朱志浩，高家明，沈君顏，祝建波，劉海亮,*

(1 新疆植物藥資源利用教育部重點實驗室/石河子大學生命科學學院，新疆 石河子 832003； 2 同濟大學醫(yī)學院/附屬東方醫(yī)院再生醫(yī)學研究所，上海 200123)

間充質干細胞的組織來源骨髓基質細胞最初在骨髓基質中被發(fā)現(xiàn)后，間充質干細胞已經(jīng)從幾個成人和胎兒組織中分離和鑒定，包括脂肪，真皮(皮膚)，滑膜液，骨膜，臍帶血，胎盤和羊水。脂肪間充質干細胞的發(fā)現(xiàn)給生命科學帶來劃時代的改變，充分利用脂肪間充質干細胞的分化潛能在臨床醫(yī)學應用，治愈重大疾病，如腦血栓、心肌梗死、糖尿病等。它可以分化成這些壞死的細胞，進入這些器官，行使和死亡細胞一樣的功能，徹底治愈這類疾[1-4]。并且它也可以分化成這些器官的年輕細胞，替代器官內(nèi)衰老的細胞，將分化后的年輕細胞植入該器官并成活后，進而替代功能衰竭或者損毀的器官，如腎損傷，肝壞死，心臟的衰竭，從而延緩衰老。

干細胞凍存是研究干細胞生物學功能的重要方法之一，凍存劑的選擇起到了關鍵性的作用。目前細胞凍存劑主要有兩種類型：一種是滲透性保護劑包括：甘油、二甲基亞砜(DMSO)、乙二醇(EG)、丙二醇(PG)、甘油(GLY)。其原理屬低分子中性物質，易與溶液中水分子結合，易于穿透細胞；另一種是非滲透性保護劑：聚乙烯吡咯烷酮(PVP)，蔗糖、聚乙二醇、葡聚糖、白蛋白等。其原理屬大分子物質，不能穿透細胞；在冰晶形成之前，優(yōu)先結合溶液中水分子；降低細胞外溶液的電解質濃度，減少陽離子進入細胞的數(shù)量。已有較多研究對多種凍存劑進行了分析，雖然DMSO在毒性方面要大于EG，PG，GLY，但是其凍存效果仍然較好。DMSO與PVP凍存效果相似。近年來，相對于傳統(tǒng)的凍存劑(DMSO，GLY，Tre)，左旋肉堿(L-carnitine)、海藻糖(Trehalose)也顯示出比較好的凍存效果，在細胞毒性方面，也顯示出較大的優(yōu)勢[5-8]。

目前，在干細胞廣泛研究和應用的基礎上，建立臨床級間充質干細胞標準制備工藝技術和干細胞庫就顯得尤為重要。臨床級干細胞，就再生醫(yī)學而言，可以隨時投入臨床使用的干細胞，即可用于人類的臨床研究，制備標準嚴格，具有“臨床級”質量，不需要昂貴而又危險的轉換過程。臨床級干細胞的提供途徑消除了基于細胞的療法發(fā)展的重大障礙，而且臨床級干細胞的分離與擴增是干細胞產(chǎn)業(yè)化過程中的重要環(huán)節(jié)。標準化，產(chǎn)業(yè)化的干細胞生產(chǎn)，這意味著每批細胞都符合臨床使用所需的質量和安全標準。標準化能更快地為患者提供救生療法[9-12]。因此，開發(fā)標準性干細胞分離純化和保藏的新技術是進一步推動干細胞臨床應用的必然趨勢。從而更能實現(xiàn)干細胞治療產(chǎn)品生產(chǎn)的標準化、規(guī)?；\行，質量達到臨床應用標準。經(jīng)過綜合分析，本研究重點分析DMSO、 L-carnitine和Trehalose這3種凍存劑凍存脂肪間充質干細胞的效果與能力。

1 材料與方法

1.1 材料

DMEM/F12(Thermo)，NEAA (non-essential amino acids)，胎牛血清(FBS)，0.25% 胰蛋白酶-EDTA(Sigma公司)，海藻糖(上海國藥)，肉毒堿(美國AMRESCO公司)，地塞米松(Sigma公司)，維生素C(Sigma 公司)，硫代甘油(Sigma 公司)，成骨誘導分化培養(yǎng)基(CYAGEN)，CCK-8試劑，油紅O染液，脂肪干細胞，神經(jīng)干細胞，293細胞。

細胞培養(yǎng)箱(Heraeus)，超凈工作臺(Forma Scientific Inc)，倒置顯微鏡(OLYMPUS公司)，光學顯微鏡(OLYMPUS公司)，低溫離心機(Heraeus儀器公司)，-80 ℃冰箱(Forma Scientific 公司)，液氮罐，流式細胞儀(美國Beckmen Coulter 公司)，酶標儀。細胞培養(yǎng)瓶(美國Corning)：T25，T75；細胞培養(yǎng)板(美國 Corning)：6，12，24孔；細胞培養(yǎng)皿：10 cm2；移液管(美國Forma)：5 mL，10 mL；離心管：15 mL；凍存管：1.8 mL；酶標板：平底96孔透明酶標板。

1.2 細胞凍存

配制各種細胞凍存液。取對數(shù)生長期的細胞，去除舊培養(yǎng)基，用PBS清洗。去除PBS，加入適量胰蛋白酶(覆蓋培養(yǎng)皿表面)把單層生長的細胞消化下來。1 500 r·min-1，離心5 min。去除胰蛋白酶，加入適量配制好的凍存培養(yǎng)液，用吸管輕輕吹打混勻，計數(shù)，調節(jié)凍存液中細胞的最終密度[13-15]。一般為5×106或1×107個·mL-1。將細胞分裝于凍存管中，每管1 mL。在凍存管管中標明細胞的名稱，凍存時間及操作者。也可將凍存管放入4 ℃，2h，-80 ℃，過夜，放入液氮中。

1.3 細胞復蘇

從液氮容器中取出凍存管，直接浸入37 ℃溫水中，并不時搖動令其盡快融化。從37 ℃水浴鍋中取出凍存管，打開蓋子，用吸管吸出細胞懸液，加到離心管并滴加10倍以上培養(yǎng)液，混勻。離心，1 500 r·min-1，離心5 min。棄去上清，加入新鮮培養(yǎng)液重懸細胞，計數(shù)，調整細胞密度，接種于培養(yǎng)瓶中，37 ℃培養(yǎng)箱靜置培養(yǎng)。

1.4 間充質干細胞活性檢測

細胞活力測定，對凍存1、3、7 d的ADSC，在復蘇后24 h和48 h進行細胞活性檢測，分析不同凍存劑凍存時間長短和復蘇后不同時間的細胞活性。CCK-8檢測步驟。向各孔中加入100 μL細胞懸液，向各孔中加入各濃度的待測溶液10 μL，在37 ℃下孵育培養(yǎng)板。向各孔中加入10 μL的CCK-8溶液，37 ℃孵育1～4 h，測定450 nm處的OD值。

1.5 細胞周期檢測

收集復蘇后的特定傳代ADSC細胞，細胞個數(shù)為1×106個。離心棄上清，加入300 μL預冷的PBS制成單細胞懸液。加入700 μL預冷的無水乙醇固定，-20 ℃放置待測。上機檢測前加入PBS稀釋細胞，離心棄上清，加入終濃度500 μg·mL-1的。RnaseA置于37 ℃孵育30 min。加入終濃度50 μg/mL的碘化丙啶，4 ℃避光孵育30 min。流式細胞儀檢測細胞DNA含量，軟件分析。

1.6 成骨誘導

取特定代次生長良好的ADSC細胞，胰酶消化，1×105個·mL-1的濃度接種于6孔板，用完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，更換成骨誘導培養(yǎng)基。每3天換一次液，以未加誘導培養(yǎng)基的細胞培養(yǎng)孔作空白對照，共誘導培養(yǎng)基28 d。誘導期間用倒置顯微鏡觀察細胞形態(tài)的變化，并拍照記錄。取成骨誘導培養(yǎng)基誘導14 d和28 d后的細胞進行茜素紅染色。

1.7 RNA提取及RNA-seq分析

使用TRIzol(Invitrogen，Carlsbad，CA，USA)從凍存前和凍存后的ADSC細胞中提取總RNA，并用NanoDrop 1000(Thermo Fisher Scientific)進行定量。將符合質量標準(260/280 nm> 1.8)的樣品進行后續(xù)實驗。測序數(shù)據(jù)分析均基于高質量的數(shù)據(jù)，使用Bowtie v2.0.6(bowtie-bio.sourceforge.net/bowtie2)軟件構建參考基因組的索引，并使用TopHat v2.0.9(ccb.jhu.edu/software/tophat)軟件將配對末端的干凈讀數(shù)與參考基因組對齊?；诨蜷L度和映射到該基因的讀數(shù)計數(shù)，并考慮測序深度和基因長度對讀數(shù)計數(shù)的影響，計算出每千個轉錄本的讀數(shù)，每個基因的百萬個圖譜讀數(shù)(RPKM)。差異基因通過權重基因共表達網(wǎng)絡分析(WGCNA)計算，畫圖[16-18]。

1.8 統(tǒng)計分析

通過單因素方差分析確定，*表示P<0.05，**表示P<0.01，***表示P<0.001。

2 結果與分析

2.1 細胞活性檢測

本實驗采用3種凍存劑，六組實驗；1號，5% DMSO+10% FBS；2號，5% DMSO；3號，5% Trehalose+10%FBS；4號，5% Trehalose；5號，5% L-carnitine+10% FBS；6號，5% L-carnitine；分別凍存ADSC，實驗中發(fā)現(xiàn)，4號和6號凍存ADSC后，細胞死亡率很大，無法進行后續(xù)實驗，因此后續(xù)實驗只對1號，2號，3號和5號進行。在ADSC凍存1、3、7 d后復蘇。培養(yǎng)24 h后，檢測細胞活性。

結果如圖1所示：1號實驗組細胞活性最高，在凍存1、3、7 d復蘇后，其均值分別為0.413 3、0.265 5和0.218 4，隨著凍存時間的增加呈現(xiàn)出逐漸下降趨勢；2號實驗組在凍存1、3、7 d復蘇后其細胞活性均值分別為0.152 9、0.201 6和0.283 1，并隨時間表現(xiàn)出逐漸上升的趨勢；在3號實驗組中，細胞凍存1 d和3 d后細胞活性并沒有表現(xiàn)出很大差別，而在凍存7 d復蘇后細胞活性略有上升；5號實驗組中，細胞活性雖時間表現(xiàn)出先上升后下降的趨勢，在凍存1 d復蘇后，其細胞活性為0.153 9，凍存3 d復蘇后，細胞活性為0.167 7，凍存7 d后為0.148 7。

總體變化不大。復蘇后培養(yǎng)48 h細胞活性與24 h具有相似的特點(圖1)。

以上結果表明，1號實驗組在細胞凍存復蘇24 h后具有最高活性，說明1號實驗組為該實驗條件下的最佳凍存劑組合。與1號實驗組相比，2號實驗組ADSC細胞在凍存1 d和3 d，復蘇后其活性顯著的低于1號實驗組。當凍存時間延長至7 d時，2號實驗組的細胞活性顯著上升且明顯高于1號實驗組，這一現(xiàn)象表明在進行長時間的凍存時，F(xiàn)BS可能會對細胞活性產(chǎn)生一定的影響。

從實驗結果中不難發(fā)現(xiàn)，在細胞凍存過程中，F(xiàn)BS在對細胞活性的保護中起到了關鍵性作用。FBS是細胞培養(yǎng)中用量最大的天然培養(yǎng)基，含有豐富的細胞生長必須的營養(yǎng)成分。提供結合蛋白，能識別維生素，脂類，金屬和其他激素等，能結合或調變他們所結合的物質活力。但其具體的影響機制仍需進行進一步的探究。

3號實驗組和5號實驗組與1號實驗組相比，其細胞活性要明顯低于1號實驗組。這一實驗結果表明，DMSO在細胞凍存過程中對細胞活性的影響要略低于Trehalos和L-carnitine，DMSO更適合作為ADSC細胞凍存劑在實驗中使用。綜上，5%DMSO+10%FBS為當前實驗條件下最適的凍存劑組合。在同樣的低溫，DMSO條件下，F(xiàn)BS對維持ADSC存活起到了關鍵性作用。

2.2 細胞周期檢測

當凍存劑組合1號為5% DMSO+10% FBS時，對凍存1、3、7 d后復蘇的ADSC進行流式細胞分析，結果如圖2所示，G1期細胞所占比例由凍存1 d的79.85%，到3 d的 75.74%,再到7 d的89.88%。G1含量呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢。

S期，1 d，11.15%,3 d，17.24%，7 d，3.35%。隨凍存天數(shù)的增加，S期總體呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢。當凍存劑為2號5% DMSO時，對凍存1、3、及7 d后復蘇的ADSC進行流式細胞分析，結果如圖2所示，G1期細胞所占比例，1 d，65.78%，3 d，66. 15%，7 d，89.94%。G1期細胞所占比例，隨凍存天數(shù)增加，呈上升趨勢。S期細胞所占比例，1 d，27.38%，3 d，26.34%，7 d，2.9%,S期含量呈下降。

以上結果表明，DMSO試劑對細胞有保護作用，低溫抑制細胞的生長與分化。綜上，1號實驗組與2號實驗組相比，尤其是凍存1 d和3d后，S期，1號數(shù)據(jù)小于2號。分別為10.58%和18.87%。

說明在有FBS情況下，凍存1～3 d，確實影響了ADSC細胞的增值效率。但是凍存7 d后，幾乎沒有差別。

圖2 不同凍存劑凍存ADSC 1、3、 7 d復蘇后細胞周期檢測

當凍存劑為5% Trehalos+10% FBS，對凍存1、3、7 d后復蘇的ADSC進行流式分析(圖3)。在凍存1、3、7 d后，G1含量分別為80.73%，85.58%，93.15%。隨凍存天數(shù)的增加，G1含量總體呈上升趨勢。在凍存1、3、7 d后，S期含量分別為9.93%，11.85%，2.17%。隨凍存天數(shù)的增加，S期含量呈現(xiàn)先上升后下降趨勢。當凍存劑為5% L-carnitine+10% FBS時。凍存1、3、7 d后復蘇，流式細胞分析結果見圖4。凍存1、3、7 d后，G1含量分別為91.55%，78.54%，88.57%。隨凍存天數(shù)的增加，G1含量總體呈下降趨勢(圖4)。在凍存1、3、7 d后，S期含量分別為5.09%，17.74%，3%。隨凍存天數(shù)的增加，S期含量呈現(xiàn)先上升后下降趨勢。

從細胞周期來看，短期(1 d～3 d凍存)，不同凍存劑確實可以引起細胞周期的改變，尤其是對于細胞增殖來說，但是如果凍存時間較長(如7 d)就會大大縮小這個差距，凍存劑之間差別不明顯。并且我們可以看到，凍存劑中包含F(xiàn)BS一定程度上會影響ADSC的增殖(圖2)。

2.3 成骨誘導分析

為了進一步驗證凍存是否會對ADSC的分化潛能有影響，我們進一步選擇1號和2號凍存劑進行ADSC成骨分化，分別凍存1 d和5d后復蘇進行成骨誘導。

從誘導的顏色來看，紅色較深，誘導成骨效果較好。1號凍存劑，凍存1 d后，復蘇細胞誘導成骨細胞較多，出現(xiàn)大量紅色聚集斑塊。凍存5 d后，誘導成骨細胞也較多，兩者效果差別不明顯(圖3A、3B)。而使用2號凍存劑，可以明顯看到，不管是凍存1 d還是5 d，成骨分化的效果較1號凍存劑誘導效果要弱(圖3C、3D)。因此，在同樣的低溫，DMSO條件下，F(xiàn)BS對維持ADSC的分化潛能起到非常關鍵的作用。

A：1號凍存劑，凍存ADSC 1 d 成骨分化；B：1號凍存劑， 凍存ADSC 5 d成骨分化；C：2號凍存劑，凍存ADSC 1 d成骨分化； D：2號凍存劑，凍存ADSC 5 d成骨分化；成骨分化圖片(50 μm)。圖3 1號和2號凍存劑凍存ADSC1d和5 d后復蘇， 誘導成骨分化檢測

2.4 RNA-seq表達譜分析

為了驗證凍存劑在凍存過程中對細胞內(nèi)基因表達的影響，我們又選擇以1號凍存劑：5% DMSO+10% FBS，分別對凍存前和凍存后的ADSC細胞進行了RNA-seq表達譜結合生物信息WGCNA分析，結果表明，在凍存過程中，凍存劑的存在會對細胞的整體表達譜會產(chǎn)生一定的影響(圖4)。但是這個影響是因為凍存產(chǎn)生的還是因為凍存劑的影響產(chǎn)生的，還需要進一步實驗驗證。

總之，這在一定程度上說明，如果是要通過表達譜確定ADSC的相關參數(shù)，一定要選取相同條件的細胞，更為可靠的最好是復蘇后培養(yǎng)一段時間再進行檢測。

ME：Module Eigengenes (基因簇特征向量矩陣)，縱向不同顏色 代表不同的共表達基因簇。圖4 RNA-seq表達譜分析1號凍存劑凍存 ADSC前后基因表達水平

2.4.1 樣品間維恩圖分析

凍存前有811個特異性表達基因，而凍存后有590個特異性表達基因，兩者共有基因數(shù)目為15 287(圖5)。共有基因數(shù)目遠遠高于凍存前后的特異性基因數(shù)目，說明細胞凍存雖然對脂肪干細胞的整體活性具有一定的影響，然而這種影響相對比較小。

圖5 樣品間維恩圖分析

2.4.2 DEG層次聚類分析

根據(jù)各個樣品基因表達水平，我們檢測樣品之間的差異表達基因(DEG)，使用 DEseq2和 PossionDis 方法進行差異檢測。根據(jù)需求，我們對 DEG 進行層次聚類 (圖6)。該圖直觀地反映了差異基因上下調的聚類情況，同時適用于不同差異方案間DEG差異倍數(shù)的比較。

X軸代表進行聚類分析的差異比對，Y軸代表差異基因。 顏色代表log2轉換過的差異倍數(shù)， (顏色越紅代表上調倍數(shù)越大，越藍代表下調倍數(shù)越大)。圖6 DEG層次聚類熱圖

2.4.3 差異表達基因GO功能分析

通過GO富集性分析，低溫凍存對細胞代謝和調控影響最大 (圖7)。整體上，細胞凍存過程對脂肪干細胞的代謝和信號調控過程影響較大。

X軸代表DEG數(shù)目，Y軸代表GO功能分類圖7 差異基因GO功能分類圖

3 討論

科學家們開始意識到了許多重大疾病或特殊生物學現(xiàn)象的發(fā)生機制都可以從干細胞角度從新認識，這意味著臨床上的許多疾病的防止研究可以從干細胞的角度進行，也意味著一些新的防止方法和手段的產(chǎn)生。本實驗從不同凍存劑凍存應用更加廣泛的ADSC細胞后，對其細胞增殖，細胞周期，成骨分化潛能以及基因表達譜的研究，從一定角度了解了ADSC細胞對于不同凍存劑凍存的反應，為后面詳細而細致的研究奠定了基礎[19-20]。

細胞活性檢測結果表明：對照組細胞在凍存后的復蘇效果優(yōu)于實驗組，且不同凍存劑之間的凍存效果也存在一定差異。對照組(5% DMSO+10% FBS)表現(xiàn)出最好的凍存效果，在進行液氮凍存1、3、7 d后，其細胞在復蘇24 h后的活性分別為0.413、0.267和0.218，復蘇48 h后的活性分別為0.532、0.366和0.256，均高于2號(5% DMSO)、3號(5% T+10% FBS)和5號(5% L+10% FBS)實驗組細胞分別在凍存復蘇后的活性。細胞周期檢測結果表明：在進行凍存復蘇之后，處于G1期的細胞所占比例最大，處于G2期的細胞所占比例最小。在對處于S期的細胞進行進一步分析后發(fā)現(xiàn)，在對細胞進行短期凍存后(1～3 d)，2號實驗組中處于S期細胞所占比例最大，分別為27.38%和26.34%，顯著的高于對照組11.15%和17.24%。當凍存時間延長至7 d后，對照組中處于S期的細胞所占比對最大，為3.35%，5號實驗組與對照組效果相似，但略低于對照組，為3%。

在培養(yǎng)液中加入誘導液后，會把間充質干細胞能夠誘導成為成骨細胞，使用油紅O染液染色，誘導成為成骨細胞能夠被染成紅色，紅色越深或者越多，表示被誘導的細胞越多。誘導最多的是凍存劑為5% DMSO+10% FBS下凍存1 d，其次是凍存劑為5% DMSO+10% FBS下凍存5 d，誘導最少的是5% L+10% FBS凍存1 d。轉錄組測序及生物信息學分析結果表明，在經(jīng)過凍存處理之后，脂肪干細胞的基因表達譜發(fā)生變化，說明凍存處理確實會對細胞的基因表達產(chǎn)生影響。本實驗通過檢測不同凍存劑條件下細胞復蘇后的生物學特性，比較了不同凍存劑對細胞活性和細胞周期的影響，并通過表達譜數(shù)據(jù)分析了5% DMSO+10% FBS凍存劑對脂肪干細胞基因表達的影響，深低溫凍存確實對脂肪干細胞的基因表達差生了影響。為充分利用干細胞進行生物組織構建、細胞移植以及其他方面的研究奠定了一定的基礎。

經(jīng)過整體性分析，1號，5% DMSO+10% FBS，為該實驗的最佳凍存劑組合。本實驗雖然嘗試用其它凍存劑來代替DMSO，但是在相同濃度下，它們并沒有表現(xiàn)的比DMSO要好，并不能很好的保護ADSC細胞，因此，在本實驗中出現(xiàn)缺少組的實驗結果，是因為凍存后，細胞就已經(jīng)不能存活或者存活百分比較低，不能進行后續(xù)實驗，后期能否通過改變濃度或者尋找更安全，更有效的凍存劑還需要驗證。