田雅晴，王婉潔，郝海生，鄒惠影，龐云渭，趙學(xué)明，趙善江，朱化彬，杜衛(wèi)華

（中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院北京畜牧獸醫(yī)研究所，家畜胚胎工程與繁殖創(chuàng)新團(tuán)隊，北京 100193）

體外成熟卵母細(xì)胞的質(zhì)量及其發(fā)育潛力顯著低于體內(nèi)卵母細(xì)胞[1]，原因是在體外成熟過程中，卵母細(xì)胞易受培養(yǎng)液成分、代謝物、溫度、濕度、CO2濃度、氧濃度、光照等外界環(huán)境因素影響[2]；其中，代謝、光照、高氧濃度和體外操作等均能產(chǎn)生活性氧（Reactive Oxygen Species，ROS），而ROS 過量積累是卵母細(xì)胞損傷、成熟質(zhì)量差，甚至胚胎發(fā)育停滯的主要原因[3]。因此，多種抗氧化劑常被添加于卵母細(xì)胞的成熟和培養(yǎng)體系中以提高卵母細(xì)胞的成熟率和胚胎的體外發(fā)育率，以及胚胎質(zhì)量[4]。

褪黑素（Melatonin）是由哺乳動物和人類松果體分泌的神經(jīng)內(nèi)分泌激素，是神經(jīng)-激素-免疫復(fù)雜網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)中的成員，參與疾病感染、炎癥、抗癌細(xì)胞增殖和自身免疫等過程[5]。同時，褪黑素也是一種強(qiáng)有力的內(nèi)源性抗氧化劑，能保護(hù)生物免受氧化應(yīng)激，提高機(jī)體的免疫力[6]和抗衰老[7]。對于卵母細(xì)胞，褪黑素不僅能通過顆粒細(xì)胞參與卵母細(xì)胞的成熟調(diào)控，而且能通過卵母細(xì)胞膜上的褪黑素受體（Melatonin Receptor 1a and 1b，MT1 和MT2）調(diào)控卵母細(xì)胞的成熟[8]。此外，褪黑素還能調(diào)控胞內(nèi)的線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、紡錘體等細(xì)胞器的動態(tài)分布，改善其功能，最終促進(jìn)卵母細(xì)胞的成熟及其胚胎的發(fā)育[9]。本文圍繞褪黑素的抗氧化特性，綜述其對卵母細(xì)胞及細(xì)胞器的保護(hù)作用和相關(guān)機(jī)制的研究進(jìn)展，為其在動物胚胎生產(chǎn)和動物繁殖中更廣泛的應(yīng)用提供參考。

1 褪黑素概述

作為一種神經(jīng)內(nèi)分泌激素，褪黑素（N-乙酰-5-甲氧基色氨酸）廣泛分布在大腦、視網(wǎng)膜和胃腸道等機(jī)體各部位[10-11]。除調(diào)節(jié)晝夜節(jié)律的功能外，褪黑素還具有免疫調(diào)節(jié)、抗衰老和抗氧化等作用[12]。褪黑素是高親脂性和部分親水性的化合物，可穿過各種生理屏障[13]。褪黑素能有效清除ROS，增強(qiáng)細(xì)胞內(nèi)抗氧化酶活性，從而緩解過量ROS 對脂質(zhì)、蛋白質(zhì)和DNA 的損傷[14]，抵抗氧化應(yīng)激，維持細(xì)胞穩(wěn)態(tài)[15]。此外，褪黑素還可以通過其特異性受體MT1 和MT2 調(diào)節(jié)多種生理過程[16]。

2 褪黑素對卵母細(xì)胞及其細(xì)胞器的抗氧化保護(hù)

家畜卵母細(xì)胞的成熟對早期胚胎的發(fā)育至關(guān)重要，而卵母細(xì)胞的成熟包括核成熟和質(zhì)成熟，其中質(zhì)成熟分為細(xì)胞器成熟和分子成熟2 個方面。細(xì)胞器成熟是指在卵母細(xì)胞成熟過程中，細(xì)胞器的位置發(fā)生動態(tài)變化，如皮質(zhì)顆粒遷移到皮質(zhì)區(qū)、線粒體向胞質(zhì)中央?yún)^(qū)擴(kuò)散、高爾基體和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)消失等。褪黑素易于穿透細(xì)胞膜，分布在細(xì)胞器中清除ROS，發(fā)揮保護(hù)作用，并維護(hù)細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)。

2.1 褪黑素對卵母細(xì)胞的保護(hù) 已有研究表明，在牛、羊、豬和小鼠等動物的卵母細(xì)胞體外成熟過程中添加褪黑素會促進(jìn)卵母細(xì)胞發(fā)育[17]，在小鼠卵母細(xì)胞的成熟液中添加10-6mol/L 褪黑素后卵母細(xì)胞的成熟率提高21%[18]。另外，褪黑素能保護(hù)卵母細(xì)胞免受有毒物質(zhì)產(chǎn)生的大量ROS 所造成的氧化損傷[19]。苯并芘（Benzo（a）perylene，BaP）是廣泛存在于環(huán)境中的致癌物，可使豬卵母細(xì)胞的體外成熟率從66%降低到23%，受精率從62%降低到27%；體外成熟液中添加褪黑素后，卵母細(xì)胞的成熟率和受精率分別提高到56%和47%，有效改善了暴露在BaP 環(huán)境中豬卵母細(xì)胞的質(zhì)量[20]。另外，褪黑素可清除豬卵母細(xì)胞衰老過程中產(chǎn)生的ROS，抑制促凋亡基因BAX和BAD的表達(dá)，減少卵母細(xì)胞凋亡，改善其質(zhì)量[21]。

2.2 褪黑素對線粒體的保護(hù) 線粒體是細(xì)胞中合成三磷酸腺苷（Adenosine Triphophate，ATP）的細(xì)胞器，參與細(xì)胞分裂、分化、凋亡等活動[22]。線粒體的分布、膜電位（Mitochondrial Membrane Potential，MMP）及其DNA（Mitochondrial DNA，mtDNA）拷貝數(shù)是判斷線粒體功能和卵母細(xì)胞質(zhì)量的重要指標(biāo)。卵母細(xì)胞階段，早期的線粒體為圓形或橢圓形，主要分布于皮質(zhì)區(qū)；卵母細(xì)胞成熟后，線粒體向胞質(zhì)中心擴(kuò)散，均勻分布于核周圍。

在卵母細(xì)胞中，線粒體內(nèi)的褪黑素濃度最高，有維持線粒體正常功能的作用[23]。研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素能使牛卵母細(xì)胞中線粒體的正常分布率提高10%，mtDNA拷貝數(shù)增加，線粒體活性增強(qiáng)[24]。魚藤酮（Rotenone）是一種廣泛應(yīng)用的農(nóng)業(yè)殺蟲劑，可誘導(dǎo)線粒體毒性，進(jìn)而破壞生殖系統(tǒng)，影響卵母細(xì)胞成熟、排卵和受精；而褪黑素不僅可以增加線粒體MMP，促進(jìn)ATP 的產(chǎn)生和降低ROS 水平，還可以提高線粒體發(fā)生基因沉默信息調(diào)節(jié)因子1（Silent Information Regulator l，SIRT1）和過氧化物酶體增殖物激活受體γ輔激活因子1α（Peroxisome Proliferator-Activated ReceptorγCoacti vator-1α，PGC-1α）的表達(dá)，降低線粒體的氧化應(yīng)激和細(xì)胞凋亡率，最終消除魚藤酮誘導(dǎo)的線粒體功能異常、ATP 缺乏和胚胎發(fā)育障礙[25]。胞內(nèi)Ca2+含量是反映線粒體功能的重要指標(biāo)之一，MMP 和Ca2+的儲存與許多維持細(xì)胞內(nèi)穩(wěn)態(tài)的線粒體過程密切相關(guān)，Ca2+含量過高會導(dǎo)致線粒體和細(xì)胞的損傷[26]。10-5mol/L 褪黑素處理可誘發(fā)人卵母細(xì)胞中Ca2+水平降低和MMP 升高，表明褪黑素對線粒體功能的保護(hù)作用[27]。豬卵母細(xì)胞成熟過程中褪黑素能逆轉(zhuǎn)黃曲霉素B 對mtDNA 復(fù)制和線粒體發(fā)生的抑制作用，進(jìn)而恢復(fù)線粒體的正常功能和卵母細(xì)胞的正常成熟[28]。小鼠卵母細(xì)胞線粒體中合成的大量褪黑素通過提高mtDNA 拷貝數(shù)、MMP 值、線粒體正常分布率、ATP 合成和紡錘體的正常裝配來改善線粒體的功能，促進(jìn)卵母細(xì)胞的體外成熟[29]。

2.3 褪黑素對內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的保護(hù) 內(nèi)質(zhì)網(wǎng)是細(xì)胞中重要的細(xì)胞器，包括滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)和粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)[30]，前者負(fù)責(zé)Ca2+的儲存及調(diào)節(jié)、脂質(zhì)合成，后者負(fù)責(zé)蛋白質(zhì)的合成、折疊、修飾及轉(zhuǎn)運(yùn)[31]。在卵母細(xì)胞成熟過程中，粗面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)逐漸減少，成熟后完全消失，滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)數(shù)量增加。內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的分布隨卵母細(xì)胞發(fā)育階段的不同而動態(tài)變化，在生發(fā)泡（Germinal Vesicle，GV）期卵母細(xì)胞中，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)由微管和動力蛋白的作用均勻分布在細(xì)胞質(zhì)[32]；在第2 次減數(shù)分裂中期（Metaphase II，MII）期時，由微絲作用使內(nèi)質(zhì)網(wǎng)呈網(wǎng)狀網(wǎng)絡(luò)延伸到整個細(xì)胞，但主要集中分布于皮質(zhì)區(qū)[33]。在脅迫條件下，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)內(nèi)蛋白質(zhì)合成、運(yùn)輸障礙或Ca2+的攝取/釋放紊亂時，其腔內(nèi)堆積的大量未折疊或錯誤折疊的蛋白將引起內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激（Endoplasmic Reticulum Stress，ERS），并誘導(dǎo)未折疊蛋白反應(yīng)（Unfolded Protein Response，UPR），導(dǎo)致卵母細(xì)胞老化、凋亡，降低動物繁殖力[34]。所以，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的重新分布和結(jié)構(gòu)變化是卵母細(xì)胞胞質(zhì)成熟的標(biāo)志。

在體外培養(yǎng)過程中，多種因素都能影響卵母細(xì)胞中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的功能和蛋白質(zhì)合成，導(dǎo)致ERS 和UPR 信號通路激活[35]。研究發(fā)現(xiàn)，褪黑素能促進(jìn)牛卵母細(xì)胞成熟過程中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的正常分布，提高受精率和發(fā)育率[9]。另外，ERS 通常伴隨著其他應(yīng)激反應(yīng)，尤其是氧化應(yīng)激[36]。ERS 本身誘導(dǎo)ROS 的產(chǎn)生，而ROS 也參與ERS 和UPR 信號激活[37]。豬卵母細(xì)胞內(nèi)ROS 增加會破壞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的重新分布和Ca2+的動態(tài)平衡，影響卵母細(xì)胞的胞質(zhì)成熟[38]。在豬卵母細(xì)胞的體外成熟過程中，UPR基因的表達(dá)逐漸增強(qiáng)，激活UPR 信號通路；而褪黑素不僅通過調(diào)節(jié)UPR 信號通路來減輕ERS，促進(jìn)豬卵母細(xì)胞成熟[39]，還可抑制ERS 標(biāo)志基因CCAAT/增強(qiáng)子結(jié)合蛋白同源蛋白（CCAAT/Enhancer Binding Protein Homologous Protein，CHOP）和葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78（Glucose-Regulated Protein 78，GRP78）的表達(dá)，緩解棕櫚酸誘導(dǎo)的小鼠顆粒細(xì)胞凋亡[40]。氧化應(yīng)激通過引起ERS 誘發(fā)人子宮內(nèi)膜異位癥患者中卵巢顆粒細(xì)胞的衰老，并造成不孕；而褪黑素處理能緩解顆粒細(xì)胞ERS、細(xì)胞衰老、MMP 和ATP 異常，可作為該不孕癥的輔助治療方法[41]?？梢姡屎谒赝ㄟ^抑制ERS 來保護(hù)卵母細(xì)胞，減少細(xì)胞凋亡和死亡。

2.4 褪黑素對紡錘體的保護(hù) 紡錘體是由微管、著絲粒和染色體組成的細(xì)胞器，負(fù)責(zé)細(xì)胞分裂時染色體的準(zhǔn)確分離[42]。在有絲分裂中，紡錘體由中心體成核的微管形成，而減數(shù)分裂中的紡錘體沒有中心體，因此卵母細(xì)胞中紡錘體的形成由著絲粒和微管組織中心主導(dǎo)[43]。紡錘體對卵母細(xì)胞染色體的排列、分離和極體的排出具有重要意義[44]，同時紡錘體出現(xiàn)是卵母細(xì)胞成熟的標(biāo)志[45]。

由脫氧雪腐鐮刀菌烯醇（Deoxynivalenol，DON）引起的氧化應(yīng)激使小鼠卵母細(xì)胞中乙?；⒐艿鞍椎乃斤@著降低，進(jìn)而破壞動粒與微管的附著和紡錘體形成，誘發(fā)同源染色體排列和分離異常；而褪黑素能改善DON 誘發(fā)的各種異常表現(xiàn)，紡錘體正常形成[46]。廣泛存在于食物中的赭曲霉毒素（Ochratoxina，OTA）通過阻滯細(xì)胞分裂周期蛋白（Cell Division Cycle 2，CDC2）介導(dǎo)的細(xì)胞周期進(jìn)程而影響卵母細(xì)胞極體的排出，同時通過降低絲裂原活化蛋白激酶（Mitogen-Activated Protein Kinase，MAPK）的表達(dá)而破壞紡錘體的形成；褪黑素處理后豬卵母細(xì)胞的紡錘體正常形成，細(xì)胞周期進(jìn)程也恢復(fù)正常[47]。小鼠的重復(fù)超數(shù)排卵誘發(fā)卵母細(xì)胞的氧化應(yīng)激，影響紡錘體組裝，顯著降低成熟率；而褪黑素能有效改善卵母細(xì)胞質(zhì)量[48]。另外，褪黑素能緩解冷凍-解凍過程導(dǎo)致的小鼠卵母細(xì)胞中紡錘體形態(tài)異常，提高紡錘體組裝檢驗點相關(guān)基因的表達(dá)，例如單極紡錘體蛋白激酶1（Monopolar Spindle 1，MPS1）、苯并咪唑出芽抑制解除物蛋白1 相關(guān)激酶（Budding Uninhibited by Benzimidazoles 1 Related Protein Kinase，BUBR1）、有絲分裂阻滯缺陷蛋白1（Mitotic Arrest-Deficient Protein 1，MAD1）和MAD2，提高解凍后卵母細(xì)胞的體外成熟率[49]。再者，褪黑素通過SIRT2調(diào)控的H4K16 去乙酰化途徑改善豬老化卵母細(xì)胞中紡錘體和染色體的異常裝配，及異倍體后代的產(chǎn)生[47]。所以，褪黑素是保護(hù)紡錘體免受氧化應(yīng)激損傷的重要物質(zhì)。

2.5 褪黑素對皮質(zhì)顆粒分布的影響 皮質(zhì)顆粒是卵母細(xì)胞特有的細(xì)胞器，來源于高爾基體或滑面內(nèi)質(zhì)網(wǎng)[50]，圓形、外包質(zhì)膜，其中含多種酶和糖基化物質(zhì)，與防止多精受精有關(guān)[51]。GV 期的牛卵母細(xì)胞中，皮質(zhì)顆粒成簇分布在胞質(zhì)，在MII 期則遷移至皮質(zhì)區(qū)[52]。所以，皮質(zhì)顆粒的正常分布是卵母細(xì)胞成熟的特征，其異常分布會降低胞質(zhì)成熟的質(zhì)量，造成多精受精而導(dǎo)致流產(chǎn)。

皮質(zhì)顆粒遷移和分布依賴于微絲的結(jié)構(gòu)蛋白——肌動蛋白、肌球蛋白及微絲的網(wǎng)絡(luò)系統(tǒng)[53]。暴露于百草枯（Paraquat，PQ）的牛卵母細(xì)胞中，皮質(zhì)顆粒分布異常的比例增加，胞質(zhì)成熟質(zhì)量下降，導(dǎo)致受精時無法進(jìn)行正常的皮質(zhì)顆粒胞吐，受精能力和胚胎發(fā)育能力降低；而褪黑素能夠有效改善皮質(zhì)顆粒的異常分布，提高卵母細(xì)胞的成熟率和胚胎發(fā)育能力[54]。老化的小鼠卵母細(xì)胞存在皮質(zhì)顆粒密度顯著減少、透明帶硬化程度增加和受精能力下降等問題，而褪黑素能夠顯著改善上述情況，同時降低胞內(nèi)ROS 水平，抑制細(xì)胞凋亡，提高其受精能力，延緩卵母細(xì)胞老化[55]；褪黑素也能夠顯著降低紡錘體的異常組裝和皮質(zhì)顆粒異常分布的老化牛卵母細(xì)胞的比例，改善卵母細(xì)胞質(zhì)量[56]。BaP 通過損傷減數(shù)分裂相關(guān)的細(xì)胞器如紡錘體的裝配、肌動蛋白的動力特性和線粒體的完整性等造成豬卵母細(xì)胞不能恢復(fù)減數(shù)分裂，同時引發(fā)皮質(zhì)顆粒和卵磷脂的異常分布，導(dǎo)致卵母細(xì)胞的受精率低下；而褪黑素能減輕BaP 帶來的負(fù)面影響，提高卵母細(xì)胞的體外成熟質(zhì)量，減輕環(huán)境對動物繁殖系統(tǒng)的毒害作用[20]。

3 小 結(jié)

綜上，褪黑素可減少氧化應(yīng)激對線粒體、內(nèi)質(zhì)網(wǎng)、紡錘體和皮質(zhì)顆粒等細(xì)胞器造成的損傷，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，促進(jìn)動物卵母細(xì)胞的體外成熟和胚胎發(fā)育，為褪黑素在動物胚胎生產(chǎn)和家畜繁殖領(lǐng)域中更廣泛的應(yīng)用提供參考。