彭宇，姚定康

200003 上海，海軍軍醫(yī)大學附屬長征醫(yī)院 消化內(nèi)科

嵌合抗原受體T細胞(chimeric antigen receptor T cell,CAR-T)免疫療法是一種改良的T細胞免疫治療術，是將抗體對抗原的高特異性與T細胞對靶腫瘤的細胞毒性相結合的一種方法。嵌合抗原受體(chimeric antigen receptor,CAR)的基本結構為胞外抗原識別結構域、跨膜結構域和胞內(nèi)信號結構域[1]，胞外抗原識別結構域是識別腫瘤相關抗原或腫瘤特異性抗原的單鏈可變區(qū)(single-chain variable fragment，scFv)，scFv通過鉸鏈區(qū)、跨膜區(qū)與胞內(nèi)信號轉導通路相連，當T細胞識別腫瘤抗原后，scFv段與腫瘤抗原結合可直接激活并啟動T細胞殺傷機制。這種CAR結構使T細胞越過主要組織相容性復合體(major histocompatibility complex,MHC)提呈機制直接識別腫瘤細胞，避免了由于MHC分子的限制和MHC分子表達下調(diào)引起的腫瘤免疫逃逸問題[2]；且MHC只能提呈蛋白質(zhì)片段，而CAR得益于其抗原抗體機制還可識別細胞表面的多糖以及脂類蛋白；CAR-T細胞回輸?shù)襟w內(nèi)識別腫瘤并激活后可穩(wěn)定增殖以形成持續(xù)殺傷力，并通過釋放細胞因子等方式召集其他免疫細胞協(xié)同作戰(zhàn)。這些性質(zhì)使得CAR-T療法與單抗以及小分子靶向藥物等血藥濃度會隨時間下降的治療方式相比，具有明顯的優(yōu)勢。本文將對CAR-T的發(fā)展以及在消化系統(tǒng)腫瘤中的進展做一個較為詳盡的介紹，旨在為CAR-T未來的發(fā)展方向及在消化系統(tǒng)腫瘤的臨床應用提供參考。

1 CAR-T療法的發(fā)展

CAR-T療法目前已發(fā)展至第四代，第一代CAR僅有scFv和一個CD3ζ胞內(nèi)信號域，由于缺少必要的共刺激信號，在體內(nèi)擴增能力有限;第二代增加了一個共刺激信號CD28或4-1BB;第三代則包含兩個共刺激信號，一個是CD28或4-1BB，另一個為OX40、DAP-10或ICOS，使得 CAR-T 細胞在體內(nèi)持久穩(wěn)定擴增并且分泌細胞因子增加從而有效殺傷癌細胞;第四代CAR-T細胞又被稱為TRUCK T細胞(T-cells redirected for universal cytokine killing )，新加入的細胞因子序列使CAR-T細胞在腫瘤區(qū)域分泌特定的細胞因子，增強了抗腫瘤免疫反應，開啟了CAR-T療法應用于實體腫瘤的新思路。

2 CAR-T療法在消化系統(tǒng)腫瘤中的研究

2.1 肝癌

迄今為止，CAR-T療法在肝細胞癌(hepatocellular carcinoma，HCC)治療的臨床前研究成果頗豐，磷脂酰肌醇聚糖3(glypican-3,GPC3)是研究的熱門靶點，α甲胎蛋白、粘蛋白1(mucin 1,MUC1)、上皮細胞粘附分子(epithelial cell adhesion molecules,EpCAM)和癌胚抗原(carcino-embryonic antigen,CEA)等亦是HCC患者CAR-T治療的良好靶標[3]。GPC3在HCC中高表達但在正常組織中表達受限，靶向GPC3的CAR-T細胞可有效消滅GPC3陽性的HCC細胞，為GPC3陽性的HCC提供了治療策略，目前已有靶向GPC3的CAR-T細胞用于治療HCC的十幾個臨床試驗[4- 5]。含有hYP7受體的CAR-T細胞對GPC3的C端具有高親和力，CAR(hYP7)T細胞可能通過誘導穿孔素和顆粒酶介導的癌細胞凋亡，或下調(diào)Wnt信號轉導以清除GPC3+HCC細胞，研究結果顯示被注射CAR(hYP7)T細胞的小鼠中，有66%的小鼠體內(nèi)的HCC被消滅[6]。為減少單靶點CAR-T伴隨的脫靶效應，Chen等[7]開發(fā)了靶向GPC3和唾液酸糖蛋白受體1(asialoglycoprotein receptor 1,ASGR1)的CAR-T，這種雙重CAR-T可殺死同時表達GPC3和ASGR1抗原的HCC細胞，但不影響單獨表達兩種抗原的正常組織細胞，特異性、安全性和抗腫瘤作用更強。

程序性死亡受體1(programmed cell death 1,PD-1)及程序性死亡受體-配體1 (programmed cell death-ligand 1,PD-L1)介導的T細胞抑制與包括HCC在內(nèi)的多種實體瘤的免疫逃逸有關，抑制GPC3 CAR-T的PD-1表達可以增強CAR-T對HCC細胞的殺傷作用[8]。與對照組GPC3 CAR-T細胞相比，阻斷了PD-1 / PD-L1通路的GPC3 CAR-T細胞特異性識別并裂解GPC3+HCC細胞的能力更強，且治療后的HCC異種移植小鼠血液循環(huán)和腫瘤組織中CD3+T細胞水平更高，而顆粒酶B和Ki67表達水平更低[9]。因此，構建一種同時阻斷腫瘤免疫逃逸通路的新型GPC3 CAR-T細胞可能是治療HCC的新型策略。

CAR-T細胞能夠在腫瘤區(qū)域分泌特定的細胞因子，目前主要是白介素12(interleukin 12,IL-12)，在肝癌小鼠模型中誘導表達IL-12可以增強GPC3 CAR-T功能，并減少細胞因子過量釋放的副作用[10]。另外，用CAR-T聯(lián)合化療亦可有效降低治療副作用，低劑量的索拉非尼即可增強CAR-T細胞在肝癌小鼠體內(nèi)的抗腫瘤作用，促進腫瘤相關巨噬細胞介導的IL-12分泌和癌細胞凋亡，表明索拉非尼與GPC3 CAR-T聯(lián)合治療HCC具有臨床應用潛力[11]。異曲同工的是，Zhang等[12]開發(fā)了一種靶向CD147的新型誘導型CAR-T，通過在HCC局部注射強力霉素，可增加CAR-T細胞在腫瘤組織中的駐留率并可減少全身吸收，且強力霉素的存在促進了CD147 CAR-T細胞增殖和細胞因子分泌，這或許是一種可行的CAR-T聯(lián)合治療策略。但CD147是腫瘤相關抗原，因此CD147 CAR-T細胞仍然可能識別并攻擊表達CD147的正常組織，這也是其不足之處。

2.2 胰腺癌

胰腺導管腺癌(pancreatic ductal adenocarcinoma，PDAC)是胰腺最常見的惡性腫瘤，間皮素(mesothelin,MSLN)、CEA、HER2、MUC-1、NK-R、前列腺特異性抗原(prostate-specific antigen,PSCA)、CD133和CD24是CAR-T治療PDAC的常見靶標[13]。MSLN是一種細胞表面糖蛋白，其過表達會促進細胞增殖和遷移，MSLN高表達的癌細胞中抗凋亡蛋白Bcl-XL和Mcl-1上調(diào)，從而抑制TNF-α誘導的細胞凋亡[14]。與對照組CAR-T細胞相比，靶向MSLN的CAR-T(CART-meso)顯著抑制腫瘤生長，IFN-γ分泌水平更高，且在腫瘤緩解后更多的CART-meso細胞分化為記憶T細胞，并對胰腺癌異種移植小鼠的主要器官造成的損害最小[15]。I期臨床試驗已證明CART-meso細胞治療的PDAC患者未出現(xiàn)細胞因子釋放綜合征或神經(jīng)系統(tǒng)癥狀，且六分之二的患者病情穩(wěn)定[16]。

盡管目前CAR-T療法在胰腺癌治療的探索已初見成效，但是臨床試驗的副反應卻不容忽視。在一項臨床試驗中CEA特異性CAR-T細胞治療不僅效果短暫，還會誘導急性呼吸道毒性，細胞因子過量釋放使得IL-6水平顯著升高[17]。而當非腫瘤組織毒性受到控制，有效性又成了桎梏，一項I期臨床試驗使用HER2特異性CAR-T細胞治療兩名胰腺癌患者，盡管該實驗的安全性得到了證實，但其腫瘤殺傷效應一般[18]。為了兼顧靶向性和安全性，研究人員設計了一種帶有抗體開關的HER2 CAR-T，它與常規(guī)HER2 CAR-T一樣有效，這種“開關”是由腫瘤抗原特異性重組fab段劑量控制的，以調(diào)節(jié)CAR-T細胞活性的轉換，因此帶有開關的CAR-T可有效抵抗晚期PDAC患者腫瘤擴散，同時兼具開關控制的相對安全性[19]。

不容樂觀的是，胰腺腫瘤常常采用免疫逃逸策略，比如產(chǎn)生抑制性細胞因子，從而限制CAR-T細胞的增殖與存活能力。為此，研究人員利用腫瘤來源的IL-4[20]、IL-8[21]、TGFβ[22]、IL-10[23]等，開發(fā)了阻斷并逆轉腫瘤來源的細胞因子抑制作用的CAR-T，使得CAR-T療法成為能夠克服腫瘤微環(huán)境免疫抑制以助于治療PDAC的潛在方法。

2.3 結直腸癌(colorectal cancer，CRC)

目前CRC的常用臨床試驗靶點有CD133、CEA、EGFR、EpCAM及HER2，并分別取得了不錯的成效?，F(xiàn)有數(shù)據(jù)表明，CD133是復發(fā)或難治性惡性腫瘤的潛在治療靶標，一項招募了23例患者(14例HCC，7例胰腺癌和2例CRC)的I期臨床試驗(NCT02541370)證實了CD133 CAR-T治療CD133陽性晚期轉移瘤的可行性、有效性和毒力可控性[24]。一項I期遞增劑量試驗(NCT02349724)納入了10例CEA陽性轉移性CRC患者，對其進行CEA CAR-T細胞療法，結果顯示即使是給予大劑量CEA CAR-T細胞治療，患者依然耐受良好并且明顯獲益，外周血中CAR-T細胞持續(xù)增殖，多數(shù)患者的血清CEA水平也明顯下降[25]。 CAR-T細胞通過靶向EpCAM可誘導對EpCAM+癌細胞的溶解性細胞毒性，并分泌包括INF-γ和TNF-α在內(nèi)的細胞因子，在CRC異種移植模型中，EpCAM CAR-T治療顯著抑制了腫瘤的生長[26]。一項研究通過觀察HER2特異性CAR-T細胞對異種移植腫瘤的治療效果，發(fā)現(xiàn)HER2 CAR-T細胞具有滲入腫瘤組織并選擇性清除HER2+CRC細胞的能力[27]

近三年來，CAR-T在CRC的治療領域涌現(xiàn)出一批新的靶點。靶向鳥苷酰環(huán)化酶C(guanylyl cyclase C,GUCY2C)的CAR-T細胞可識別并殺死表達GUCY2C的人源性CRC細胞，在免疫缺陷的CRC異種移植小鼠模型中CAR-T細胞可持久存在，并表明人GUCY2C特異性CAR-T療法可用于治療GUCY2C陽性的轉移性CRC[28]，另有研究也表明GUCY2C CAR-T細胞可以在免疫缺陷的小鼠模型中治療轉移性CRC[29]。一項I期試驗用靶向腫瘤相關糖蛋白72的CAR-T(CAR-T72)對轉移性CRC進行了治療，發(fā)現(xiàn)患者血清中腫瘤相關糖蛋白72急劇下降，但CEA并未急劇下降，證明了CAR-T72細胞的相對安全性[30]。雙皮質(zhì)素樣激酶1(doublecortin-like kinase 1,DCLK1)可在CRC遺傳的小鼠模型中標記腫瘤干細胞，靶向DCLK1的CAR-T目的在于根除CRC腫瘤干細胞，與對照組CAR-T相比，這種新型的DCLK1 CAR-T細胞毒性更強，CRC細胞中IFN-γ釋放水平更高，腫瘤生長同比降低了約50%，證明DCLK1 CAR-T可以在體外誘導細胞毒性，并在體內(nèi)抑制異種移植物的生長[31]。以上結果都表明，CAR-T細胞可在CRC 中發(fā)揮治療作用，并在實體瘤的治療中顯示出巨大的潛力。

2.4 胃癌(gastric cancer，GC)

在過去的幾年中，應用CAR-T治療GC的臨床試驗靶點有MSLN、 EpCAM、CEA、MUC1、HER2和PSCA等。MSLN中的表位選擇至關重要，Zhang等[32]構建了分別靶向MSLN的I區(qū)和III區(qū)的meso1 CAR-T與meso3 CAR-T，與meso1 CAR-T相比，meso3 CAR-T的CD107α、IL-2和TNF-α等細胞因子的表達水平更高，在GC小鼠模型中，meso3 CAR-T介導的抗腫瘤效應更強。靶向MSLN的CAR-T細胞在體外對GC細胞表現(xiàn)出強大的細胞毒性和細胞因子分泌能力，并顯著抑制GC皮下移植瘤模型中腫瘤細胞的生長[33]。靶向PSCA的CAR-T細胞表現(xiàn)出與T細胞毒性相關的細胞因子增加，向體內(nèi)的GC組織周圍注射抗PSCA CAR-T細胞成功阻止了腫瘤進展，證實了抗PSCA CAR-T細胞的可行性及其抗GC的功效，提示PSCA CAR-T細胞用于治療GC患者的臨床應用潛力[34]。

NKG2D是NK細胞的強激活受體，也是T細胞的共刺激受體，靶向NKG2D的CAR-T細胞在體內(nèi)可顯著抑制GC異種移植物的生長，此外，順鉑可上調(diào)GC細胞中NKG2D配體的表達并增強NKG2D CAR-T細胞介導的細胞毒性[35]。另一項研究發(fā)現(xiàn)，靶向NKG2D配體的CAR-T細胞可裂解GC細胞系和腹水來源的人原代GC細胞，表明NKG2D配體特異性CAR-T細胞是治療伴有腹膜轉移的GC患者的潛在療法[36]。

GC患者中有一些特異性表達的蛋白可以作為CAR-T設計的潛在靶標。胃特異性緊密連接蛋白18.2(Claudin18.2,CLDN18.2)屬于緊密連接蛋白家族中的一種亞型，在所有GC患者中的陽性率近60%，即使是在GC轉移病灶中同樣有較高的表達水平，且研究觀察到CLDN18.2特異性CAR-T細胞在CLDN18.2+GC異種移植模型中介導了腫瘤消退[37]。此外，超過1/3的GC患者葉酸受體1(folate receptor 1,FOLR1)在癌細胞表面過表達，但在正常組織中很少表達，現(xiàn)有研究也證明了FOLR1特異性CAR-T細胞可誘導多種細胞因子分泌促使FOLR1陽性的GC細胞死亡[38]。因此，這些在GC組織中高表達但在正常組織中低表達的特異性蛋白，或在CAR-T領域具有出色的GC治療潛力。

2.5 其他消化系統(tǒng)腫瘤

目前膽管癌CAR-T治療的靶點有CD133、EGFR和HER2。使用CAR-T雞尾酒免疫療法治療晚期膽管癌患者，通過EGFR特異性CAR-T治療獲得了8.5個月的部分緩解，CD133 CAR-T治療獲得了持續(xù)4.5個月的部分緩解，但都伴隨一些CAR-T相關副反應[39]。一項臨床試驗(NCT01869166)評估了EGFR-CAR T細胞療法在EGFR+晚期膽道癌的療效，在17位患者中，1位獲得了完全緩解，10位病情穩(wěn)定[40]。另一項I期臨床試驗(NCT01935843)評估了HER2特異性CAR-T免疫療法在晚期膽道癌和胰腺癌患者中的安全性和可行性，11名患者中，1例有4.5個月的部分反應，5例病情穩(wěn)定[41]。

目前已有以EpCAM(NCT03013712)和HER2(NCT00889954)為靶點進行CAR-T治療食管癌的臨床試驗。肝配蛋白A型受體2(erythropoietin-producing hepatocellular receptor A2，EphA2)是受體酪氨酸蛋白激酶家族中的一員，EphA2的表達在食管癌組織和細胞中顯著上調(diào)，EphA2 CAR-T細胞表現(xiàn)出對食管癌細胞的劑量依賴性殺傷作用，并促進細胞因子的產(chǎn)生，為免疫療法治療食管癌開辟了一條新途徑[42]。總體看來，CAR-T免疫療法在一些發(fā)病率較低的消化系統(tǒng)腫瘤中的治療卓有成效，但寥落晨星，要應用到臨床尚且任重道遠。

3 總結與展望

目前多項CAR-T治療消化系統(tǒng)腫瘤的臨床試驗正在進行中，也涌現(xiàn)了一些振奮人心的臨床結果，但依然面臨著CAR-T治療的特異性不夠高、副作用較大和腫瘤微環(huán)境免疫抑制的挑戰(zhàn)。為解決這一系列問題，很多學者著力于研究雙靶點CAR-T，CAR-T聯(lián)合化療、放療和其他免疫療法的有效性和安全性。實體瘤具有豐富的腫瘤基質(zhì)，CAR-T細胞必須滲透到腫瘤基質(zhì)中才能發(fā)揮抗腫瘤作用，這可能解釋了為何CAR-T療法在實體瘤中的療效不及血液腫瘤。CAR-T療法的一個關鍵點是選擇腫瘤特異性抗原，然而目前研究的大多數(shù)腫瘤抗原是腫瘤相關抗原，其雖在腫瘤細胞中高表達，但在正常組織中也有表達，因此攻擊腫瘤組織的CAR-T細胞也會對正常組織或器官造成損害。對此我們在CAR-T設計優(yōu)化方面提出一些見解：1)提高靶點選擇的針對性和特異性；2)開發(fā)利用多靶點CAR-T技術，減少脫靶效應；3)利用細胞因子受體提高CAR-T細胞的趨化性；4)增強對腫瘤免疫抑制微環(huán)境的抵抗力；5)增強CAR-T的安全性，一些“開關”設計已被開發(fā)并用于患者，可選擇性地控制CAR-T細胞的激活或失活，降低與CAR-T相關的副作用。

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