張超杰，仵楠，趙舉紅，齊元莉，祖木熱提古麗·阿不來(lái)提，李朝陽(yáng)，徐江*

(1 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院,新疆 石河子 832000；2 石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院,新疆 石河子 832000； 3 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬腫瘤醫(yī)院，廣東 廣州 510089)

口腔鱗狀細(xì)胞癌(Oral Squamous Cell Carcinoma,OSCC)是頜面部發(fā)病率最高的惡性腫瘤，全球發(fā)病率達(dá)到40萬(wàn)/年，死亡率達(dá)18萬(wàn)/年[1]，近年對(duì)OSCC發(fā)病病因、預(yù)后治療等方面的研究取得進(jìn)展，但患者的5年生存率未明顯改善[2]。因此如何提高OSCC的5年生存率，尋找有效預(yù)測(cè)OSCC患者預(yù)后的因子，識(shí)別新的分子靶點(diǎn)至關(guān)重要。

維甲酸誘導(dǎo)蛋白14(retinoic acid induced protein 14，RAI14)是2000年被Peng YF等[3]研究抗tomosyn抗體時(shí)在大鼠肝臟發(fā)現(xiàn)的RAI14基因編碼的第一個(gè)轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物，是由6個(gè)錨蛋白重復(fù)序列和長(zhǎng)卷曲螺旋域組成，RAI14蛋白通過(guò)此結(jié)構(gòu)域招募多種信號(hào)及蛋白進(jìn)而調(diào)控細(xì)胞骨架[4-5]。RAI14在人體許多組織中都有表達(dá)，參與多種生理和病理過(guò)程，如在人胎盤(pán)和睪丸組織此蛋白高表達(dá)且與細(xì)胞骨架密切相關(guān)[6-7]。而在卵巢癌[8]、前列腺癌[9]、胃癌[10]等腫瘤中RAI14的高表達(dá)與腫瘤的惡性進(jìn)展呈正相關(guān),且與癌細(xì)胞的增殖侵襲密切相關(guān)[11]。目前國(guó)內(nèi)外研究中關(guān)于RAI14在OSCC中的表達(dá)水平和臨床意義的報(bào)道較少，本研究利用免疫組織化學(xué)檢測(cè)分析RAI14在OSCC、癌旁和正常口腔黏膜組織表達(dá)水平，并探究RAI14與OSCC患者臨床病理特征及預(yù)后的關(guān)系，進(jìn)一步探討RAI14在OSCC發(fā)生、發(fā)展及轉(zhuǎn)移中的作用。

1 材料與方法

1.1 標(biāo)本及數(shù)據(jù)來(lái)源

收集2009年—2020年在石河子大學(xué)醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院經(jīng)組織病理確診為OSCC石蠟組織標(biāo)本152例、癌旁組織90例和正?？谇火つそM織25例。收集OSCC患者的詳細(xì)臨床信息并進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，其中，男性82例，女性70例?；颊吣挲g范圍32～85歲，中位年齡68歲。病例的TNM分期以第八版國(guó)際癌癥控制聯(lián)盟標(biāo)準(zhǔn)(AJCC)為依據(jù)。

1.2 免疫組化檢測(cè)及結(jié)果判讀

按規(guī)范操作進(jìn)行免疫組織化學(xué)染色，采用EnVision兩步法檢測(cè)RAI14在OSCC、癌旁及正?？谇火つそM織中的的表達(dá)情況，RAI14兔單克隆抗體(ab137118工作濃度為1∶100，英國(guó)Abcam)。免疫組織化學(xué)染色結(jié)果由2名病理醫(yī)師采用雙盲方法進(jìn)行評(píng)價(jià)。根據(jù)染色強(qiáng)度[4](無(wú)著色=0，弱=1，中等=2，高=3)和染色細(xì)胞百分率(<1%=0，1%～10%=1，11%～50%=2，51%～80%=3，81%～100%=4)進(jìn)行免疫組織化學(xué)評(píng)分,每個(gè)組織免疫反應(yīng)分?jǐn)?shù)(IRS),由染色強(qiáng)度×陽(yáng)性細(xì)胞百分率得出。IRS<4分低表達(dá)組，IRS≥4分高表達(dá)組。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

采用SPSS21.0軟件對(duì)實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行分析。采用卡方檢驗(yàn)分析RAI14在OSCC、癌旁及正常口腔黏膜組織中RAI14表達(dá)水平差異及與臨床病理因素的關(guān)系。Kaplan-Meier進(jìn)行生存分析并繪制存活曲線(xiàn)。通過(guò)COX比例風(fēng)險(xiǎn)模型進(jìn)行單因素及多因素分析。P<0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 RAI14在OSCC中的表達(dá)情況及與臨床病理因素的關(guān)系

免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)結(jié)果顯示RAI14主要分布在細(xì)胞的細(xì)胞質(zhì)及細(xì)胞膜上(圖1)，RAI14在OSCC、癌旁及正?？谇火つそM織中的高表達(dá)率分別為59.2%(90/152)、31.44%(31/90)和16.00%(4/21)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義χ2=22.446，P<0.001(表1)。

圖1 OSCC、癌旁及正常口腔黏膜組織中RAI14的表達(dá)情況

表1 OSCC、癌旁及正?？谇火つそM織中RAI14的表達(dá)

RAI14的表達(dá)與腫瘤的分化程度、TNM分期均相關(guān)，P<0.05(表2)，與年齡、性別、T分期、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移等無(wú)明顯相關(guān)性，P>0.05(表2)。

2.2 OSCC中RAI14表達(dá)水平與預(yù)后

152例OSCC患者中，90例有完整的隨訪(fǎng)信息，隨訪(fǎng)截至2020年7月30日，隨訪(fǎng)時(shí)間為(2～136月)，中位隨訪(fǎng)時(shí)間為35個(gè)月。利用Kaplan-Meier對(duì)90例有完整隨訪(fǎng)信息的免疫組織化學(xué)染色結(jié)果進(jìn)行分析并繪制生存曲線(xiàn)，結(jié)果表明RAI14高表達(dá)患者的生存時(shí)間(2月～125月，中位時(shí)間為31月)明顯少于RAI14低表達(dá)患者(5月～136月，中位時(shí)間為41月)，兩組差異有明顯的統(tǒng)計(jì)學(xué)意義,χ2=6.748，P=0.009(圖3)。

圖2 RAI14表達(dá)與OSCC患者預(yù)后的生存分析

COX單因素分析結(jié)果表明，腫瘤的分化程度(P=0.029，HR為0.504)、TNM分期(P=0.034，HR為0.525)、RAI14表達(dá)量(P=0.013，HR為0.446)是影響OSCC患者生存時(shí)間的重要因素。COX多因素生存分析顯示RAI14高表達(dá)(P=0.034，HR為1.996)與OSCC患者死亡有關(guān)，是OSCC患者預(yù)后不良的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素(表3)。

表3 COX單因素及多因素分析

3 討論

RAI14可通過(guò)全反式維甲酸在人視網(wǎng)膜色素上皮細(xì)胞(ARPE-19)中誘導(dǎo)產(chǎn)生[3]。越來(lái)越多的研究表明，RAI14在某些惡性腫瘤的化療藥物反應(yīng)和癌細(xì)胞增殖和侵襲過(guò)程中起關(guān)鍵作用。如HSU等[12]通過(guò)癌基因侵襲能力及抗藥能力的全基因組分析，發(fā)現(xiàn)RAI14與EGFR、ITGA3、MYLK、AHNAK、GLS、IL32和NNMT等8個(gè)基因，與紫杉醇，多西他賽，厄洛替尼，維羅莫司和達(dá)沙替尼等腫瘤化療藥物顯著相關(guān)。SHEN等[13]表明RAI14通過(guò)mTOR信號(hào)增強(qiáng)NF-kB活化及相關(guān)炎癥效應(yīng)，已經(jīng)證實(shí)NF-kB信號(hào)傳導(dǎo)途徑涉及腫瘤及神經(jīng)退行性疾病等多種病理狀況，表明RAI14與腫瘤的發(fā)生密切相關(guān)。進(jìn)一步研究中，CHEN等[14]通過(guò)敲除RAI14基因下調(diào)Akt通路，來(lái)抑制胃癌細(xì)胞的增殖、遷移和侵襲，促進(jìn)細(xì)胞凋亡；同時(shí)，其下游蛋白Cyclin D1在RAI14缺陷細(xì)胞中的表達(dá)也降低；HAWKINS等[8]在卵巢癌中研究表明NR2F2通過(guò)調(diào)節(jié)NEK2、RAI14從而影響其他多種相關(guān)基因的表達(dá)來(lái)影響卵巢癌的細(xì)胞周期，RAI14基因表達(dá)可能會(huì)影響卵巢癌細(xì)胞的增殖和凋亡；PAEZ等[9]在前列腺癌中發(fā)現(xiàn)RAI14參與腫瘤細(xì)胞骨架細(xì)胞間的調(diào)節(jié),可以影響細(xì)胞的侵襲、遷移及細(xì)胞的粘附性；WANG[15]研究表明，RAI14的低表達(dá)可以抑制STAT3激活和下游因子的表達(dá)來(lái)抑制癌細(xì)胞的增殖，侵襲和遷移；但YUAN[16]等分析肺腺癌發(fā)現(xiàn)RAI14在A549和71例患者中的31例上調(diào)，其高表達(dá)可抑制細(xì)胞增殖，表明RAI14有作為肺腺癌新的生物標(biāo)記物的潛力。以上觀點(diǎn)表明，RAI14的表達(dá)各種與腫瘤的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)，但關(guān)于RAI14在OSCC中的表達(dá)相關(guān)研究報(bào)道較少，本研究采用免疫組織化學(xué)方法檢測(cè)RAI14蛋白的表達(dá)水平，在OSCC、癌旁及正常口腔黏膜組織中RAI14的高表達(dá)分別為59.2%(90/152)、31.44%(31/90)和16%(4/25)，差異顯著，結(jié)果提示RAI14可能是促進(jìn)OSCC發(fā)生發(fā)展的癌基因。

本研究采用卡方檢驗(yàn)分析發(fā)現(xiàn)OSCC中的RAI14的高表達(dá)與腫瘤的分化程度(P=0.021)及TNM分期(P=0.025)均相關(guān)，提示RAI14的高表達(dá)與OSCC的發(fā)生發(fā)展有一定的關(guān)系。COX單因素分析表明，RAI14表達(dá)量(P=0.013，HR為0.446)、腫瘤的分化程度(P=0.029，HR為0.504)、TNM分期(P=0.034，HR為0.525)是影響患者生存時(shí)間的重要因素，這與臨床病理因素分析結(jié)果一致。Kaplan-Meier結(jié)果表明，OSCC中RAI14高表達(dá)患者的術(shù)后生存時(shí)間明顯低于低表達(dá)患者(P=0.009)，說(shuō)明RAI14表達(dá)與OSCC患者的生存率相關(guān)，可以用RAI14來(lái)判斷OSCC患者的預(yù)后，COX多因素分析進(jìn)一步證實(shí)RAI14高表達(dá)是OSCC患者預(yù)后不良的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素(P=0.034，HR=1.996)，與患者的死亡有關(guān)。這與RAI14在胃癌及乳腺癌中的過(guò)表達(dá)是預(yù)后不良的獨(dú)立預(yù)測(cè)因素研究結(jié)果一致[12.15]。以上結(jié)果表明RAI14表達(dá)與OSCC患者的臨床病理特征及預(yù)后密切相關(guān)，RAI14可能是參與OSCC生長(zhǎng)和轉(zhuǎn)移的關(guān)鍵基因之一。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)RAI14在OSCC組織中高表達(dá)，RAI14高表達(dá)與患者的預(yù)后不良相關(guān)，可能可以作為OSCC患者預(yù)后評(píng)估的潛在生物標(biāo)志物。后續(xù)進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量完善臨床信息，結(jié)合分子生物實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步探索RAI14在OSCC發(fā)生發(fā)展中的具體機(jī)制。