柯萍，江波

650118 昆明，昆明醫(yī)科大學(xué)第三附屬醫(yī)院 干部醫(yī)療科

肺癌是全世界死亡率最高的惡性腫瘤[1]。晚期肺癌的治療繼化學(xué)治療、分子靶向治療之后，進(jìn)入以免疫檢查點(diǎn)抑制劑(immune checkpoint inhibitor，ICI)為代表的治療時(shí)代。盡管ICI改變了肺癌患者的治療策略，但實(shí)際上獲益人群僅占晚期非小細(xì)胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)患者的20%左右[2]。生物標(biāo)志物可以標(biāo)記機(jī)體生理狀態(tài)，常被用來(lái)評(píng)估ICI抗腫瘤治療的效果并指導(dǎo)臨床用藥，但是，臨床現(xiàn)有的生物標(biāo)志物并不足以滿(mǎn)足篩選ICI獲益群體的需求，因此需要進(jìn)一步探索更明確的生物標(biāo)志物。另外，目前臨床應(yīng)用的生物標(biāo)志物多是通過(guò)腫瘤組織進(jìn)行檢測(cè)，然而組織病理活檢具有一定侵入性，限制了用于監(jiān)測(cè)治療反應(yīng)和治療耐藥性研究所需的重復(fù)采樣的可能；同時(shí)，由于腫瘤異質(zhì)性的存在，可能會(huì)遺漏重要的特征。外周血液與腫瘤有同源的基因，能有效克服腫瘤異質(zhì)性，較為完整地反映原發(fā)腫瘤的基因突變狀態(tài)，其檢測(cè)技術(shù)因其非侵入性、操作簡(jiǎn)便等特點(diǎn)可以實(shí)現(xiàn)腫瘤實(shí)時(shí)監(jiān)測(cè)及預(yù)后判斷，因此，其中可能存在潛在的生物標(biāo)志物[3]。本文通過(guò)歸納整理存在于外周血液的生物標(biāo)志物，包括程序性死亡受體配體1(programmed cell death 1 ligand 1，PD-L1)、可溶性PD-L1(soluble PD-L1,sPD-L1)、血漿腫瘤突變負(fù)荷(blood tumor mutation burden,bTMB)、微小核糖核酸(microRNA，miRNA)、突變基因、T細(xì)胞受體(T cell receptor,TCR)庫(kù)、外周血免疫效應(yīng)標(biāo)志物和外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)，介紹上述標(biāo)志物在肺癌中的研究進(jìn)展并討論聯(lián)合標(biāo)志物的應(yīng)用，以期為篩選血液學(xué)生物標(biāo)志物指導(dǎo)臨床免疫治療提供參考。

1 PD-L1

程序性死亡受體1(programmed cell death protein 1,PD-1)主要由活化的T細(xì)胞表達(dá)，其配體PD-L1主要由腫瘤細(xì)胞表達(dá),PD-L1與PD-1的結(jié)合能誘導(dǎo)與維持外周T細(xì)胞的耐受，是腫瘤免疫逃避的關(guān)鍵機(jī)制[4]。多個(gè)指南推薦腫瘤組織PD-L1可以作為指導(dǎo)肺癌ICI治療的生物標(biāo)志物[5-8]，但是由于空間和時(shí)間異質(zhì)性，局部腫瘤組織PD-L1的表達(dá)量不能完整反映腫瘤的狀態(tài)[9-10]。

循環(huán)腫瘤細(xì)胞(circulating tumor cells,CTCs)隨血液循環(huán)播散到全身，導(dǎo)致腫瘤的轉(zhuǎn)移，因此比組織樣本更容易檢測(cè)到PD-L1的表達(dá)。有研究檢測(cè)了71個(gè)晚期NSCLC患者配對(duì)的肺癌組織和CTCs樣本中PD-L1的表達(dá)水平，兩者一致性達(dá)93%(CTCs的敏感性為55%，特異性為100%)，顯示了通過(guò)CTCs監(jiān)測(cè)PD-L1表達(dá)的可行性[11]。Tanizaki等[12]收集晚期NSCLC患者使用PD-1抑制劑納武單抗(nivolumab)治療前的外周血并分離CTCs，結(jié)果顯示，無(wú)進(jìn)展生存期(progression-free survival，PFS)<6個(gè)月組的患者CTCs中PD-L1表達(dá)水平明顯要高于PFS>6個(gè)月組患者,反應(yīng)了CTCs中PD-L1低表達(dá)水平對(duì)良好預(yù)后的評(píng)估作用。目前，經(jīng)CTCs檢測(cè)PD-L1的表達(dá)應(yīng)用挑戰(zhàn)較大，因精準(zhǔn)富集一定數(shù)量的CTCs是必要條件，另外，由于缺乏規(guī)范的檢測(cè)流程與質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，所以需要完善檢測(cè)的重復(fù)性。

PD-L1是PD-1主要的配體，部分以sPD-L1存在于血液中[13]。22例使用PD-1/PD-L1抑制劑的患者的研究結(jié)果顯示血液中sPD-L1的表達(dá)與腫瘤組織中PD-L1表達(dá)水平無(wú)相關(guān)性，sPD-L1低水平組的患者總生存期(overall survival，OS)明顯延長(zhǎng)[14]。Okuma等[15]檢測(cè)39例使用nivolumab治療的晚期NSCLC患者sPD-L1的表達(dá)水平，發(fā)現(xiàn)sPD-L1低表達(dá)組患者的OS高于高表達(dá)組(P=0.040)，客觀緩解率(objective response rate,ORR)高于高表達(dá)組(59%vs25%，P= 0.0069)，但該研究未評(píng)估血漿sPD-L1水平與腫瘤組織標(biāo)本中PD-L1表達(dá)水平之間的相關(guān)性。Costantini等[16]收集了43例nivolumab治療前NSCLC患者的血漿,發(fā)現(xiàn)高水平sPD-L1的表達(dá)和低水平顆粒酶B的含量與不良的PFS和OS相關(guān)，該研究也顯示sPD-L1的表達(dá)與相對(duì)應(yīng)腫瘤組織標(biāo)本中PD-L1的表達(dá)水平無(wú)關(guān)。上述研究均提示血漿sPD-L1的低水平表達(dá)可能是晚期NSCLC患者免疫治療的獨(dú)立預(yù)后因素。sPD-L1可簡(jiǎn)便易行地判斷臨床預(yù)后，但在其功能和釋放機(jī)制上仍有爭(zhēng)議，即血漿sPD-L1水平可能代表腫瘤組織中固有T細(xì)胞反應(yīng)的程度或由PD-1 / PD-L1免疫檢查點(diǎn)機(jī)制介導(dǎo)免疫抑制的程度；另外，目前尚無(wú)標(biāo)準(zhǔn)化的sPD-L1檢測(cè)方法，就目前研究中使用的幾種ELISA試劑盒，其閾值不同，評(píng)判標(biāo)準(zhǔn)也不統(tǒng)一。總之，sPD-L1作為潛在的免疫治療生物標(biāo)志物在未來(lái)仍需要進(jìn)一步的研究。

2 bTMB

腫瘤突變負(fù)荷(tumor mutation burden,TMB)是指每百萬(wàn)堿基中檢測(cè)出的體細(xì)胞基因編碼錯(cuò)誤、堿基替換、基因插入或缺失錯(cuò)誤的總數(shù)。理論上TMB越高，新的腫瘤相關(guān)抗原越多，刺激產(chǎn)生免疫應(yīng)答的可能性越大，治療效果就越好。關(guān)于NSCLC的治療，美國(guó)國(guó)立綜合癌癥網(wǎng)絡(luò)(National Comprehensive Cancer Network,NCCN )指南推薦行免疫治療的患者檢測(cè)TMB[17]，然而，TMB的檢測(cè)卻受限于腫瘤組織的獲取，研究發(fā)現(xiàn)可以通過(guò)存在于血液中的循環(huán)腫瘤DNA(circulating tumor DNA,ctDNA)檢測(cè)TMB，即bTMB[18]。

Gandara 等[19]對(duì)兩項(xiàng)大型臨床研究中NSCLC患者血漿樣本的bTMB進(jìn)行回顧性分析，發(fā)現(xiàn)bTMB和組織TMB(tissue TMB,tTMB)的陽(yáng)性一致率為64%，陰性一致率為88%,且bTMB 的含量與 PD-L1表達(dá)水平無(wú)關(guān)，在PD-L1高表達(dá)且bTMB≥16的患者中，PFS有明顯延長(zhǎng)(HR=0.38)，該研究也提示多種生物標(biāo)志物的組合比任何單一生物標(biāo)志物能更好地預(yù)測(cè)治療效果。Chen等[20]收集PD-1抑制劑帕博利珠單抗(pembrolizumab)治療的8例NSCLC患者的腫瘤組織及ctDNA同時(shí)檢測(cè)TMB，結(jié)果也高度一致。Wang等[21]使用下一代測(cè)序(next generation sequencing,NGS)腫瘤基因板評(píng)估了NSCLC患者的bTMB，發(fā)現(xiàn)bTMB>6的患者PFS更長(zhǎng)(HR=0.39,P=0.01)。這些研究顯示了bTMB與tTMB的良好相關(guān)性，且有助于預(yù)測(cè)高bTMB患者對(duì)ICI的反應(yīng)，但這些方法仍存在一些局限性。首先，不同的檢測(cè)平臺(tái)及檢測(cè)方法使ctDNA的檢測(cè)結(jié)果參差不齊，其次，目前用于確定bTMB的基因面板使用不同的序列和閾值，導(dǎo)致研究結(jié)果各不相同，所以，bTMB的準(zhǔn)確性仍需大型Ⅲ期臨床研究進(jìn)行驗(yàn)證。

3 循環(huán)miRNA

miRNA通過(guò)多種方式調(diào)控基因表達(dá)，對(duì)腫瘤的生長(zhǎng)、進(jìn)展、轉(zhuǎn)移和耐藥性等每一個(gè)標(biāo)志性事件都有非常重要的作用，體液和組織中的miRNA表達(dá)水平一致，且miRNA與腫瘤的分期及基因突變無(wú)關(guān)[22]，循環(huán)miRNA能穩(wěn)定存在于血清及血漿中，因此引起了廣泛的關(guān)注。

miR-215具有抑癌作用[23]，一項(xiàng)回顧性研究[24]對(duì)接受nivolumab治療的晚期NSCLC患者血清行miRNA分析，結(jié)果表明七個(gè)miRNA(miR-215-5p、miR-411-3p、miR-493-5p、miR-494-3p、miR-495-3p、miR-548j- 5p和miR-93-3p)與患者OS>6個(gè)月顯著相關(guān)。Boeri等[25]檢測(cè)接受ICI治療的NSCLC患者組織PD-L1的表達(dá)水平及計(jì)算由24種miRNA組成的血漿miRNA特征分類(lèi)器(miRNA-signature classifier,MSC)的水平，發(fā)現(xiàn)MSC水平與患者ORR(P=0.0009)相關(guān)，MSC水平聯(lián)合PD-L1表達(dá)水平則與患者PFS(P=0.0001)和OS(P=0.0002)相關(guān)，表明了血漿MSC水平聯(lián)合腫瘤組織PD-L1的表達(dá)量，可以預(yù)測(cè)免疫治療方案中ORR、PFS和OS較差的晚期肺癌患者。目前關(guān)于循環(huán)miRNA對(duì)ICI療效預(yù)測(cè)的相關(guān)報(bào)道多是回顧性或小樣本研究，需要更大型的獨(dú)立驗(yàn)證隊(duì)列進(jìn)行前瞻性評(píng)估。循環(huán)miRNA檢測(cè)的局限性在于檢測(cè)方法對(duì)溶血敏感性的限制，另外，用于定量檢測(cè)的基因選擇上也不一致。

4 突變基因

腫瘤驅(qū)動(dòng)基因通路和PD-1/PD-L1通路可能存在相互影響，研究顯示表皮生長(zhǎng)因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)、間變性淋巴瘤激酶等驅(qū)動(dòng)基因突變患者接受免疫治療具有更低的ORR[26]，因此ICI治療需除外此類(lèi)基因突變的患者。臨床中突變基因在肺癌組織中的受檢率并不高，通過(guò)血液學(xué)檢測(cè)突變基因已在多項(xiàng)研究中得到證實(shí)[27-28]，中國(guó)臨床腫瘤學(xué)會(huì)(Chinese Society of Clinical Oncology,CSCO)指南也表示可通過(guò)外周血中的游離/循環(huán)腫瘤DNA(cf/ctDNA)進(jìn)行 EGFR 突變檢測(cè)[29]。有研究收集晚期NSCLC患者的ctDNA行NGS，13例基線檢測(cè)到KRAS轉(zhuǎn)化或TP53轉(zhuǎn)化的患者顯示出nivolumab治療的臨床獲益，繼續(xù)治療直至疾病進(jìn)展的病例中有8例患者STK11突變與TP53轉(zhuǎn)化并存或STK11突變與KRAS轉(zhuǎn)化并存，提示STK11突變是原發(fā)耐藥驅(qū)動(dòng)因素[30]。但目前關(guān)于免疫治療療效和突變基因在肺癌中的研究較少，沒(méi)有確切證據(jù)證明有特定的癌基因與免疫治療療效有獨(dú)立相關(guān)性。

5 TCR庫(kù)

ICI可能在一定程度上影響和改變了機(jī)體免疫系統(tǒng)對(duì)抗腫瘤的能力，針對(duì)癌細(xì)胞的宿主免疫應(yīng)答的激活包括通過(guò)克隆增殖性TCR識(shí)別新抗原[31]，因此基于TCR的生物標(biāo)記可能會(huì)預(yù)測(cè)腫瘤對(duì)ICI的反應(yīng)。之前有研究報(bào)道[32-33]抗PD-1治療后外周血PD-1+CD8+T細(xì)胞的早期增殖與臨床獲益相關(guān)。因此,Han等[34]收集接受ICI治療的NSCLC患者的外周血樣本，對(duì)從PD-1+CD8+T細(xì)胞分離的TCR進(jìn)行了測(cè)序，結(jié)果顯示外周血PD-1+CD8+TCR的多樣性可以預(yù)測(cè)抗PD-1/PD-L1治療的臨床獲益。這些結(jié)果表明，外周血PD-1+CD8+TCR可能是ICI的療效預(yù)測(cè)標(biāo)志物，但此研究沒(méi)有配對(duì)血液及腫瘤組織樣本，不能更有力地說(shuō)明結(jié)論，且樣本量小，需要更大的隊(duì)列研究證實(shí)。TCR測(cè)序預(yù)測(cè)免疫治療療效的潛在價(jià)值很高，但檢測(cè)時(shí)機(jī)及檢測(cè)方法仍是目前研究所要探尋的問(wèn)題。

6 免疫效應(yīng)標(biāo)志物

癌細(xì)胞通過(guò)生長(zhǎng)因子、趨化因子、白介素及其自身受體的復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)與微環(huán)境進(jìn)行通訊，PD-1/PD-L1免疫治療解除免疫抑制，下游一系列炎癥因子,如IFN-γ、TNF-α、IL-6和IL-8等也可能發(fā)生相應(yīng)的變化。所以，炎癥因子可能是預(yù)測(cè)免疫治療療效的標(biāo)志物。研究檢測(cè)接受免疫藥物治療(pembrolizumab或nivolumab)的NSCLC患者診斷時(shí)和治療開(kāi)始后3個(gè)月時(shí)的細(xì)胞因子(IFN-γ，TNF-α，IL-1β，IL-2，IL-4，IL-6和IL-8)數(shù)值，結(jié)果顯示細(xì)胞因子數(shù)值的增加與患者OS的延長(zhǎng)明顯相關(guān)[35]。但此研究中，樣本較少，有一些患者在接受抗PD-1抑制劑治療之前接受一線化療，在二線使用PD-1抑制劑的背景下，常規(guī)化療對(duì)細(xì)胞因子水平的影響仍然不明確。另有研究[36]示使用nivolumab或pembrolizumab的NSCLC患者治療1周內(nèi)血清IL-6和C-反應(yīng)蛋白升高組的治療有效率顯著高于未升高組。上述研究均提示了免疫效應(yīng)標(biāo)志物與免疫治療療效相關(guān)，然而在研究時(shí)應(yīng)排除并發(fā)炎癥引起的假象的可能性，可考慮與炎癥指標(biāo)相結(jié)合，以區(qū)分與癌癥進(jìn)展相關(guān)的效應(yīng)標(biāo)志物的升高以及可能由炎性疾病(如并發(fā)感染或自身免疫不良事件)引起的升高。目前關(guān)于外周血細(xì)胞因子研究較多，但還沒(méi)有定論。

7 血細(xì)胞計(jì)數(shù)

炎癥細(xì)胞可促進(jìn)腫瘤發(fā)展，故監(jiān)測(cè)外周血細(xì)胞是值得研究的領(lǐng)域，全血細(xì)胞計(jì)數(shù)是最常見(jiàn)的實(shí)驗(yàn)室檢測(cè)。一項(xiàng)使用nivolumab的晚期NSCLC患者的回顧性研究[12]表明，低水平中性粒細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)(absolute neutrophil count,ANC)、高水平淋巴細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)(absolute lymphocytes count,ALC)和高水平嗜酸性粒細(xì)胞絕對(duì)計(jì)數(shù)(absolute eosinophil count,AEC)的患者有較長(zhǎng)的PFS及OS。該研究的局限性在于未設(shè)置未接受nivolumab治療的患者，無(wú)法確定ANC，ALC和AEC是對(duì)nivolumab反應(yīng)的一般預(yù)后標(biāo)志物還是預(yù)測(cè)標(biāo)志物。一項(xiàng)薈萃分析評(píng)估了1 700名用PD-1 / PD-L1抑制劑治療的NSCLC患者血液中性粒細(xì)胞與淋巴細(xì)胞比值(neutrophil-to-lymphocyte ratio，NLR)的預(yù)測(cè)和預(yù)后價(jià)值，表明接受PD-1 / PD-L1抑制劑治療的NSCLC患者血液NLR升高與PFS和OS縮短相關(guān)[37]。Kim等[33]測(cè)量ICI治療后7天的患者外周血PD-1+CD8+T細(xì)胞中Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞百分比，發(fā)現(xiàn)高比例的Ki-67陽(yáng)性細(xì)胞有持久的臨床獲益。但外周血細(xì)胞計(jì)數(shù)容易受外界的干擾，篩選特異的細(xì)胞有助于提高預(yù)測(cè)的可靠性。

8 聯(lián)合檢測(cè)的意義及必要性

從目前臨床應(yīng)用結(jié)果看來(lái)，單一標(biāo)志物的應(yīng)用并不理想，多因素聯(lián)合預(yù)測(cè)是未來(lái)研究的方向。 有研究根據(jù)PD-L1與腫瘤浸潤(rùn)淋巴細(xì)胞(tumor infiltrating lymphocyte,TIL)的表達(dá)將肺癌患者分為四型：Ⅰ型(TIL+/PD-L1+)、Ⅱ型(TIL-/PD-L1-)、Ⅲ型(TIL+/PD-L1-)、Ⅳ型(TIL-/PD-L1+)，并評(píng)估上述四分法對(duì)接受ICI治療的NSCLC患者的預(yù)測(cè)作用，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ和Ⅳ型患者的OS分別為35.3個(gè)月、36.9個(gè)月、未達(dá)到中位OS和13.9個(gè)月(P=0.11)，結(jié)果表明CD8+T淋巴細(xì)胞高的患者有較長(zhǎng)的PFS和OS[38]。Park等[39]將患者的性別、ECOG評(píng)分、NLR、DNLR設(shè)計(jì)成ISEND計(jì)算模型，用nivolumab進(jìn)行治療，發(fā)現(xiàn)評(píng)分好的患者PFS明顯延長(zhǎng)(17.4月vs5.1月,HR=0.32,P<0.001)。以上研究均提示多因素聯(lián)合預(yù)測(cè)的意義重大，未來(lái)應(yīng)綜合多維度特征，構(gòu)建復(fù)合變量的預(yù)測(cè)模型是很有發(fā)展前景的。

9 總結(jié)及展望

綜上，血液學(xué)標(biāo)志物能極大地補(bǔ)充生物標(biāo)志物篩選ICI獲益群體的需要，然而現(xiàn)階段血液學(xué)標(biāo)志物的應(yīng)用還存在局限性，血液采樣和分析之間的時(shí)間應(yīng)盡可能縮短，在低腫瘤負(fù)荷患者中，其血液中的生物標(biāo)志物含量很低，這對(duì)檢測(cè)技術(shù)的靈敏度要求很高。另外，目前免疫聯(lián)合治療優(yōu)勢(shì)越來(lái)越明顯，那么，聯(lián)合治療模式下生物標(biāo)志物的選擇又可能不同，當(dāng)前多是免疫單藥治療的相關(guān)研究，為此，未來(lái)應(yīng)利用大數(shù)據(jù)進(jìn)行更深地挖掘，單獨(dú)或組合測(cè)試不同的生物標(biāo)志物，統(tǒng)一化標(biāo)志物檢測(cè)技術(shù)，確定閾值，建立綜合模型來(lái)預(yù)測(cè)治療敏感性，開(kāi)展大型的前瞻性臨床試驗(yàn)進(jìn)行驗(yàn)證。

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