王珍，應(yīng)慧群，舒媚

（永康市中醫(yī)院，浙江 永康 321300）

目前已知的人乳頭狀病毒（Human papillary virus，HPV）有200多種，其中40多種與生殖道感染相關(guān)[1]。高危型HPV16是常見感染的高危型人乳頭狀病毒，且在多數(shù)宮頸上皮瘤變和宮頸癌患者中均可檢測到[2]，故高危型HPV16宮頸上皮瘤變可能有關(guān)。B7免疫球蛋白超家族成員-1（Member of B7 immunoglobulin superfamily-1，B7-H1）等共刺激分子是T細(xì)胞或B細(xì)胞完全活化后提供共刺激信號的細(xì)胞表面物質(zhì)，又稱“程序性死亡配體-1”，與上皮細(xì)胞異常表達(dá)的免疫調(diào)節(jié)有關(guān)，與受體結(jié)合可促使T淋病細(xì)胞凋亡導(dǎo)致腫瘤細(xì)胞逃避細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞的攻擊，與宮頸癌密切相關(guān)[3-4]。因此，高危型HPV16感染共刺激分子B7-H1的表達(dá)情況也可能與宮頸上皮內(nèi)瘤變相關(guān)，但目前缺乏相關(guān)研究。本文探討高危型HPV16感染共刺激分子B7-H1的表達(dá)情況，并分析高危型HPV16感染、B7-H1表達(dá)情況與宮頸上皮內(nèi)瘤變級別的相關(guān)性，報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料 前瞻性選擇2018年1月-2020年6月本院高危型HPV陽性患者160例。納入標(biāo)準(zhǔn)：經(jīng)宮頸表面、陰道穹隆分泌物PCR核酸檢測確定為高危型HPV陽性的非妊娠女性，年齡15-65歲，既往宮頸篩查結(jié)果正常。排除標(biāo)準(zhǔn)：混合感染、既往有宮頸手術(shù)史、有脾切除或淋巴切除等可能損害機(jī)體免疫功能的手術(shù)史、有惡性腫瘤史、合并自身免疫疾病或正在進(jìn)行免疫抑制治療者。160例中絕經(jīng)112例，未絕經(jīng)48例；有分娩史143例，無分娩史17 例，年齡 42-63 歲，平均（55.8±5.5）歲，其中年齡＜50歲以下36例。研究經(jīng)本院倫理學(xué)委員會審批通過且患者知情同意。

1.2 方法 （1）囑患者在檢查前3天內(nèi)禁性生活、陰道內(nèi)用藥或盆浴，行陰道鏡檢查，采用10mL一次性無菌注射器取5mL生理鹽水，沖洗陰道后穹窿和宮頸，回吸于無菌離心管內(nèi)，收集患者陰道灌洗液，在2000rpm、3cm半徑、4℃中離心處理10分鐘，分層后取上清液用于相關(guān)指標(biāo)檢測。（2）采用qRT-PCR法檢測不同HPV型感染患者陰道灌洗液B7-H1 mRNA表達(dá)水平的差異，取待檢測樣本，常規(guī)提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄形成cDNA。進(jìn)行qRTPCR擴(kuò)增反應(yīng)：95℃預(yù)變性1分鐘、94℃變性0.5分鐘、58℃退火0.5分鐘，72℃延伸1分鐘，共35個(gè)循環(huán)后，72℃延伸10分鐘，PCR產(chǎn)物常規(guī)進(jìn)行瓊脂凝膠電泳，采用 2-△△Ct法進(jìn)行 B7-H1 的定量分析。（3）采用Western blot法檢測不同HPV型別感染者陰道灌洗液B7-H1蛋白表達(dá)水平。取待檢測樣本行冰上裂解、蛋白質(zhì)定量分析，分裝并添加緩沖液，在熱處理使蛋白變性、電泳后行PVDF膜轉(zhuǎn)膜，行1小時(shí)的封閉處理后加入B7-H1稀釋抗體孵育過夜，添加稀釋二抗，以β-actin為內(nèi)參，掃描灰度值，并計(jì)算B7-H1蛋白相對含量。（4）常規(guī)行陰道鏡病理檢查分析HPV16感染宮頸病變程度[5]，檢查結(jié)果分為無病變、低級別鱗狀上皮內(nèi)病變（LSIL，輕度不典型增生）、高級別鱗狀上皮內(nèi)病變（HSIL，中重度不典型增生）、宮頸癌。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 采用SPSS21.0軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)處理。計(jì)量資料均符合正態(tài)分布，以（±s）表示，多組之間采用方差分析，并通過SNK-q檢驗(yàn)進(jìn)一步兩兩比較；計(jì)數(shù)資料用百分率表示，采用χ2檢驗(yàn)；采用Spearman相關(guān)法分析B7-H1 mRNA相對表達(dá)量、蛋白表達(dá)水平與宮頸上皮內(nèi)瘤變級別的關(guān)系。

2 結(jié)果

2.1 高危型HPV感染情況 160例共檢出HPV16感染 65例（40.63%）、HPV18感染（21.88%）、HPV52感染（15.00%）、HPV56感染（12.50%）、HPV58感染（10.00%）。

2.2 HPV16感染的宮頸上皮內(nèi)瘤變級別 HPV16感染的 65例中無病變者 20例（30.77%）、LSIL22例（33.85%）、HSIL15 例（23.08%）、宮頸癌 8 例（12.31%）。

2.3 不同高危型HPV的B7-H1 mRNA相對表達(dá)量和蛋白表達(dá)水平 高危型HPV16感染者陰道灌洗液B7-H1 mRNA相對表達(dá)量和蛋白表達(dá)水平均高于其他高危型HPV感染者（P＜0.05）；高危型HPV18、HPV52、HPV56、HPV58 感染者陰道灌洗液B7-H1 mRNA相對表達(dá)量和蛋白表達(dá)水平比較差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05）。 詳見圖 1、表 1。

表1 不同高危型HPV感染者的B7-H1 mRNA相對表達(dá)量和蛋白表達(dá)水平比較（±s）

表1 不同高危型HPV感染者的B7-H1 mRNA相對表達(dá)量和蛋白表達(dá)水平比較（±s）

*注：B7-H1蛋白表達(dá)=B7-H1灰度值/β-actin灰度值與 HPV16 比較△P＜0.05

高危型 HPV n B7-H1 mRNA（2-△△Ct） B7-H1 蛋白表達(dá) *HPV16 65 0.98±0.18 0.95±0.15 HPV18 35 0.24±0.12* 0.21±0.12△HPV52 24 0.22±0.14* 0.18±0.08△HPV56 20 0.29±0.11* 0.25±0.16△HPV58 16 0.31±0.17* 0.27±0.14△F值 — 213.582 279.559 P—＜0.01 ＜0.01

圖1 不同高危型HPV感染者B7-H1蛋白表達(dá)水平的Western blot檢測結(jié)果

2.4 高危型HPV16不同宮頸上皮內(nèi)瘤變級別的陰道灌洗液B7-H1 mRNA相對表達(dá)量和蛋白表達(dá)水平比較 隨著高危型HPV16感染患者宮頸上皮內(nèi)瘤變級別的升高，其陰道灌洗液B7-H1 mRNA相對表達(dá)量和蛋白表達(dá)水平均升高（P＜0.05），詳見表2。Spearman相關(guān)分析結(jié)果顯示，HPV16感染者陰道灌洗液B7-H1 mRNA相對表達(dá)量和蛋白表達(dá)水平與其宮頸上皮內(nèi)瘤級別均呈正相關(guān)（rB7-H1mRNA相對表達(dá)量=0.878，rB7-H1mRNA蛋白表達(dá)水平=0.825，P＜0.05）。

表2 高危型HPV16不同宮頸上皮內(nèi)瘤變級別的陰道灌洗液B7-H1 mRNA相對表達(dá)量和蛋白表達(dá)水平比較（±s）

表2 高危型HPV16不同宮頸上皮內(nèi)瘤變級別的陰道灌洗液B7-H1 mRNA相對表達(dá)量和蛋白表達(dá)水平比較（±s）

注：B7-H1蛋白表達(dá)=B7-H1灰度值/β-actin灰度值與無病變比較 *P＜0.05；與 LSIL比較 #P＜0.05；與 HSIL比較△P＜0.05

宮頸上皮內(nèi)瘤變級別 n B7-H1 mRNA（2-△△Ct） B7-H1蛋白無病變 20 1.06±0.24 0.99±0.21 LSIL 22 0.90±0.19* 0.88±0.12*HSIL 15 0.81±0.20*# 0.79±0.17*#宮頸癌 8 0.72±0.16*#△ 0.68±0.15*#△F值 - 6.983 8.060 P-＜0.01 ＜0.01

3 討論

HPV為環(huán)狀雙鏈DNA病毒，核心為7800-7900個(gè)堿基通過共價(jià)鍵形式組成具有遺傳信息的閉合環(huán)狀雙鏈DNA，可引起人體的皮膚以及黏膜的鱗狀上皮增生，其中超過40種HPV與生殖道感染密切相關(guān)，根據(jù)其生物學(xué)特征以及致癌的潛在可能性，可分為高危型和低危型，其中高危型HPV的E6和E7基因編碼的原癌蛋白是導(dǎo)致宮頸癌發(fā)生的重要因子[6-8]。因此，高危型HPV感染及其致癌機(jī)制的相關(guān)研究對于宮頸癌預(yù)防和癌前干預(yù)具有重要的指導(dǎo)意義。研究中多數(shù)宮頸上皮瘤變和宮頸癌患者均可見高危型HPV16、HPV18等感染[9-11]。本研究顯示，高危型HPV陽性160例中HPV16感染最多見，共65例（占40.63%），臨床需重視。本研究對HPV16感染者的宮頸上皮內(nèi)瘤變級別進(jìn)行分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)65例HPV16感染者中僅20例（30.77%）無宮頸上皮內(nèi)瘤變，其余患者均存在不同程度的宮頸上皮內(nèi)瘤變，提示HPV16感染可促進(jìn)宮頸癌的發(fā)生發(fā)展，高危型HPV16感染的相關(guān)研究對宮頸癌的防治具有重要意義。

宮頸癌發(fā)生發(fā)展與多種機(jī)制相關(guān)，其中免疫調(diào)節(jié)發(fā)揮了重要作用[12-13]。B7-H1是與腫瘤免疫調(diào)節(jié)密切相關(guān)因子，為B7家族成員，在與受體結(jié)合之后可誘發(fā)抑制性信號，從而誘導(dǎo)T細(xì)胞的凋亡以及抑制T細(xì)胞的活化和增殖，從而參與腫瘤免疫調(diào)節(jié)過程[14-16]。在正常組織細(xì)胞中，B7-H1的作用為下調(diào)效應(yīng)性Y細(xì)胞功能、阻止T細(xì)胞對組織細(xì)胞過度反應(yīng)導(dǎo)致的自身免疫學(xué)疾?。欢谀[瘤細(xì)胞中，B7-H1的作用為誘導(dǎo)腫瘤抗原特異性T細(xì)胞凋亡，促進(jìn)腫瘤免疫逃逸，從而促進(jìn)腫瘤的發(fā)生發(fā)展和浸潤轉(zhuǎn)移[17-19]。因此，B7-H1亦可能參與宮頸癌的發(fā)生發(fā)展乃至轉(zhuǎn)移。

李巧稚等[20]研究證實(shí)，高危型HPV16感染可促使B7-H1在子宮頸病變中表達(dá)且B7-H1的表達(dá)與宮頸病變的病情相關(guān)，B7-H1可能為高危型HPV16感染促進(jìn)宮頸病變乃至癌變的重要因素，但這一關(guān)系尚不明確。本研究比較了不同高危型HPV感染者陰道灌洗液B7-H1的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與其他高危型HPV比較，高危型HPV16者的陰道灌洗液B7-H1 mRNA相對表達(dá)量和蛋白表達(dá)水平更高，證實(shí)“高危型HPV16感染促進(jìn)了B7-H1表達(dá)”的結(jié)論，與李巧稚等[20]的研究結(jié)論一致。HPV16感染后HPV E6、E7可與p53、Rb協(xié)同作用導(dǎo)致癌癥發(fā)生，在HPV16感染初期即可上調(diào)B7-H1表達(dá)而促進(jìn)腫瘤細(xì)胞逃避機(jī)體免疫監(jiān)視，從而促進(jìn)HPV16持續(xù)感染，并為腫瘤發(fā)生發(fā)展創(chuàng)造條件。本研究中，高危型HPV16感染患者隨著宮頸上皮內(nèi)瘤變級別的升高，其陰道灌洗液B7-H1 mRNA的相對表達(dá)量和蛋白表達(dá)水平也升高，Spearman相關(guān)分析證實(shí)了HPV16感染者陰道灌洗液B7-H1 mRNA相對表達(dá)量和蛋白表達(dá)水平與其宮頸病變程度均呈正相關(guān)。

綜上所述，B7-H1與高危型HPV16感染及宮頸病變均密切相關(guān)，可能成為高危型HPV16感染宮頸癌前病變預(yù)防性干預(yù)的靶點(diǎn)。