。由于PGE2的半衰期短（1～2 min），在體外研究和臨床研究中常使用PGE2 的穩(wěn)定修飾物16，16-二甲基前列腺素E2（16，16-dimethyl-PGE2，dmPGE2）。dmPGE2可在體內(nèi)增加HSPC 數(shù)量而不影響其自我更新和分化潛能［33］。

這是通過調(diào)控HSPC 增殖和分化相關(guān)的Wnt/β-catenin信號通路實現(xiàn)的［34］。Cutler等［35］對12名接受DCBT的患者進行了Ⅰ期臨床試驗，旨在評估使用dmPGE2 離體處理單份臍血的安全性和治療效果。將細胞數(shù)量較多的一份臍血與10 μmol/L dmPGE2 在37 ℃下一起培養(yǎng)2 h 后輸注給患者，另一份未經(jīng)處理的臍血在4 h 后輸注。結(jié)果顯示中性粒細胞植入的中位時間為17.5 d，短于歷史對照的21 d（P=0.045）。此外，12 名患者中的10 名患者獲得處理臍血的長期植入，推測dmPGE2促進HSPC 歸巢的作用可能加速其植入，盡管可能也與dmPGE2 處理的臍帶血細胞數(shù)量較多有關(guān)。

4 第三方HSPC的應(yīng)用

應(yīng)用第三方HSPC 與臍血聯(lián)合移植（haplo-cord transplant）可能會加快臍血的植入。van Besien 等［36］在一項回顧性研究中比較了97 例接受單倍體干細胞聯(lián)合SCBT 和193 例接受DCBT 的惡性血液病患者，結(jié)果顯示前一組患者中性粒細胞和血小板植入更快，Ⅱ～Ⅳ級aGVHD 和cGVHD 發(fā)生率更低，復發(fā)率和無GVHD、無復發(fā)生存（GVHD-free relapse-free survival，GRFS）率也更低，差異均具有統(tǒng)計學意義。同時，單倍體干細胞聯(lián)合CBT 對缺少HLA 匹配供者的患者而言也是一種較容易獲得的移植物來源。此外，有研究［37］報道了42 例單倍體干細胞聯(lián)合CBT 治療高危惡性血液病的患者，結(jié)果顯示中性粒細胞植入的中位時間為11 d，血小板植入的中位時間為19.5 d，1 年非復發(fā)死亡率為19%，3 年GRFS 率、無進展生存率和總體生存率分別為53%、62%和65%，中位隨訪42 個月，與van Besien 等［36］的研究結(jié)果一致，表明接受單倍體干細胞聯(lián)合CBT 的患者在造血系統(tǒng)重建和GVHD的發(fā)生率方面均優(yōu)于DCBT組。

5 小結(jié)和展望

多種改善臍血植入的策略在基礎(chǔ)研究和臨床試驗中均取得了可喜的成績，但這些改進措施尚不夠完善，其中許多機制尚不明確，仍有待于不斷改進以及開發(fā)更多更新的方法。隨著臍血體外擴增、促進歸巢等技術(shù)的研究和應(yīng)用，CBT 在惡性及非惡性血液病的治療中將會有更廣闊的應(yīng)用前景。