毛延妍，邱 恬,2，薛 潔,2，王靈艷，俞春娜,2，馮尚國,2，王慧中,2，展曉日,2

(1. 杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院，浙江 杭州 311121； 2. 浙江省藥用植物種質(zhì)改良與質(zhì)量控制技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，浙江 杭州 311121)

苦蘵PhysalisangulataL.是茄科Solanaceae酸漿屬Physalis植物，是一種民間常用中草藥，其宿萼、帶宿萼的果實(shí)、根、全草均可入藥.現(xiàn)代藥理研究表明苦蘵具有抗炎、抗氧化、抗腫瘤、免疫調(diào)節(jié)、鎮(zhèn)痛等藥理作用[1].目前已從苦蘵中分離獲得多種化學(xué)成分，包括甾體類(酸漿苦味素類和睡茄內(nèi)酯類)、黃酮類、有機(jī)酸等，其中主要活性成分為甾體類化合物.

毛狀根是發(fā)根農(nóng)桿菌Agrobacteriumrhizogenes侵染植物后，將其所攜帶的能夠使植物產(chǎn)生毛狀根的Ri質(zhì)粒上的 T-DNA 轉(zhuǎn)移至植物體內(nèi)，并最終整合到宿主細(xì)胞基因組中產(chǎn)生的[2-3].毛狀根生長不依賴外源植物激素，具有生長速度快、周期短、遺傳穩(wěn)定等特點(diǎn).而且毛狀根分化程度高，生長條件要求相對簡單，合成次生代謝產(chǎn)物能力與植株相似甚至更強(qiáng)，是一種進(jìn)行植物次生代謝產(chǎn)物生物合成研究的理想材料，也可作為高效生產(chǎn)植物次生代謝產(chǎn)物的生物反應(yīng)器[4-5].

苦蘵中主要活性成分甾體類化合物雖已被證實(shí)具有多種藥理活性，但前期研究發(fā)現(xiàn)不同來源苦蘵中的活性成分含量差異較大，且含量相對較低，可能是植物在生長過程中由于外界因素影響所導(dǎo)致.因此本研究利用發(fā)根農(nóng)桿菌誘導(dǎo)苦蘵的毛狀根，建立了苦蘵毛狀根體系，為今后利用苦蘵毛狀根進(jìn)一步研究其次生代謝產(chǎn)物合成途徑及生產(chǎn)藥用成分奠定基礎(chǔ).

1 材料

苦蘵種子采自臺州，經(jīng)杭州師范大學(xué)生命與環(huán)境科學(xué)學(xué)院王慧中教授鑒定為茄科酸漿屬植物苦蘵PhysalisangulataL.的種子；發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1由中國中醫(yī)科學(xué)院中藥資源中心郭娟研究員提供.

2×Easy Taq Super Mix，Ezup柱式植物基因組DNA抽提試劑盒，頭孢噻肟鈉(cefotaxime sodium，Cef)，DNA marker，利福平(rifampicin，Ref)購自生工生物工程股份有限公司；胰蛋白胨(tryptone)，氯化鈉(NaCl)，次氯酸鈉(NaClO)溶液等購自國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；酵母提取物(Yeast extract)購自英國Oxoid公司；MS培養(yǎng)基購自北京索萊寶科技有限公司.

2 方法

2.1 苦蘵無菌苗的培養(yǎng)

取苦蘵種子，70%乙醇浸泡3 min，5%NaClO溶液浸泡10 min，無菌水沖洗4～6次.接種于MS固體培養(yǎng)基，25 ℃暗培養(yǎng)2 d后，光照培養(yǎng)箱25 ℃恒溫培養(yǎng)，種子萌發(fā)后轉(zhuǎn)移至含MS固體培養(yǎng)基的組培瓶中，20 d左右即可得到苦蘵無菌苗.

2.2 菌種的活化

取-80 ℃冰箱中凍存的發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1、ACC、A4、9401劃線于含有利福平的YEB固體培養(yǎng)基上，28 ℃倒置恒溫培養(yǎng)2 d.挑取單菌落接種于10 mL YEB(50 mg·L-1Rif)液體培養(yǎng)基中，28 ℃、220 r·min-1振蕩培養(yǎng)至瓶內(nèi)液體渾濁，取1 mL菌液加入到50 mL YEB(50 mg·L-1Rif)液體培養(yǎng)基中，28 ℃、220 r·min-1振蕩培養(yǎng)至A600為0.4～0.6，4 ℃下6 000 r·min-1離心10 min，棄上清液，另取50 mL MS液體培養(yǎng)基重懸沉淀的菌體，即得侵染液.

2.3 外植體的侵染和毛狀根的誘導(dǎo)

取苦蘵無菌苗的葉片，切成0.5～1 cm邊長的正方形小片，將葉柄和莖剪成長度約0.5～1 cm的小段，置于MS固體培養(yǎng)基上，其中葉片部分背面向上放置，25 ℃恒溫暗培養(yǎng)2 d.將預(yù)培養(yǎng)后的外植體轉(zhuǎn)至事先制備好的侵染液中，28 ℃、120 r·min-1振蕩15 min，取出，用無菌紙吸干外植體表面殘留菌液，置MS空白固體培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫暗培養(yǎng)2 d.取出外植體，無菌水清洗3次，用400 mg·L-1Cef溶液浸泡5 min，吸干表面水分，將其轉(zhuǎn)至含400 mg·L-1Cef的MS固體培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫暗培養(yǎng)，待外植體邊緣長出的毛狀根長度約為2 cm時，切下毛狀根單獨(dú)培養(yǎng).每7 d繼代1次，每繼代1次，將Cef質(zhì)量濃度降低100 mg·L-1，直至Cef濃度降低到0，保證完全除菌.

2.4 苦蘵毛狀根誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

2.4.1 發(fā)根農(nóng)桿菌菌株對誘導(dǎo)率的影響

取苦蘵葉片，按“2.3”項下方法對其進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)后，采用4種發(fā)根農(nóng)桿菌C58C1、ACC、A4、9401分別對苦蘵的葉片進(jìn)行侵染，28 ℃、120 r·min-1振蕩20 min，取出，用無菌紙吸干葉片表面殘留菌液，置MS空白固體培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫暗培養(yǎng)，20 d后統(tǒng)計葉片發(fā)根情況，并計算誘導(dǎo)率，公式如下：

毛狀根誘導(dǎo)率=(長出毛狀根的外植體數(shù)/總外植體數(shù))×100%.

2.4.2 培養(yǎng)基對誘導(dǎo)率的影響

取苦蘵葉片，按“2.3”項下方法對其進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)后，以C58C1侵染葉片，28 ℃、120 r·min-1振蕩20 min，取出，用無菌紙吸干葉片表面殘留菌液，分別置于新的MS、1/2MS、B5、1/2B5固體培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫暗培養(yǎng)，20 d后統(tǒng)計葉片發(fā)根情況，并計算誘導(dǎo)率.

2.4.3 外植體對誘導(dǎo)率的影響

分別取苦蘵的葉、莖、葉柄，按“2.3”項下方法對其進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)后，以C58C1侵染不同外植體，28 ℃、120 r·min-1振蕩20 min，取出，用無菌紙吸干葉片表面殘留菌液，置MS空白固體培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫暗培養(yǎng)，20 d后統(tǒng)計葉片發(fā)根情況，并計算誘導(dǎo)率.

2.4.4 侵染時間對誘導(dǎo)率的影響

取苦蘵葉片，按“2.3”項下方法對其進(jìn)行預(yù)培養(yǎng)后，以C58C1侵染葉片，28 ℃、120 r·min-1分別振蕩5、10、15、20、25、30 min，取出，用無菌紙吸干葉片表面殘留菌液，置MS空白固體培養(yǎng)基上，25 ℃恒溫暗培養(yǎng)，20 d后統(tǒng)計葉片發(fā)根情況，并計算誘導(dǎo)率.

2.5 苦蘵毛狀根的鑒定

選擇不同根系的苦蘵毛狀根、苦蘵根及苦蘵葉片未侵染狀態(tài)下長出的根為材料，采用Ezup柱式植物基因組DNA抽提試劑盒提取其DNA.在生工生物工程股份有限公司合成rolB和rolC基因的PCR引物.rolB-F：5′-CGAGGGGATCCGATTTGCTT-3′，rolB-R：5′-GACGCCCTCCTCGCCTTCCT-3′；rolC-F：5′-TCGCCATGCCTCACCAACTCAC-3′，rolC-R：5′-CCTTGATCGAGCCGGGTGAGAA-3′.PCR反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃變性30 s，58 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，35個循環(huán)；72 ℃延伸5 min.瓊脂糖凝膠電泳檢測目的條帶.

2.6 苦蘵毛狀根液體擴(kuò)大培養(yǎng)

經(jīng)PCR鑒定后，選擇白色、多分枝、多根毛、生長迅速的無菌毛狀根作為優(yōu)良株系，轉(zhuǎn)入含50 mL6,7-V液體培養(yǎng)基中，25 ℃、80 r·min-1暗培養(yǎng)，觀察毛狀根生長情況.

2.7 苦蘵毛狀根生長曲線的測定

取在6,7-V液體培養(yǎng)基中生長旺盛且無菌的苦蘵毛狀根0.5 g，轉(zhuǎn)至50 mL 6,7-V液體培養(yǎng)基中，5 ℃、80 r·min-1暗培養(yǎng)，每4 d隨機(jī)取樣1次，直至第60 天，每次取樣3瓶，記錄每瓶毛狀根的干質(zhì)量，計算平均值，繪制其0～60 d的生長曲線.

3 結(jié)果與討論

3.1 苦蘵無菌苗的培養(yǎng)

苦蘵點(diǎn)種后6 d左右發(fā)芽，發(fā)芽后3 d左右長出兩片子葉.點(diǎn)種后30 d左右的無菌植株可用于毛狀根誘導(dǎo)實(shí)驗(yàn)，不同生長時期苦蘵無菌植株如圖1A、1B所示.

3.2 苦蘵毛狀根誘導(dǎo)及形態(tài)特征

苦蘵葉片在受到發(fā)根農(nóng)桿菌侵染后，6 d左右可觀察到外植體傷口處有白色顆粒狀突起物，再過3～5 d葉片傷口處便可生長成為多毛、多分枝的白色根.根生長的高峰期在侵染后的第14 天，長出的根形態(tài)均為多分枝、多根毛，多數(shù)沿著培養(yǎng)基表面或者貼在培養(yǎng)皿側(cè)壁生長，且根的生長速度很快，在發(fā)根后的7 d內(nèi)迅速生長并覆蓋培養(yǎng)基表面.毛狀根誘導(dǎo)情況見圖1C、1D、1E.

A、B分別為生長9、30 d的苦蘵無菌苗；C、D、E分別為侵染后10、20、25 d時的苦蘵毛狀根.

1、2：苦蘵根；3、4：苦蘵葉片未侵染狀態(tài)下長出的根；H1、H2：不同株系苦蘵毛狀根；P：菌株C58C1；N：陰性對照；M：DL 2000 DNA marker.

3.3 苦蘵毛狀根PCR鑒定

按“2.5”項所述方法對苦蘵毛狀根基因組DNA進(jìn)行PCR鑒定，結(jié)果見圖2.PCR結(jié)果顯示，正常苦蘵根(1、2)及苦蘵葉片未侵染長出的根(3、4)無特異擴(kuò)增產(chǎn)物，而經(jīng)過C58C1誘導(dǎo)產(chǎn)生的2種不同根系苦蘵毛狀根(H1、H2)和菌液對照(P)均出現(xiàn)了明顯的特異擴(kuò)增條帶，從而在分子水平上證明了外源Ri質(zhì)粒的T-DNA片段已插入并整合到苦蘵毛狀根基因組中.

3.4 苦蘵毛狀根誘導(dǎo)條件的優(yōu)化

首先考察了C58C1、ACC、A4、9401分別對苦蘵葉片進(jìn)行侵染后不同菌株的毛狀根誘導(dǎo)率，結(jié)果(圖3a)表明，4種發(fā)根農(nóng)桿菌對苦蘵毛狀根的誘導(dǎo)率均大于60%，其中C58C1和ACC的誘導(dǎo)率可達(dá)80%以上，本研究選擇了適合于廣泛宿主的C58C1作為誘導(dǎo)苦蘵毛狀根的發(fā)根農(nóng)桿菌.在此基礎(chǔ)上，進(jìn)一步考察了不同培養(yǎng)基、外植體、侵染時間對毛狀根誘導(dǎo)率的影響，結(jié)果見圖3.由圖3b可知，4種培養(yǎng)基中以MS 作為培養(yǎng)介質(zhì)時苦蘵毛狀根誘導(dǎo)率最高，因此選用MS作為培養(yǎng)基.由圖3c可知，在相同侵染條件下，用農(nóng)桿菌分別侵染葉、莖、葉柄，不同外植體的毛狀根誘導(dǎo)率差別顯著，以葉片為外植體的毛狀根誘導(dǎo)率最高，達(dá)81.2%.由圖3d可知，侵染15～20 min毛狀根誘導(dǎo)率為80%以上，但是隨著侵染時間的延長，誘導(dǎo)率不升反降，因此最佳侵染時間為15 min.

圖3 不同誘導(dǎo)條件對苦蘵毛狀根誘導(dǎo)率的影響Fig.3 Effect of different conditions on the induction rate of hairy roots

圖4 苦蘵毛狀根的生物量積累曲線Fig.4 The accumulation of biomass of hairy roots

3.5 苦蘵毛狀根懸浮培養(yǎng)的生長曲線

取生長旺盛的苦蘵毛狀根接種至6,7-V液體培養(yǎng)基中，從接種后第4 天開始，在培養(yǎng)60 d內(nèi)每4 d取樣1次，每次3份，以毛狀根干質(zhì)量對其懸浮培養(yǎng)時間作圖，得到懸浮培養(yǎng)苦蘵毛狀根的生長曲線，見圖4.由圖4分析可知，苦蘵毛狀根在4～16 d處于快速生長期，其干質(zhì)量增長了2.7倍；16～32 d處于生長的穩(wěn)定期，干質(zhì)量增長了1.5倍；32 d后苦蘵毛狀根質(zhì)量出現(xiàn)下降趨勢.并且隨著培養(yǎng)時間的增加，苦蘵毛狀根的顏色由白色逐漸轉(zhuǎn)變?yōu)辄S色，見圖5.

A：毛狀根懸浮培養(yǎng)4、32、60 d的生長狀態(tài)；B：毛狀根懸浮培養(yǎng)4、32、60 d的生物量.

4 結(jié)論

根據(jù)文獻(xiàn)報道，目前已有上百種藥用植物成功通過發(fā)根農(nóng)桿菌侵染外植體建立了毛狀根培養(yǎng)體系，但由于每種植物均有其自身的生理特點(diǎn)，部分植物的毛狀根難以誘導(dǎo).對于每種植物的誘導(dǎo)條件沒有固定模式可循，都需要進(jìn)行大量的優(yōu)化實(shí)驗(yàn)來確定其培養(yǎng)條件.苦蘵是一種具有較高藥用價值的植物，但其毛狀根誘導(dǎo)體系還未見報道.

本實(shí)驗(yàn)以苦蘵無菌植株為材料，通過發(fā)根農(nóng)桿菌侵染苦蘵外植體的方法建立了苦蘵毛狀根體系.通過對毛狀根基因組DNA進(jìn)行PCR擴(kuò)增，驗(yàn)證了質(zhì)?；騬olB和rolC的存在，從分子層面對苦蘵毛狀根進(jìn)行了鑒定.同時考察了不同發(fā)根農(nóng)桿菌菌株、培養(yǎng)基、侵染時間、外植體對毛狀根誘導(dǎo)率的影響，從而確定苦蘵毛狀根培養(yǎng)條件：取苦蘵葉片，切成0.5～1 cm邊長的正方形小片，于MS固體培養(yǎng)基上預(yù)培養(yǎng)2 d，C58C1侵染15 min.用無菌紙吸干葉片表面殘留菌液，置于新的MS固體培養(yǎng)基上，25 ℃暗培養(yǎng).并繪制了苦蘵毛狀根懸浮培養(yǎng)0～60 d的生長曲線，研究不同生長時期苦蘵毛狀根生物量的積累，發(fā)現(xiàn)苦蘵毛狀根的生長周期約為 32 d.