戶乃麗 徐曉雪 鄒林樾 田 蜜 趙君朋

(首都醫(yī)科大學中心實驗室，北京100069)

肝臟含有豐富的免疫細胞一枯否細胞(Kupffer Cells，KCs)細胞，KCs是組成機體單核一巨噬細胞系統(tǒng)最大的群體。KCs具有吞噬、免疫調節(jié)及監(jiān)視等功能，2在肝臟的炎性反應、缺血再灌注損傷、移植免疫等方面發(fā)揮著重要作用[1-3]。小鼠KCs以其表面表達 F4/80、CD11b、CD68 和 C 型凝集素結構域家族4成員F為特征表[4,5]。KCs具有異質性、極化性，盡管各型巨噬細胞均表達F4/80，但根據(jù)其來源和環(huán)境的不同KCs存在多種表型和亞群，各型之間也可相互轉化，相對于選擇性貼壁法和磁珠分選法，流式細胞分選在多參數(shù)細胞亞群識別上有著更好的應用。目前，流式細胞分選廣泛應用于血液或脾臟，肺臟等組織器官上目的細胞的篩選[6-8]，本實驗擬利用密度梯度離心結合流式細胞4色標記分選純化KCs，探索適宜KCs分選的實驗條件并對分選后的KCs進行活性、表型及功能的檢測。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

BALB/c小鼠(10只雄性)，SPF級，體質量28～30g，5～6 周齡，購于大學實驗動物部。

1.2 試劑與儀器

膠原酶IV、臺盼藍試劑外購；RPMI-1640培養(yǎng)基、胎牛血清外購；OptiprepTM 密度梯液、7-AAD染料、CD45-BV421、CD11b-APC、F4/80-PE、CD86-FITC、CD206AF700抗體外購；FITC熒光微珠外購；小鼠TNF-α、IL-1βELISA試劑盒外購；流式細胞胞儀質控CST微球、Accudrop beads外購；實驗所用儀器為BDAriaIII型流式細胞分選儀，配有488nm、561nm、633nm、405nm 4只激光器。

1.3 實驗方法

1.3.1肝細胞懸液的制備

膠原酶灌注：小鼠給予100g/mL水合氯醛0.3mL腹腔注射，麻醉后消毒皮毛剪開腹腔，暴露肝臟門靜脈，門靜脈穿刺并縫合固定，于常溫緩慢注入D-Hanks液(無Ca2+，Mg2+，Ph=7.4)至肝臟膨大為原來的2倍大，剪斷下腔靜脈，肝臟血液被沖出回縮后，繼續(xù)灌注D-Hanks溶液20mL至肝臟變?yōu)榘咨?。將肝臟取出置于平皿中，用含37℃0.05%IV型膠原酶D-Hanks溶液灌注5mL/min 灌注10min，肝組織逐漸松散塌陷，用滴管吹打，使細胞脫落呈懸液狀態(tài)，200目尼龍濾網(wǎng)過濾收集肝細胞懸液。

1.3.2密度梯度離心分離肝臟非實質細胞

灌注分離出的單細胞懸液，4℃50g離心2～3次，棄沉淀，將上清液500g 離心10min，棄上清，細胞沉淀RPMI-1640 培養(yǎng)基懸浮，清洗一遍并重懸，樣品即可用于梯度離心。15mL離心管，依次加入17.6%的OptiprepTM 液5mL，11.2% 的OptiprepTM 液5mL，頂層加PBS懸浮細胞懸液3mL，常溫 1400g離心15 min。收集介于17.6% 與11.2% OptiprepTM液之間的非實質細胞[9]，加入RPMI-1640 培養(yǎng)基10ml重懸細胞，4℃，1000g 離心10min，棄上清，然后重懸細胞，得到肝臟非實質細胞懸液。

1.3.3流式細胞染色及分選

取分離的細胞5×105細胞，用100mlPBS定容懸浮，F(xiàn)c-R 阻斷劑封閉后依次加入BV421標記的CD45、PE標記的F4/80、APC標記的CD11b抗體各1μl，冰上避光孵育1h，加入PBS離心洗滌2次后棄上清，將細胞懸液加PBS定容至400μl，加入1μl 7-AAD混勻待上機檢測分選。流式細胞儀鞘液桶和水桶用75%酒精浸泡消毒4h以上，用純水沖洗干凈，鞘液桶中加入無菌PBS，開機打開FACSDiva軟件并運行開機程序，安裝85μm噴嘴，分選電壓4500V，F(xiàn)req設定為47.4，調節(jié)液滴振幅Ampl值使液流處于穩(wěn)定狀態(tài)，第一滴液流斷點位置Drop1為345，Gap為9，選中主液流框的sweet spot鍵，維持液流穩(wěn)態(tài)。上樣Accudrop beads微球調節(jié)Drop delay數(shù)值為30.31，微球在initial或fine tune分選模式下側液流偏轉都達到99%以上。上樣后通過空白和陰性對照管圈定目的細胞群，采用purity模式分選7AAD-CD45+CD11b+F4/80+的KCs，接收管中預置0.5mL培養(yǎng)基接收分選所得細胞。

1.3.4分選后純度及細胞存活率檢測

吸取100μL分選后的細胞上流式細胞儀，在原分選方案中檢測分選后細胞的純度。另吸取新提取的細胞懸液按9∶1比例加入0.4% 臺盼藍溶液充分混勻后。加入改良的牛鮑計數(shù)板，顯微鏡下觀察細胞見未被染色細胞為活細胞。

1.3.5分選后KC表面標志物的檢測

分選后的細胞離心去除上清液PBS，調整體積至100μL，F(xiàn)cR阻斷劑封閉后孵育抗體CD206AF700、CD86FITC，根據(jù)同型抗體染色情況確定CD206，CD86陽性細胞比例。由于分選后的細胞為CD45BV421、F4/80PE、CD11bAPC陽性的細胞，所以檢測時應注意各檢測光路熒光補償?shù)恼{節(jié)。

1.3.6分選后細胞吞噬功能的檢測

分選后的細胞離心沉淀去上清，沉淀的細胞用含青鏈霉素的PRMI1640培養(yǎng)基重懸，調整細胞數(shù)量為1×106/mL，取0.5mL細胞接種于12孔板中，置于5%CO2，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)12h后，每孔加入2μL FITC標記的熒光微球，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育2h,然后細胞用0.25%的胰酶消化，PBS洗3次，流式細胞儀檢測細胞吞噬熒光微球情況。

1.3.7KCs的促炎性反應

分選后的細胞按照5×105接種入12孔板，培養(yǎng)24h后培養(yǎng)基中加入LPS，作用濃度為1μg/mL，分別于0h，8h收集上清液，ELISA法檢測TNF-α、IL-1β水平變化。

1.4 統(tǒng)計學處理方法

采用SPSS20.0 軟件進行統(tǒng)計分析。計量資料以 ±s 表示，進行單因素方差分析。P <0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 流式細胞儀檢測分選KCs純度

密度梯度分離后的細胞經(jīng)7-AAD染色排除死細胞后，CD45+CD11b+F4/80+占CD45+細胞比例為58.4±3.6%，F(xiàn)ACS分選后比例提升為96.1±1.8%，兩者比較差異存在統(tǒng)計學意義(P<0.05)，見圖1。圖1A、圖1B為分選前后CD45+CD11b+F4/80+各檢測門的單次檢測結果。

圖1 分選前后7-AAD-CD45+CD11b+F4/80+細胞純度對比A,B.分選前后流式結果圖; C.分選前后KCs純度百分比﹡P<0.05

2.2 分選后KC數(shù)量和存活率

平均每只小鼠分選獲得KCs細胞數(shù)為1.86±0.29×106/小鼠，臺盼藍染色顯示分選后細胞存活率為96.5±2.1%，細胞形態(tài)良好。

2.3 分選后KC吞噬功能

與FITC熒光微球共孵育2h后，流式細胞儀檢測84.7±3.6%的KCs呈現(xiàn)出了吞噬熒光微球的情況，如圖2所示。

2.4 KCs表面標志物的檢測

流式細胞術檢測正常小鼠肝臟KCs結果顯示，分選后的CD11b+F4/80+細胞中，CD86的表達為92.3±1.6%，CD206為2.1±0.8%，說明分選后所得為CD86+CD206-細胞群，圖3所示。

圖2 分選后KCs吞噬熒光微球情況A.正常KCs；B.與熒光微球共培養(yǎng)2 h后的KCs

圖3 A,B顯示KCs分選后 CD86，CD206表達情況﹡﹡P<0.01

2.5 KCs TNF-α，IL-1β表達情況

LPS刺激8h后，KCs被激活，釋放炎性因子，細胞上清液中TNF-α、IL-1β均高于刺激前(P <0.001)，見表1。

表1 LPS刺激后KCs炎性因子表達水平(x±s，pg/mL，n=3)

3 結論

目前對于KCs的分離純化除流式細胞分選外，密度梯度離心結合貼壁法或免疫磁珠分選法也是分離KCs分離純化法，可純化單一成分的KCs[10]或同時分離肝臟純化星狀細胞、肝實質細胞和KCs[11,12]。相對于流式分選，貼壁法或磁珠分選法的優(yōu)勢在于細胞不受液流壓力和電荷刺激的影響，有利于維持細胞活性和狀態(tài)，缺點在于無法精確定位到某一特定亞群細胞的分選。流式細胞儀配有多激光多檢測通路，能夠多參數(shù)識別目的細胞，也可基于標記物的表達水平進行分選，分選過程中需要根據(jù)細胞的大小及對液流壓力的耐受能力選擇合適的噴嘴。對于FACSAriaⅢ型流式細胞儀分選KCs，選擇85μm噴嘴，控制上樣速度為8000～10000evts/s，是較適宜的分選條件，得到的KCs細胞數(shù)量和活力俱佳。上樣速度過高會使得分選回收率下降，造成部分陽性細胞被丟棄，分選速度過低會延長分選時間，不利于維持細胞活性。在流式細胞儀分選設置上，首先要注意調節(jié)穩(wěn)定的液流參數(shù)，液流的穩(wěn)定是保證分選準確進行的基礎，分選過程中開啟液流“sweet spot”模式，一旦液流不穩(wěn)定時分選能夠自動中止，防止液滴飛濺影響收集管中細胞的純度。此外，液滴延遲的調節(jié)是十分重要，可自動結合手動重復調節(jié)確定正確的Drop delay數(shù)值，一旦液流參數(shù)發(fā)生變化，需要重新校準Drop delay。

在制備肝臟單細胞懸液過程需要膠原酶的消化，灌注溫度、膠原酶溶液濃度和肝臟灌注膠原酶總劑量對KCs F4/80抗原表達存在影響[13]。消化后的細胞經(jīng)過密度梯度離心，可以去除大部分的碎片和肝臟實質細胞，但是處理過程中不可避免會產(chǎn)生死細胞，因此在流式染色方案中需要加入識別細胞死活的染料，本實驗中采取的是核酸染料7-AAD，利用561nm激光激發(fā)可良好地排除死細胞染色，有利于分選后細胞的純度。

KCs在不同的環(huán)境下具有不同的表型，其中M1 和M2b 型巨噬細胞特異性表達CD86，而M2a 和M2c 型巨噬細胞表達CD206 /CD163[14]，CD86是T淋巴細胞活化抗原，通過結合CD28或CTLA-4參與共同刺激信號傳遞，對T淋巴細胞增殖必不可少，CD206是一種甘露糖受體，介導巨噬細胞吞噬抗原，啟動免疫反應，實驗所用動物為正常小鼠，肝內KCs分選后顯示為CD86+CD206-細胞。

KCs是機體防御的主要效應細胞，主要功能是內吞，抗原提呈及分泌生物活性物質，為從功能學角度鑒定KCs，采取了吞噬實驗和LPS刺激實驗。結果表明，(84.7±3.6)%的細胞吞噬了熒光微球，并且經(jīng)LPS刺激后TNF-α、IL-1β分泌顯著提高，提示KCs分選后細胞功能良好。

本實驗所得的細胞為高純度的KCs細胞，由于抗體特異性，分選后細胞幾乎不存在內皮細胞和星型細胞混雜的情況，因此分選后接種培養(yǎng)，1 h后細胞基本貼壁，呈圓形，培養(yǎng)12h后細胞呈多邊形，呈現(xiàn)出良好的生長狀態(tài)，為后續(xù)與KCs相關的多種實驗研究奠定了細胞學基礎。