(上海市崇明食品藥品檢驗(yàn)所，上海 202150)

1 引言

安宮牛黃丸被譽(yù)為“中醫(yī)溫病三寶”之首，是《中國(guó)藥典》2015年版一部收載品種[1]，自《中國(guó)藥典》1977年版一部收載后，歷版藥典均有收載。

按照中醫(yī)理論分析：處方中牛黃苦涼，清心解毒，辟穢開(kāi)竅[2],在此方中具有重要意義。歷年來(lái)廣大醫(yī)藥工作者對(duì)于安宮牛黃丸的基礎(chǔ)研究、臨床應(yīng)用和藥理藥效等方面做了非常大量的研究工作，作為中醫(yī)治療高熱癥最為有效的要方，其機(jī)理已由藥理實(shí)驗(yàn)和臨床療效初步進(jìn)行了科學(xué)的闡明[3]。但是作為中醫(yī)藥獨(dú)有的礦物藥，雄黃(二硫化二砷As2S2)中含大量砷(70%)，故而被列入國(guó)家醫(yī)用藥品毒性藥品目錄。在臨床實(shí)踐和日常生活中，有關(guān)這類(lèi)中藥的毒性也經(jīng)常見(jiàn)諸報(bào)端：端午節(jié)飲用“雄黃酒”致命、長(zhǎng)期服用“牛黃解毒片”產(chǎn)生中毒癥狀，或是民間豬心加朱砂熬湯后急性中毒等，其原因主要是由于對(duì)于該類(lèi)藥物的普遍認(rèn)知不足[4]和藥物的不合理運(yùn)用。

安宮牛黃丸中的雄黃的安全性和有效性根據(jù)文獻(xiàn)報(bào)道,可對(duì)其價(jià)態(tài)砷的定量來(lái)衡量評(píng)價(jià)[4]，在了解雄黃的作用機(jī)制的基礎(chǔ)上，解決安宮牛黃丸中可溶性砷的價(jià)態(tài)檢驗(yàn)項(xiàng)目設(shè)置、方法學(xué)摸索和限度標(biāo)準(zhǔn)設(shè)定，進(jìn)行深入研究和確定合理的質(zhì)量分析方法，保障人民用藥安全。目前國(guó)內(nèi)及國(guó)際通用測(cè)定砷形態(tài)價(jià)態(tài)的主流方法為HPLC-ICPMS,該儀器在藥品檢測(cè)領(lǐng)域主要依賴進(jìn)口，購(gòu)買(mǎi)成本及后期使用成本較高，而原子熒光形態(tài)分析儀是我國(guó)具有完全自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)和生產(chǎn)能力的儀器，而且購(gòu)買(mǎi)和后期使用成本相對(duì)較低，所以開(kāi)發(fā)原子熒光形態(tài)分析儀的檢驗(yàn)檢測(cè)方法即有利于降低藥企質(zhì)控成本，又能推動(dòng)我國(guó)自主儀器研發(fā)的能力和動(dòng)力。

2 材料與方法

2.1 儀器、試劑與材料

液相聯(lián)用形態(tài)價(jià)態(tài)儀(液相泵：LUMTECH Clamflowplus；進(jìn)樣器：LUMTECH Autosampler；形態(tài)：儀器形態(tài)預(yù)處理裝置 SAP-20；原子熒光：AFS-9320)；QUINTIX224-1CN萬(wàn)分之一電子天平；BRANSON 8510超聲清洗儀；VORTEX GENIE 2渦旋振蕩儀；SIGMA 3-18K高速離心機(jī)；HPLC-ICPMS(U3000-ICAPQ)；Milli-Q A10純水機(jī)。

硝酸(色譜純)；氫氧化鉀(分析純)；硼氫化鉀(分析純)；乙二胺四乙酸二鈉(分析純)；磷酸二氫銨(分析純)；胰酶(分析純)；純水(電阻率≥18MΩ)。

砷酸根標(biāo)液(GBW08667，批次1804，純度以As計(jì)：17.5±0.4μg/g)；亞砷酸根標(biāo)液(GBW08666，批次1804，純度以As計(jì)：75.7±1.2μg/g)。

安宮牛黃丸3批：廣州某藥業(yè)有限公司(批號(hào)：X03003M，規(guī)格：每丸重3g)；杭州某藥業(yè)有限公司(批號(hào)：180407，規(guī)格每丸重3g)；北京某制藥廠(批號(hào)：17013721，規(guī)格每丸重3g)。

2.2 實(shí)驗(yàn)方法

2.2.1標(biāo)準(zhǔn)溶液的制備

精密稱(chēng)取砷酸根標(biāo)液0.5715g，亞砷酸根標(biāo)液0.1322g，置于同一個(gè)20 mL量瓶中，加水稀釋至刻度，配制成砷酸根(As5+)濃度為500ng/mL、亞砷酸根(As3+)500ng/mL(均以砷計(jì))的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。精密量取5mL置10mL量瓶中，加0.02mol/L的乙二胺四乙酸二鈉溶液至刻度制成250ng/mL(以砷計(jì))的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液。

2.2.2標(biāo)準(zhǔn)曲線制備

取250ng/mL的混合標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，通過(guò)儀器自動(dòng)調(diào)整進(jìn)樣量，稀釋制成含As5+12.5、25、50、75、125、250ng/mL，含As3+12.5、25、50、75、125、250ng/mL的系列混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別測(cè)定峰面積，以砷酸根、亞砷酸根系列標(biāo)準(zhǔn)濃度為橫坐標(biāo)，以測(cè)定的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計(jì)算標(biāo)準(zhǔn)曲線方程和相關(guān)系數(shù)。

2.2.3樣品處理

取廣州某藥業(yè)公司的安宮牛黃丸作為測(cè)試樣品，剪碎并混勻，取約0.15g，精密稱(chēng)定，置250mL量瓶中，加人工腸液5mL靜置1小時(shí)使充分膨脹后，加人工腸液適量渦旋2分鐘，再靜置半小時(shí)，再渦旋2分鐘后超聲半小時(shí)，取出渦旋2分鐘后靜置1小時(shí)，再渦旋2分鐘，靜置超聲均在37℃條件下進(jìn)行，用人工腸液定容至刻度，搖勻，取適量至50mL離心管中，靜置16小時(shí)，取中間液10mL，用10μm微孔濾膜過(guò)濾，精密量取濾液2.5mL至10mL量瓶中，加0.02mol/L乙二胺四乙酸二鈉溶液稀釋至刻度，搖勻，即得。

2.2.4儀器條件

(1)液相條件：流動(dòng)相：0.025mol/L磷酸二氫銨溶液(調(diào)節(jié)pH至6.0)；流動(dòng)相流速：1.5mL/min；色譜柱：CNWSEP AX HPLC Colum 250×4.0mm 10μm；進(jìn)樣量：滿環(huán)100μL，自動(dòng)稀釋最小進(jìn)樣量5μL。

(2)原子熒光條件：負(fù)高壓320V，總電流80mA，輔電流40mA，載氣300mL/min，屏蔽氣500mL/min。(3)形態(tài)分析儀條件：載液：5%硝酸；還原劑0.35%氫氧化鉀及2%硼氫化鉀混合溶液。

3 結(jié)果

3.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線

As3+在12.5～250ng/mL，As5+在12.5～250ng/mL的范圍內(nèi)均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系，結(jié)果見(jiàn)表1，色譜圖見(jiàn)圖1。

表1 標(biāo)準(zhǔn)曲線和相關(guān)系數(shù)

圖和標(biāo)準(zhǔn)曲線峰面積疊加譜圖

3.2 重復(fù)性和中間精密度結(jié)果

取廣州某藥業(yè)公司樣品，精密稱(chēng)取0.15g，0.3g，0.45g 3個(gè)重量梯度并每個(gè)重量梯度稱(chēng)取3份，照2.2.3進(jìn)行樣品處理，并將處理后樣品分別通過(guò)液相聯(lián)用原子熒光形態(tài)價(jià)態(tài)儀和HPLC-ICPMS測(cè)定。

表2 液相聯(lián)用原子熒光測(cè)定結(jié)果

續(xù)表2

表3 電感耦合等離子質(zhì)譜儀測(cè)定結(jié)果

續(xù)表3

3.3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果

3.3 回收率試驗(yàn)結(jié)果

取廣州某藥業(yè)公司樣品，精密稱(chēng)取9份，每份約0.15g，平均分成3組，分別加入3個(gè)濃度梯度砷酸根與亞砷酸根標(biāo)液，照2.2.3進(jìn)行樣品處理，并將處理后樣品通過(guò)液相聯(lián)用原子熒光形態(tài)價(jià)態(tài)儀測(cè)定。

圖2 液相聯(lián)用原子熒光形態(tài)價(jià)態(tài)儀測(cè)定樣品譜圖

試驗(yàn)結(jié)果表明,液相聯(lián)用原子熒光分離安宮牛黃中的價(jià)態(tài)砷的三水平加標(biāo)As3+的回收率分別為118.4%、103.3%、101.6%，As5+回收率分別為112.6%、108.5 %、102.0 %，回收率在該條件下的結(jié)果均在85%～120%之間，基本滿足藥品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)分析方法指導(dǎo)原則項(xiàng)下的準(zhǔn)確度要求[5]，具體結(jié)果見(jiàn)表4。

表4 As3+與As5+加標(biāo)回收率

3.5 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

通過(guò)同法試驗(yàn)測(cè)定，杭州某藥業(yè)公司的安宮牛黃丸As3+結(jié)果為140.3mg/kg，As5+測(cè)定結(jié)果為26.43mg/kg；北京某藥廠的安宮牛黃丸As3+結(jié)果為134.4mg/kg，As5+測(cè)定結(jié)果為24.90mg/kg。測(cè)定結(jié)果表明，這3個(gè)廠家的3批安宮牛黃價(jià)態(tài)砷的含量都處于比較安全的范圍。

4 小結(jié)與討論

本次試驗(yàn)在初期探索儀器條件時(shí)期發(fā)現(xiàn)，使用梯度洗脫時(shí)，可對(duì)4種砷的價(jià)態(tài)(砷酸根，亞砷酸根，一甲基砷、二甲基砷)進(jìn)行很好的分離，但由于安宮牛黃丸中3個(gè)批次都沒(méi)有檢出一甲基砷和二甲基砷，故最后采用了檢出能力更高的等度洗脫，穩(wěn)定性也更好。在樣品前處理方法探索時(shí)，發(fā)現(xiàn)提取液中價(jià)態(tài)砷的含量呈現(xiàn)隨時(shí)間推移從低到高再到基本穩(wěn)定的狀態(tài)，故最后確定本試驗(yàn)最終的一個(gè)樣品前處理方法。通過(guò)本次試驗(yàn)，基本建立一套完整的液相聯(lián)用原子熒光形態(tài)價(jià)態(tài)儀測(cè)定安宮牛黃丸中的模擬人體環(huán)境的可溶性形態(tài)砷的定量測(cè)定方法，即完成了對(duì)安宮牛黃丸該品種的質(zhì)量控制的完善，也為國(guó)內(nèi)儀器廠商提供了新的道路。