陳敏純 張婧一 鄭 潔 王 新 劉生元 曹 青 閆抗抗

(西北大學(xué)附屬醫(yī)院/西安市第三醫(yī)院藥劑科，西安 710018)

維生素(Vitamin)是維持人體健康的必需微量元素，其以酶或輔酶的形式參與人體新陳代謝過程，調(diào)節(jié)人體的生長、發(fā)育[1]。維生素A、25-OH-D2、25-OH-D3、維生素E是脂溶性維生素，因人體不能合成或合成的維生素極其微量，只能從食物中攝取。脂溶性維生素?cái)z取不足或缺乏，易導(dǎo)致人體生理機(jī)能、新陳代謝、細(xì)胞調(diào)節(jié)等障礙，誘發(fā)多種疾病[2-4]。一般而言，成人均衡膳食無需額外補(bǔ)充脂溶性維生素，但特殊人群如孕婦，老年人，骨質(zhì)疏松患者以及兒童普遍缺乏維生素，若盲目補(bǔ)充大量，易蓄積致中毒。如早期妊娠婦女?dāng)z取大量維生素A(攝入量≥10000IU)增加?jì)雰撼錾毕蒿L(fēng)險(xiǎn)[5]。對于存在營養(yǎng)吸收障礙者、有肝臟疾病者以及炎癥性腸病者或生長遲緩兒童，應(yīng)常規(guī)監(jiān)測脂溶性維生素的濃度。對于這些特殊人群者，通常每6個(gè)月監(jiān)測1次，具體監(jiān)測頻率取決于疾病的嚴(yán)重程度[6]。故科學(xué)、精準(zhǔn)的檢測人體脂溶性維生素含量，可準(zhǔn)確評估、篩查脂溶性維生素維生素異常狀態(tài)，針對性進(jìn)行個(gè)體化調(diào)整補(bǔ)充，提高維生素治療的安全性有效性。本實(shí)驗(yàn)研究建立LC-MS/MS法同時(shí)測定人體血清中脂溶性維生素A、25-OH-D2、25-OH-D3、E的質(zhì)量濃度，所需樣本量少(200μL血清)，樣品前處理簡單(正己烷萃取法)，采用同位素內(nèi)標(biāo)，消除人體血清中的不同內(nèi)源性物質(zhì)對維生素檢測的基質(zhì)效應(yīng)，準(zhǔn)確度高且一次性檢測4項(xiàng)脂溶性維生素，為臨床評估脂溶性維生素含量提供可靠的檢測方法。

1 儀器與試劑

液質(zhì)聯(lián)用儀(液相色譜儀LC-30A，質(zhì)譜儀LC-MS 8040三重四級桿，LC-30AD×2 輸液泵，SIL-30AC 自動(dòng)進(jìn)樣器，CTO-20AC 柱溫箱)；色譜工作站：LabSolution；高速冷凍離心機(jī)(H2050R)；渦旋儀(MTV-100)；氮吹儀(MTN-2800D )。

甲醇為色譜級試劑；正己烷為色譜級；甲酸為色譜級純試劑；標(biāo)準(zhǔn)品維生素A、25-OH-D2、25-OH-D3、E和穩(wěn)定同位素內(nèi)標(biāo)A-d4、25-OH-D2-d6、25-OH-D3-d6、VE-d6購自于生物科技有限公司；牛血清白蛋白(BSA，9048-46-8)。

2 方法與結(jié)果

2.1 LC-MS/MS條件

色譜條件：色譜柱：Zorbax Extend-C18 柱(150 mm × 4.6 mm，5 μm，)；流動(dòng)相：A相-0.1%甲酸水溶液，B相-0.1%甲酸甲醇；梯度洗脫，0～2min，85% B相-100% B相，2～6min，100% B相；柱溫：45 ℃；流速：0.6 mL/min；進(jìn)樣量：50 μL。質(zhì)譜條件：采用ESI源正離子模式；霧化氣流量：2.5 L/min；干燥氣流量：15 L/min；DL 溫度：200 ℃；加熱塊溫度：300 ℃；用于定量分析的4種維生素和內(nèi)標(biāo)最優(yōu)的MRM參數(shù)見表1。

表1 4種維生素及其內(nèi)標(biāo)最優(yōu)的MRM參數(shù)

2.2 溶液配制

用甲醇配制2.536 mg/mL、0.200 mg/mL、0.200 mg/mL、20.480 mg/mL的VA、25-OH-D2、25-OH-D3、VE混合標(biāo)準(zhǔn)儲備液，將儲備液逐級稀釋，VA的標(biāo)準(zhǔn)工作液為0.5072、1.268、2.536、6.340、12.680、25.360 μg/mL；25-OH-D2和25-OH-D3的標(biāo)準(zhǔn)工作液為0.040、0.100、0.200、0.500、1.000、2.000 μg/mL；VE的標(biāo)準(zhǔn)工作液為4.096、10.240、20.480、51.200、102.400、204.800 μg/mL。內(nèi)標(biāo)工作液濃度為20 ng/mL。

2.3 樣品前處理

用移液器精密吸取200 μL內(nèi)標(biāo)工作液加入200 μL血清樣品，渦旋震蕩1 min，吸取900 μL 正己烷，渦旋震蕩5 min，置于4℃、12000 rpm超高速離心機(jī)中離心10 min，吸取600 μL 上清液，于氮吹儀中吹干，用100 μL的 70%甲醇水復(fù)溶，渦旋震蕩2 min，置于4℃、12000 rpm超高速離心機(jī)中離心3 min，取上清液 90 μL進(jìn)樣分析檢測。

2.4 標(biāo)準(zhǔn)曲線配制與檢測限

稱取0.4 g BSA溶于10 mL水中，配制成4% BSA溶液作為代替血清的基質(zhì)溶液，用于配制標(biāo)準(zhǔn)曲線。用移液器吸取180 μL基質(zhì)溶液，精密吸取20 μL不同濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液和200 μL內(nèi)標(biāo)工作液，依次配制成標(biāo)準(zhǔn)曲線。按“2.3”項(xiàng)下處理，分析檢測記錄VA、25-OH-D2、25-OH-D3、VE面積與內(nèi)標(biāo)色譜峰面積。峰面積比Y對濃度(X，μg/mL)進(jìn)行線性回歸(權(quán)重為1/C)，回歸方程Y=bX+a。結(jié)果表明各維生素色譜響應(yīng)的相關(guān)線性關(guān)系良好。配制20份樣品濃度VA為0.057 μg/mL、25-OH-D2為0.004 μg/mL、25-OH-D3為0.004 μg/mL、VE為0.409 μg/mL進(jìn)行分析，統(tǒng)計(jì)峰面積比，計(jì)算精密度值<20%，表明VA為0.057 μg/mL，25-OH-D2為0.004 μg/mL，25-OH-D3為0.004 μg/mL，VE為0.409 μg/mL可作為方法檢出限。各個(gè)維生素的線性范圍、直線回歸方程、線性相關(guān)系數(shù)、檢測限如表2所示。

表2 脂溶性維生素線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢測限

2.5 方法專屬性

在本試驗(yàn)條件下，檢測空白基質(zhì)溶液、空白基質(zhì)溶液加入脂溶性維生素標(biāo)準(zhǔn)品和內(nèi)標(biāo)及患者血清中脂溶性維生素和內(nèi)標(biāo)。結(jié)果表明，血清中內(nèi)源性物質(zhì)對脂溶性維生素樣品峰的測定無干擾。本方法具有較高的特異性，色譜圖見圖1。

圖1 脂溶性維生素色譜圖A.4% BSA加入高質(zhì)控樣品及內(nèi)標(biāo)；B.患者脂溶性維生素色譜圖

2.6 精密度和準(zhǔn)確度

平行制備低、中、高質(zhì)控樣品各8份，連續(xù)3d進(jìn)樣分析，計(jì)算日內(nèi)、日間精密度和準(zhǔn)確度，結(jié)果見表3。

表3 方法精密度準(zhǔn)確度及提取回收率(n=8)

續(xù)表3

2.7 回收率與基質(zhì)效應(yīng)

取180μL基質(zhì)溶液，分別吸取20 μL低、中、高質(zhì)控濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液和200 μL內(nèi)標(biāo)工作液，每個(gè)濃度分析8份樣品，按“2.3”項(xiàng)下處理，進(jìn)行分析記錄峰面積A。取180 μL水，分別吸取20 μL低、中、高質(zhì)控濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液和200 μL內(nèi)標(biāo)工作液，按“2.3”項(xiàng)下處理，進(jìn)行分析記錄峰面積B。取180 μL空白血清分別吸取20 μL低、中、高質(zhì)控濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液和200 μL內(nèi)標(biāo)工作液，按“2.3”項(xiàng)下處理，進(jìn)行分析記錄峰面積C。取180 μL空白血清，按“2.3”項(xiàng)下處理，進(jìn)行分析記錄峰面積D。A/B為本方法的基質(zhì)效應(yīng)，(C-D)/A為本方法的加標(biāo)回收率。結(jié)果見表3。

2.8 基質(zhì)溶液與空白血清的基質(zhì)一致性驗(yàn)證

分別用4% BSA 基質(zhì)溶液和空白血清依照“標(biāo)準(zhǔn)曲線配制”中的方法，配制標(biāo)準(zhǔn)曲線溶液，進(jìn)樣分析，繪制出BSA基質(zhì)標(biāo)曲Y=bX+a和血清基質(zhì)標(biāo)曲Y=b'X+a'，依據(jù)標(biāo)準(zhǔn)加入法外推X 軸負(fù)截距，計(jì)算空白血清中VA、25-OH-D2、25-OH-D3、VE的含量分別為0.4036、0.0031、0.0603、7.3964 μg/mL。分別制備空白血清及血清加入低、中、高質(zhì)控濃度的標(biāo)準(zhǔn)工作液和200 μL內(nèi)標(biāo)工作液，每個(gè)濃度分析8份樣品，按“2.3”項(xiàng)下處理，進(jìn)樣分析后根據(jù)4% BSA基質(zhì)溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算目標(biāo)物質(zhì)濃度。結(jié)果顯示，使用4% BSA 基質(zhì)溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線測定各組樣品，其檢測均值和理論值相對誤差均<15%，變異系數(shù)<15%，均在可接受范圍之內(nèi)。

2.9 臨床樣本檢測結(jié)果

應(yīng)用所建立LC-MS/MS法測定20名健康者血清中脂溶性維生素，結(jié)果范圍如表4所示。各臨床樣品測定數(shù)值均在正常范圍內(nèi)，因此該方法適用于臨床血清樣品的檢測。

表4 健康者血清脂溶性維生素檢測結(jié)果

3 討論

維生素A有多種生物學(xué)調(diào)節(jié)作用，預(yù)防干眼癥、角膜和結(jié)膜發(fā)育異常，同時(shí)對眼部的細(xì)胞分化有重要作用。根據(jù)世界衛(wèi)生組織2018年數(shù)據(jù)顯示，全球5歲以下兒童的VA缺乏癥患病率約為30%，許多營養(yǎng)不良的兒童和成人出現(xiàn)夜盲癥、失明和干眼癥。VA缺乏癥的診斷是通過其臨床表現(xiàn)，若測量血清VA濃度低于0.2 μg/mL也可支持診斷[7]。維生素E是保護(hù)細(xì)胞膜免受氧化和破壞。VE缺乏可導(dǎo)致溶血、神經(jīng)肌肉疾病、共濟(jì)失調(diào)和周圍神經(jīng)病變。由于人類飲食中含有豐富的VE，VE缺乏癥很少見，除非患有膽汁淤積性肝病、胰腺功能不全或其他導(dǎo)致脂肪吸收障礙或蛋白質(zhì)吸收不良的人，對于有維生素E缺乏風(fēng)險(xiǎn)因素的患者需常規(guī)監(jiān)測VE含量。維生素D除了在鈣和骨穩(wěn)態(tài)中發(fā)揮作用以外，其還調(diào)節(jié)細(xì)胞增殖、免疫和肌肉功能、皮膚分化和生殖以及血管和代謝特性[8]。維生素D缺乏(血清25-OH-D濃度 <20 ng/mL)會加速骨轉(zhuǎn)換、骨丟失和骨質(zhì)疏松性骨折。若大劑量補(bǔ)充維生素D使血清25-OH-D濃度超過50 ng/mL，則會增加跌倒風(fēng)險(xiǎn)[9]。25-OH-D2和25-OH-D3是25-OH-D的兩種形式，他們具有不同強(qiáng)度的生物學(xué)調(diào)節(jié)作用，研究認(rèn)為應(yīng)對這兩種形式進(jìn)行分別檢測，在美國國家標(biāo)準(zhǔn)和技術(shù)研究院(National Institute for Standards and Technology,NIST)標(biāo)準(zhǔn)下，LC-MS/MS技術(shù)是測定維生素D為最準(zhǔn)確的技術(shù)[10]，而應(yīng)用免疫法則無法區(qū)分25-OH-D2和25-OH-D3。因此，應(yīng)用LC-MS/MS技術(shù)不僅可區(qū)分和定量25-OH-D不同亞型，也可同時(shí)檢測多種脂溶性維生素，為臨床醫(yī)生對維生素異常者進(jìn)行醫(yī)學(xué)干預(yù)提供重要的參考意義。

脂溶性維生素在人體中含量差異大，如VA和VE在正常人中含量高達(dá)μg/mL級別，而25-OH-D2和25-OH-D3則為ng/mL級別，LC-MS/MS技術(shù)同時(shí)檢測這幾種化合物不僅可滿足其高靈敏度需求，也同時(shí)滿足線性相關(guān)性。因脂溶性維生素的官能團(tuán)和分子結(jié)構(gòu)不同，導(dǎo)致其極性差異大，VA、25-OH-D2和25-OH-D3的極性相對較強(qiáng)，在色譜柱上易被洗脫，而VE則極性較弱，難以被洗脫，故本研究流動(dòng)相采用梯度洗脫，0.1%甲酸甲醇溶液由85%逐步上升到100%進(jìn)行洗脫。此外，本研究采用同位素內(nèi)標(biāo)，以消除人體血清中的不同內(nèi)源性物質(zhì)對維生素檢測的基質(zhì)效應(yīng)，大大提高檢測結(jié)果的準(zhǔn)確性。

維生素是人體內(nèi)源性物質(zhì)，正常人血清中含有一定量的脂溶性維生素，不宜使用空白血清建立標(biāo)準(zhǔn)曲線進(jìn)行定量，故本研究采用4% BSA溶液作為血清的替代基質(zhì)溶液，同時(shí)對4% BSA替代基質(zhì)溶液與血清基質(zhì)溶液進(jìn)行一致性驗(yàn)證，檢測均值和理論值相對誤差<15%，變異系數(shù)<15%，均在可接受范圍之內(nèi)。LC-MS/MS法對化合物進(jìn)行定量檢測時(shí)，在不同基質(zhì)溶液中該化合物的溶解度及離子響應(yīng)度則不同，為減小差異及影響，本研究在質(zhì)量控制技術(shù)上采用的是加標(biāo)回收率，確保試驗(yàn)技術(shù)的可靠性。

本研究通過4% BSA基質(zhì)溶液替代空白血清配制標(biāo)曲，正己烷萃取法及內(nèi)標(biāo)定量法，建立了在6 min內(nèi)測定血清中脂溶性維生素的分析方法，并按照臨床檢驗(yàn)相關(guān)指導(dǎo)原則進(jìn)行方法學(xué)驗(yàn)證。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，該方法分析速度快、準(zhǔn)確度和精密度好，適用于臨床實(shí)驗(yàn)中測定人血清中脂溶性維生素的含量，指導(dǎo)相關(guān)疾病治療及臨床合理用藥。