于 倩，張得芳 *，史文君

(1.青海大學(xué)農(nóng)林科學(xué)院，青海 西寧 810016；2.青海大學(xué)，青海省高原林木遺傳育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青海 西寧 810016)

白刺(Nitrariatangutorum)，蒺藜科白刺屬灌木，多生長(zhǎng)于荒漠和半荒漠的湖盆沙地等[1]，分枝密，根系發(fā)達(dá)，抗旱、抗風(fēng)沙、耐鹽堿[2]，具有較強(qiáng)的阻風(fēng)固沙能力[3]，其果實(shí)具有降血脂、降血壓、調(diào)節(jié)血糖、抗疲勞、提高免疫力等功效，在醫(yī)藥方面也前景較好[4]。現(xiàn)階段白刺多通過播種或扦插進(jìn)行人工繁殖，但種子繁殖生長(zhǎng)速度較緩慢，扦插受季節(jié)和植物生理周期等因素限制，而植物組織培養(yǎng)可不受環(huán)境條件和生長(zhǎng)周期的影響達(dá)到快速生長(zhǎng)、穩(wěn)定遺傳的效果，因此白刺組培技術(shù)迅速興起。植物組織培養(yǎng)技術(shù)現(xiàn)已在育種、制藥等多方面快速、成熟發(fā)展[5-6]，但在實(shí)際操作中多種因素都能造成失敗。合適的滅菌時(shí)間和溶液配比可以降低種子的污染率并提高成活率[7-8]；使用分化能力強(qiáng)、內(nèi)生菌較少的植物組織作為外植體[9]，可更大程度地降低污染的風(fēng)險(xiǎn)。目前，植物組織培養(yǎng)的研究主要集中在培養(yǎng)基篩選、外植體篩選、激素配比等方面[10]，針對(duì)外植體滅菌處理的研究較少。白刺的快繁技術(shù)大多以莖段、枝條為外植體，但因其植株內(nèi)生菌種類多而復(fù)雜，為組織培養(yǎng)造成諸多困難，其種子經(jīng)沙埋低溫處理后微生物數(shù)量大大減少，且使用種子作為材料進(jìn)行組織培養(yǎng)具有不受時(shí)間限制、繁殖較快的優(yōu)點(diǎn)，是優(yōu)良的外植體材料。

本試驗(yàn)以白刺種子為材料，通過不同滅菌方式之間的對(duì)比研究，選擇低污染、高效率的滅菌處理方法，以達(dá)到快速獲取無菌苗的要求，為后期白刺組織培養(yǎng)的其他方面研究奠定基礎(chǔ)[11]，以便于白刺的高效優(yōu)質(zhì)繁殖。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)材料為白刺種子，采自青海省柴達(dá)木盆地。經(jīng)過沙埋、低溫冷藏30d處理后，挑選顆粒飽滿、無病蟲害的種子作為試驗(yàn)材料。

1.2 方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

對(duì)不同滅菌因子(75%酒精、0.1%升汞溶液、不同濃度次氯酸鈉溶液)進(jìn)行隨機(jī)正交實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，取篩選后的試驗(yàn)材料，按照設(shè)計(jì)分別對(duì)白刺種子進(jìn)行滅菌處理，滅菌后將種子點(diǎn)播在裝有80ml MS固體培養(yǎng)基的500ml培養(yǎng)瓶?jī)?nèi)，每瓶點(diǎn)播6粒種子，重復(fù)5次。將接種后的培養(yǎng)基放置在溫度濕度恒定的培養(yǎng)室內(nèi)，觀察并記錄種子的滅菌效果。

1.2.2 種子滅菌處理

取適量沙藏后白刺種子洗凈，清水沖洗后晾干收集備用。接種前對(duì)種子進(jìn)行消毒，設(shè)置“75%酒精、0.1%升汞溶液”和“75%酒精、不同濃度次氯酸鈉溶液”共62種滅菌處理，隨機(jī)組合(表1)。先用75%酒精浸泡，均勻搖晃，使其與酒精充分接觸；用清水清洗；再加入次氯酸鈉溶液，保持均勻搖晃一定時(shí)長(zhǎng)；最后再用滅菌后的超純水反復(fù)清洗五次，將種子倒在干凈的培養(yǎng)皿中，供接種使用。以上滅菌操作均在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行。

表1 滅菌處理試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table.1 Sterilization test design

1.2.3 培養(yǎng)條件

白刺接種采用MS培養(yǎng)基，不添加任何激素。稱4.43g MS培養(yǎng)基粉末和30g蔗糖倒入1L的錐形瓶中，加水定容至1L，再用15%氫氧化鈉溶液調(diào)節(jié)pH=5.9-6.0，最后加入7g瓊脂粉末，搖晃均勻；將洗干凈的培養(yǎng)瓶和裝有培養(yǎng)基溶液的錐形瓶放入高壓滅菌鍋中，121℃ 15min；在超凈工作臺(tái)中進(jìn)行培養(yǎng)基溶液的分裝，保持培養(yǎng)基厚度0.5-1cm左右，靜置1h左右培養(yǎng)基凝固。24h光照培養(yǎng)，溫度為26±1℃。培養(yǎng)階段若發(fā)生培養(yǎng)基或外植體污染，及時(shí)將未污染種子接種到新培養(yǎng)基中，繼續(xù)觀察。

1.2.4 數(shù)據(jù)記錄及分析

數(shù)據(jù)處理中所需公式為：

污染率(%)=污染的種子個(gè)數(shù)/接種的種子總數(shù)×100%；

成活率(%)=發(fā)芽的種子個(gè)數(shù)/接種的種子總數(shù)×100%。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2010進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同滅菌處理對(duì)種子污染率的影響

表2 不同滅菌處理對(duì)種子的影響

白刺種子的滅菌試驗(yàn)結(jié)果如表2所示，所有處理中，污染率最高達(dá)到100%，最低為0，平均來看，15d污染率為16.56%，30d污染率為23.55%。相同處理?xiàng)l件下，滅菌時(shí)間越長(zhǎng)，種子污染率大多越低，滅菌效果越好；75%酒精消毒60s的滅菌效果普遍優(yōu)于消毒30s，污染率更低；經(jīng)相同處理的75%酒精消毒后，升汞溶液滅菌的效果優(yōu)于次氯酸鈉溶液，均低于15%，且次氯酸鈉溶液濃度越低滅菌效果越差，種子污染率越高。根據(jù)15d和30d種子污染率對(duì)比可知，升汞溶液消毒效果比較穩(wěn)定，極少數(shù)處理組繼續(xù)污染，次氯酸鈉溶液處理后的材料仍在擴(kuò)大污染。綜合分析可知，可選取的處理組合為“75%酒精、升汞溶液”和“75%酒精、高濃度次氯酸鈉溶液”，即A1-A6、B16-B25、C1-C6、D6-D25處理組。

2.2 不同滅菌處理對(duì)種子成活率的影響

由表2可知，種子存活率最高可達(dá)80%，最低為0%，15d成活率的均值為32.42%，30d為35.59%。相同處理?xiàng)l件下，種子成活率與處理時(shí)長(zhǎng)無明顯關(guān)系；60s 75%酒精消毒的種子成活率普遍高于30s的消毒處理，可能是因?yàn)橄拘Ч^好，利于種子正常生長(zhǎng)；相同時(shí)間的75%酒精滅菌下，由于升汞溶液自身毒性過強(qiáng)，再使用升汞溶液消毒后的種子成活率明顯低于次氯酸鈉溶液消毒；低濃度(10%、20%)次氯酸鈉溶液消毒后的種子污染率高，種子無法正常生長(zhǎng)萌發(fā)，致使其發(fā)芽率低；相同酒精消毒后，次氯酸鈉溶液濃度越高，成活種子數(shù)量越多。對(duì)比種子生長(zhǎng)15d和30d的結(jié)果可知，白刺種子生長(zhǎng)較為穩(wěn)定，只有少數(shù)處理下種子成活率增長(zhǎng)，且漲幅很小。綜合分析，“75%酒精、高濃度次氯酸鈉溶液”即B16-B25、D6-D25處理后對(duì)白刺種子的生長(zhǎng)影響不大，成活率較高。

2.3 不同滅菌處理對(duì)種子起始發(fā)芽天數(shù)的影響

種子發(fā)芽受很多因素影響，根據(jù)表2可知，消毒后的白刺種子多數(shù)在7d內(nèi)開始發(fā)芽生長(zhǎng)；經(jīng)升汞溶液消毒后的種子發(fā)芽時(shí)間較晚，升汞溶液的毒性影響種子自身生長(zhǎng)機(jī)制，處理時(shí)間過長(zhǎng)或?qū)е路N子死亡，即C6處理組30d內(nèi)始終無生長(zhǎng)發(fā)芽跡象；經(jīng)次氯酸鈉溶液消毒的白刺種子，其發(fā)芽受污染率影響，污染率越高，種子普遍萌發(fā)較晚，生長(zhǎng)緩慢；75%酒精消毒時(shí)間越長(zhǎng)，種子萌發(fā)越快。所以，較好的處理組合為“75%酒精60s、次氯酸鈉溶液”，即C1-C6、D1-D25。

3 討論

綜合各項(xiàng)指標(biāo)，本試驗(yàn)最終選取低污染率、高成活率、發(fā)芽快速的處理組合D20、D23、D25為白刺種子組織培養(yǎng)的滅菌方法，即“75%酒精60s、40%次氯酸鈉溶液30min”、“75%酒精60s、50%次氯酸鈉溶液20min”、“75%酒精60s、50%次氯酸鈉溶液30min”，其中“75%酒精60s、50%次氯酸鈉溶液30min”處理后的白刺種子培養(yǎng)過程中污染率為0，為最佳滅菌條件。

植物組織培養(yǎng)過程中，培養(yǎng)基內(nèi)營養(yǎng)充足，光照溫度等條件適宜，在促進(jìn)植株生長(zhǎng)的同時(shí)也會(huì)導(dǎo)致微生物在短時(shí)間內(nèi)的快速、周期性繁殖，常會(huì)發(fā)生材料污染導(dǎo)致試驗(yàn)失敗等情況，不僅會(huì)直接影響植物的正常生長(zhǎng)發(fā)育，還會(huì)間接造成組培材料的浪費(fèi)[12]。為了有效地避免污染，操作人員需提高對(duì)各階段的處理和操作的重視程度[13]。目前，關(guān)于白刺組培快繁的研究很少[14]，且基本都以莖尖、枝條等為材料，存在組培苗纖弱[15]、增值率較低[16]等問題，常用的滅菌方法為75%酒精和0.1%升汞溶液相結(jié)合，但仍會(huì)有污染，滅菌效果不佳[17]。外植體的無菌培養(yǎng)是植物組培的關(guān)鍵條件[18]，白刺枝條大量的內(nèi)生菌致使白刺組織培養(yǎng)過程中污染率極高，莖段或葉片的組培快繁難度較大，相比之下，種子內(nèi)微生物種類、數(shù)量較少，在消毒滅菌后進(jìn)行組培可大大降低種子及培養(yǎng)基的污染，使得白刺種子的組織培養(yǎng)變得尤為重要和有效。在其他植物的組培過程中，以不同植物的種子為外植體進(jìn)行無菌苗培養(yǎng)采用的滅菌條件有所差異，一般以0.1%升汞溶液為第二階段的消毒條件為主，也有部分植物使用適當(dāng)濃度的次氯酸鈉溶液進(jìn)行滅菌處理，防止升汞溶液毒性過強(qiáng)對(duì)后期組培苗萌發(fā)、生長(zhǎng)產(chǎn)生影響。任艷[19]研究花生的組織培養(yǎng)技術(shù)結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用75%酒精浸泡0.5-1min、1%次氯酸鈉溶液浸泡10min進(jìn)行消毒，滅菌效果最好且對(duì)種子的傷害較??；劉潔云[20]以紅色長(zhǎng)春花種子為材料，得出其最佳滅菌處理為以10%次氯酸鈉溶液處理10min；陳燦[21]以野生白芨種子為材料建立快繁體系，研究結(jié)果表明其滅菌方案是先用清水沖洗加入洗潔劑的種子，再以75%酒精30s、0.1%升汞溶液15min進(jìn)行處理；唐麗丹[7]以紫薇頂芽、葉片、蒴果等不同部位為材料分別進(jìn)行“75%酒精、0.1%升汞溶液”的消毒處理，研究表明滅菌時(shí)間因植株部位不同而變化，且植株易褐化；李蕊萍[22]以紅錐種子為外植體建立無菌系，得出較好的滅菌方案為剝掉種皮、75%酒精40s、0.1%升汞溶液6min；蔣時(shí)姣[23]研究柳杉的優(yōu)良無性系快繁體系得出，以種子為外植體，進(jìn)行75%酒精20s、0.1%升汞溶液10min的消毒處理，其污染率最低為10.00%，效果較好；陳章靖[24]研究瑪咖組培再生系統(tǒng)，得到的最佳滅菌方法為對(duì)種子進(jìn)行0.1%升汞溶液6min處理，存活率可達(dá)到92%；胡佳麗[25]通過以種胚為材料的組織培養(yǎng)對(duì)鐵皮石斛進(jìn)行快繁，發(fā)現(xiàn)使用75%酒精30s、8.0%次氯酸鈉溶液8min的滅菌方法效果最佳，且與傳統(tǒng)的升汞溶液滅菌相比更安全，能夠更好地維持鐵皮石斛的藥用價(jià)值，保證其培育、使用的安全性；李玲莉[26]以柔枝松合子胚為外植體材料進(jìn)行組培，得到的最佳滅菌方法是20%次氯酸鈉溶液20min浸泡處理，在不損傷種子的前提下，達(dá)到最低污染率。

升汞溶液和次氯酸鈉溶液在消毒處理上各有利弊，前者滅菌較為徹底，且短時(shí)、高效，但因其毒性往往在應(yīng)用時(shí)較為受限，后者雖滅菌成分溫和，存在一定程度滅菌不徹底的情況，但對(duì)植株本身的危害不大，能夠使幼苗較為穩(wěn)定地生長(zhǎng)快繁，且使用適當(dāng)濃度的次氯酸鈉溶液，加長(zhǎng)消毒時(shí)間，也能達(dá)到類似升汞溶液的滅菌效果。本實(shí)驗(yàn)旨在研究篩選以白刺種子為材料進(jìn)行組織培養(yǎng)的最佳滅菌組合，也為后期白刺組培快繁、培育推廣提供一定的理論基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

為研究白刺種子的最佳滅菌條件，本試驗(yàn)以“75%酒精+次氯酸鈉溶液”和“75%酒精+升汞溶液”兩種組合，對(duì)白刺種子進(jìn)行不同濃度梯度的研究，通過對(duì)接種后污染率、種子成活率以及發(fā)芽時(shí)間的綜合分析，得出滅菌效果最好的方案為“75%酒精60s、50%次氯酸鈉溶液30min”。 具體操作為，將春化后的白刺種子先用75%酒精滅菌60s，用無菌水沖洗1次，再用50%次氯酸鈉溶液消毒30min，無菌水沖洗3-5次，將處理后的種子轉(zhuǎn)移到滅菌的培養(yǎng)皿中，再接種到厚度合適的培養(yǎng)皿上，此時(shí)白刺種子的污染率最低，存活率高，且發(fā)芽較快。