黃付晏，陳欽暢，譚皓月，郭婧，于南洋，史薇，于紅霞

污染控制與資源化研究國家重點實驗室，南京大學(xué)環(huán)境學(xué)院，南京 210023

核受體(nuclear receptor, NR)超家族是由天然激素調(diào)控的轉(zhuǎn)錄因子(transcription factors, TFs)，在細(xì)胞分化、發(fā)育、增殖以及代謝中發(fā)揮著重要作用[1]。環(huán)境中存在大量小分子有機化合物，如雙酚A(bisphenol A, BPA)、羥基化多溴聯(lián)苯醚(hydroxylated polybrominated diphenyl ethers, OH-PBDEs)、多氯聯(lián)苯(polychlorinated biphenyls, PCBs)、多環(huán)芳烴(polycyclic aromatic hydrocarbons, PAHs)和殺蟲劑等，它們會通過模仿或拮抗天然激素，靶向NR，進而產(chǎn)生內(nèi)分泌干擾效應(yīng)，導(dǎo)致不良健康影響[2-4]，這種化合物被稱為內(nèi)分泌干擾物(endocrine disrupting chemicals, EDCs)。EDCs會導(dǎo)致人類產(chǎn)生嚴(yán)重的生殖發(fā)育疾病，如癌癥[5]、心血管疾病[6]、肥胖[7]及生殖異常[8]等。據(jù)統(tǒng)計，歐盟EDCs相關(guān)疾病的治療費用達(dá)到歐盟內(nèi)部生產(chǎn)總值的1.28%[9]，美國達(dá)到2.33%[10]。

有害結(jié)局路徑(adverse outcome pathway, AOP)的概念被用來描述內(nèi)分泌干擾效應(yīng)。當(dāng)EDCs作用于核受體后，會誘導(dǎo)分子啟動事件(molecular initiating events, MIEs)的發(fā)生，即EDCs首先與核受體的配體結(jié)合口袋(ligand binding pocket, LBP)相結(jié)合，模擬或拮抗內(nèi)源性激素配體與核受體結(jié)合形成核受體-化合物復(fù)合物，進而該復(fù)合物轉(zhuǎn)移進入細(xì)胞核內(nèi)形成同源二聚體(homodimer)或異源二聚體(heterodimer)，結(jié)合到DNA反應(yīng)原件(DNA-responsive element, DRE)上，通過招募共激活因子(coactivator, COA)或共抑制因子(corepressor, COR)啟動或抑制轉(zhuǎn)錄[11-12]。MIEs反映EDCs與靶標(biāo)核受體間的相互作用，其進一步引起細(xì)胞層次、器官層次等一系列關(guān)鍵事件(key events, KEs)的變化，最終導(dǎo)致內(nèi)分泌干擾效應(yīng)。目前對于EDCs分子啟動機制的研究主要針對EDCs與核受體的結(jié)合過程，忽視了其對核受體二聚化過程的影響，而該過程的阻斷可直接導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄失活[13]。因此，本文從EDCs介導(dǎo)的核受體二聚化轉(zhuǎn)錄機制、核受體二聚化與轉(zhuǎn)錄活性間的關(guān)系以及基于活細(xì)胞的核受體二聚化研究方法3個方面對EDCs對核受體二聚化的影響進行了概述。

1 核受體轉(zhuǎn)錄機制(Transcription mechanism of nuclear receptor)

1.1 人類核受體家族

人類存在48個核受體(表1)，基于其配體以及二聚化特征可將它們分為3類：(1)I類，也被稱為類固醇核受體(steroid nuclear receptor)，包括雌激素受體(estrogen receptor, ER)、雄激素受體(androgen receptor, AR)等。類固醇核受體主要以同源二聚體結(jié)構(gòu)調(diào)控下游的轉(zhuǎn)錄過程[14-15]。其中，ER存在2種亞型，ERα和ERβ，可分別形成ERα同源二聚體、ERβ同源二聚體和ERα-ERβ異源二聚體調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄[16]。(2)II類，也被稱為非類固醇核受體(non-steroid nuclear receptors)，包括甲狀腺激素受體(thyroid hormone receptorα/β, TRα/β)、維甲酸受體(retinoic acid receptorα/β/γ, RARα/β/γ)以及組成型雄烷受體(constitutive androstane receptor, CAR)、類法尼醇X受體(farnesoid X receptorα/β, FXRα/β)等。該類核受體主要與維甲酸X受體(retinoid X receptorα/β/γ, RXRα/β/γ)形成異源二聚體調(diào)節(jié)下游基因的轉(zhuǎn)錄表達(dá)，如RAR-RXR[17]、FXR-RXR[18]和CAR-RXR[19]等。(3)Ⅲ類，也被稱為孤兒核受體，其內(nèi)源性配體還未發(fā)現(xiàn)或一部分核受體不存在配體，包括小異二聚體伴侶(short heterodimeric partner, SHP)、睪丸受體(testicular orphan receptor 2/4, TR2/4)等。這類核受體多數(shù)可以以單體或同源二聚體的形式結(jié)合各自的DRE來調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄的表達(dá)。特別地，NR相關(guān)因子(nur-related factor 1, NURR1)可與RXR形成異源二聚體，并能被RXR配體結(jié)合激活，進而調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄過程[20-24]。

1.2 核受體二聚體

已發(fā)表的大量結(jié)構(gòu)化和功能化數(shù)據(jù)證實，核受體的DNA結(jié)合域(DNA binding domain, DBD)和配體結(jié)合域(ligand binding domain, LBD)與二聚過程高度相關(guān)[25]。由于DBD貢獻的二聚化界面很小[26]，而LBD貢獻很大的二聚化界面，能夠提供更大的二聚體穩(wěn)定性，因此人們普遍認(rèn)為LBD對二聚過程存在決定性的作用[27]。

1.2.1 典型核受體二聚體

核受體主要以同源二聚體或異源二聚體的形式調(diào)節(jié)轉(zhuǎn)錄。表1中3種類型的同源二聚體或與RXR形成的異源二聚體形式被認(rèn)為是典型二聚體(typical dimers)[28]。部分典型異源二聚體存在的一個固有特征是既可被自身配體直接激活，又可被RXR的配體介導(dǎo)激活。因此，基于此特性可將典型異源二聚體進一步分為2類，第1類可被自身配體或者RXR配體激活，第2類只能被自身配體激活而RXR沉默[29-30]。特別地，對于第1類異源二聚體而言，如PPAR、CAR和LXR，當(dāng)核受體自身的內(nèi)源配體和伴侶RXR的配體同時存在時能產(chǎn)生協(xié)同效應(yīng)[31]。

通過結(jié)晶實驗，大部分典型核受體二聚體已有基于LBD的二聚體結(jié)晶結(jié)構(gòu)(https://www.rcsb.org/)。通過對不同核受體二聚化結(jié)晶體結(jié)構(gòu)進行研究，我們發(fā)現(xiàn)不同核受體產(chǎn)生的二聚體構(gòu)象之間存在顯著差異(圖1)。

1.2.2 典型核受體二聚體的構(gòu)象差異

多數(shù)典型核受體二聚體會由每個單體(monomer)的第9號α螺旋鏈(Helix 9)、第10號α螺旋鏈(Helix 10)和11號α螺旋鏈(Helix 11)互相接觸構(gòu)成二聚化界面(圖1(a)、(b)和(c))，這種被稱為經(jīng)典二聚體結(jié)構(gòu)[32-34]。有趣的是，一些核受體如AR、糖皮質(zhì)激素受體(glucocorticoid receptor, GR)、鹽皮質(zhì)激素受體(mineralocorticoid receptor, MR)、孕激素受體(progesterone receptor, PR)等的二聚化方式與這種經(jīng)典的二聚體完全相反(圖1(d)和(e))[35-37]，呈現(xiàn)出2個單體的5號α螺旋鏈(Helix 5)頭對頭的松散型二聚體構(gòu)型。根據(jù)歐洲蛋白數(shù)據(jù)庫(EMBL-EBI)的PDBePISA模塊(https://www.ebi.ac.uk/pdbe/pisa/)提供的核受體界面信息發(fā)現(xiàn)，經(jīng)典結(jié)構(gòu)的二聚化界面能貢獻更大的界面面積以及更多的相互作用。如ERα-ERα同源二聚體擁有高達(dá)14.561 nm2的二聚化界面面積，RAR-RXR和CAR-RXR異源二聚體界面面積分別達(dá)到11.963 nm2和12.112 nm2，而AR-AR、GR-GR同源二聚體界面面積分別只有10.003 nm2和8.095 nm2。氫鍵(hydrogen bonds)和疏水相互作用(hydrophobic interactions)是形成二聚界面的2種主要作用力。對氫鍵進行分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)典二聚體構(gòu)型，如ERα-ERα同源二聚體、RAR-RXR和CAR-RXR異源二聚體界面氫鍵數(shù)分別達(dá)到10、19和12個，而松散型二聚體AR-AR、GR-GR同源二聚體界面氫鍵只有5個，氫鍵數(shù)目越多表明界面相互作用越強。而界面溶劑化自由能(solvation free energy,ΔG)越負(fù)，表明核受體二聚體界面的疏水接觸越多，通過對多種二聚體的ΔG分析發(fā)現(xiàn)，不同核受體產(chǎn)生的同種類型的二聚化構(gòu)型之間也存在明顯的差異性。例如，對于結(jié)構(gòu)緊密的經(jīng)典型二聚體，ER-ER同源二聚體界面ΔG為-59.9 kJ·mol-1，具有很強的疏水相互作用，而CAR-RXR異源二聚體界面ΔG只有-14.2 kJ·mol-1。而對于結(jié)構(gòu)松散型二聚體，GR-GR同源二聚體界面ΔG達(dá)到-46.9 kJ·mol-1，AR-AR同源二聚體界面只有-12.1 kJ·mol-1(圖1和表2)。

1.2.3 非典型異源二聚體

除了與RXR伴侶生成典型核受體異源二聚體以外，有大量研究表明，存在非典型異源二聚體(atypical heterodimer)，即核受體并不與RXR伴侶異源結(jié)合形成二聚，如AR-GR[38]、GR-MR[39]、GR-PPAR[40]、ER-AR[41]、ER-GR[42]和PPAR-ERR[43]等。這些非典型異源二聚體不像典型異源二聚體結(jié)構(gòu)被詳細(xì)解析，并且可能局限于特定的細(xì)胞類型和體內(nèi)生理條件，具有壽命短、瞬時性等特點，但其短暫的存在仍可能會對靶細(xì)胞或組織中基因表達(dá)產(chǎn)生強烈影響。因此，非典型核受體異源二聚體的生理相關(guān)性識別對配體調(diào)節(jié)核受體作用的現(xiàn)有知識提出了挑戰(zhàn)[28]。

表1 人類核受體家族Table 1 Human nuclear receptor family

1.3 核受體二聚體轉(zhuǎn)錄機制

3類核受體經(jīng)過二聚后會產(chǎn)生3類轉(zhuǎn)錄機制，具體如下：

Ⅰ類：類固醇核受體通常以單體形式或與伴侶蛋白(chaperones/cochaperones)形成復(fù)合體穩(wěn)定存在于細(xì)胞質(zhì)中，但在配體結(jié)合后，分子伴侶解離，核受體-配體復(fù)合物轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中[44](以GR為例，圖2(a))。值得注意的是，一些核受體(如AR、GR和MR)必須在配體結(jié)合后才能與分子伴侶解離以轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中，而一些核受體(如ER、PR)可在無配體結(jié)合情況下轉(zhuǎn)移到細(xì)胞核中[45-46]。進入細(xì)胞核后，這類核受體會形成同源二聚體，與其DRE結(jié)合，該反應(yīng)元件為反向完全或不完全回文結(jié)構(gòu)，后通過招募共激活因子或共抑制因子以促進或抑制轉(zhuǎn)錄[47]。

表2 部分核受體二聚化界面參數(shù)Table 2 Interface parameters of dimerization of partial nuclear receptors

Ⅱ類：非類固醇核受體，這種核受體通常和RXR形成異源二聚體，不管是否存在激活配體，均存在于細(xì)胞核中。無配體結(jié)合時與共抑制因子形成復(fù)合物，激活配體結(jié)合后，共抑制因子解離，與共激活因子結(jié)合[48]。這種與RXR形成的異源二聚體結(jié)合的DRE為直接重復(fù)結(jié)構(gòu)[49](以RAR為例，圖2(b))。

Ⅲ類：孤兒核受體，這種核受體無激活配體時存在于細(xì)胞核中，其作用機制與第Ⅱ類核受體一致，區(qū)別就是該類核受體可自身形成同源二聚體與直接重復(fù)結(jié)構(gòu)的DRE結(jié)合[50](以VDR為例，圖2(c))。

圖2 核受體轉(zhuǎn)錄機制注：(a)GR-GR同源二聚體轉(zhuǎn)錄機制；(b)RAR-RXR異源二聚體轉(zhuǎn)錄機制；(c)VDR-VDR同源二聚體轉(zhuǎn)錄機制。Fig. 2 Transcription mechanism of nuclear receptorNote: (a) Transcription mechanism of GR-GR homodimer; (b) Transcription mechanism of RAR-RXR heterodimer; (c) Transcription mechanism of VDR-VDR homodimer.

2 內(nèi)分泌干擾物對核受體二聚的影響(Effect of endocrine disruptors on dimerization of nuclear receptors)

已經(jīng)有大量研究表明，EDCs與核受體的競爭結(jié)合過程和共因子招募過程對核受體最終的轉(zhuǎn)錄活動存在關(guān)鍵性作用[51-52]。但現(xiàn)有研究大都僅通過上述2個過程解釋內(nèi)分泌干擾活性存在假陰性或假陽性的結(jié)果[53](https://actor.epa.gov/edsp21/)，而有研究表明在考慮核受體的二聚過程后能夠降低這種誤差[54]。因此，研究內(nèi)分泌干擾物對于核受體二聚化作用的影響對于完善核受體介導(dǎo)的內(nèi)分泌干擾事件的分子機制以及準(zhǔn)確評估內(nèi)分泌干擾物的效應(yīng)具有重要意義。

2.1 內(nèi)分泌干擾物可引起核受體不同形式的二聚化

通過檢索ToxCast和Tox21數(shù)據(jù)庫中體外實驗的結(jié)果，發(fā)現(xiàn)針對ER做了比較完善的研究，包括化學(xué)物質(zhì)對ER競爭結(jié)合(NVS_NR_hER)和ER二聚化的測定，其中對ER二聚化的測定包括ERα-ERα同源二聚體(OT_ER_ERaERa_0480、OT_ER_ERaERa_1440)、ERα-ERβ異源二聚體(OT_ER_ERaERb_0480、OT_ER_ERaERb_1440)以及ERβ-ERβ同源二聚體(OT_ER_ERbERb_0480、OT_ER_ERbERb_1440)。數(shù)據(jù)庫中有多達(dá)227種EDCs物能夠影響ER二聚化(表3)。

不管在激動劑配體還是拮抗劑配體存在的條件下，ER都可進行二聚化[27]。然而，配體所誘導(dǎo)ER二聚化的類型是不同的，相比于ERα-ERα同源二聚體(6.09%～7.38%的活性率)，EDCs更易誘導(dǎo)ERα-ERβ異源二聚體(11.25%～12.22%的活性率)和ERβ-ERβ同源二聚體(10.02%～11.69%的活性率)(表3)。而有研究表明ERα和ERβ在調(diào)節(jié)雌激素作用中起相反作用，ERα-ERα同源二聚體促進激素依賴的乳腺癌細(xì)胞增殖，ERβ-ERβ同源二聚體對其起抑制作用，而ERα-ERβ異源二聚體在生物體中的作用尚不清楚[55-56]。Powell和Xu[56]發(fā)現(xiàn)植物雌激素染料木黃酮(genistein)、甘草黃素(liquiritigenin)可選擇性誘導(dǎo)ERα同源二聚體、ERβ同源二聚體和ERα-ERβ異源二聚體的產(chǎn)生，Coriano等[55]研究了12種類黃酮化合物對于ER二聚體的差異性誘導(dǎo)。

一些研究也表明EDCs能夠誘導(dǎo)其他核受體不同類型的二聚體形式。Depoix等[57]研究發(fā)現(xiàn)維生素D能夠促進VDR與RXR的異源二聚。Putcha等[58]研究發(fā)現(xiàn)了甲狀腺激素(3,5,3’-triiodothyronine, T3)和維甲酸(9-cis retinoic acid)在誘導(dǎo)TR-RXR異源二聚體間的負(fù)協(xié)同作用。Collingwood等[59]證明甲狀腺激素能夠促進TRβ和RXR的異源二聚。研究EDCs對不同類型二聚體的誘導(dǎo)對于研究內(nèi)分泌干擾物轉(zhuǎn)錄活性的生理學(xué)相關(guān)性具有重要意義。

2.2 二聚體與轉(zhuǎn)錄激活的關(guān)系

分析OECD報告(Series on Testing and Assessment No. 309; http://www.oecd.org/officialdocuments)中具有體外(invitro)和體內(nèi)(invivo)雌激素活性的14種參考化學(xué)品，其體外和體內(nèi)活性數(shù)據(jù)來自美國環(huán)境保護局(US Environmental Protection Agency, US EPA)開展的EDCs篩選項目(Endocrine Disruptor Screening Program, EDSP)中第一階段測試(Tier 1)的體外試驗和體內(nèi)子宮營養(yǎng)試驗。將參考化學(xué)品的活性數(shù)據(jù)和Toxcast和Tox21數(shù)據(jù)庫中數(shù)據(jù)對比研究發(fā)現(xiàn)，對于雌二醇、雌酮、己烯雌酚、5α-二氫睪酮、雙酚A、雙酚B、壬基酚、甲氧氯和滴滴涕等14種參考化學(xué)品，具有100%的二聚活性，但只有85.7%具有競爭結(jié)合活性(表4)。4-壬基酚、2,4’-滴滴涕這2種物質(zhì)，其同時具有體外和體內(nèi)雌激素活性，但不具有競爭結(jié)合活性，由此來看通過競爭結(jié)合活性預(yù)測化學(xué)物質(zhì)活性存在假陰性，結(jié)合二聚活性能夠更好地預(yù)測ER雌激素活性。Delfosse等[60]在研究雙酚A(bisphenol A, BPA)、雙酚C(bisphenol C, BPC)和雙酚AF(bisphenol AF, BPAF)的雌激素效應(yīng)的過程中發(fā)現(xiàn)，ERα同源二聚體晶體中兩邊單體內(nèi)BPA的結(jié)合模式與天然雌激素雌二醇(estradiol, E2)類似，BPC的結(jié)合模式與抗雌激素他莫昔芬(tamoxifen, OHT)類似，有趣的是BPAF在2個單體中的結(jié)合模式相反，一個類似E2，另一個類似OHT，這種差異可能表明不同的配體對于核受體二聚化的變構(gòu)調(diào)節(jié)，從而為藥物設(shè)計提供了新的視角。同源二聚體的2個單體之間存在調(diào)節(jié)串?dāng)_，配體與一個單體的結(jié)合會調(diào)節(jié)二聚體中另一個單體的構(gòu)象[61]。Judson等[62]使用包含ER配體結(jié)合、二聚化、轉(zhuǎn)錄激活和細(xì)胞增殖測定等在內(nèi)的16個體外測試開發(fā)模型以預(yù)測1 811種化學(xué)物質(zhì)的雌激素活性，發(fā)現(xiàn)基于至少4～7個體外實驗的亞組的預(yù)測準(zhǔn)確性和16個測試建立的模型相當(dāng)，這些亞組模型的主要區(qū)別在于采用的二聚化測定結(jié)果不同。

表3 針對雌激素受體的Toxcast和Tox21體外競爭結(jié)合和二聚化測試結(jié)果Table 3 In vitro ligand binding and dimerization test results of ToxCast and Tox21 for estrogen receptor

表4 參考化學(xué)品的體外、體內(nèi)雌激素活性及其二聚活性Table 4 Dimerization activity of reference chemicals and its estrogen activity in vitro and in vivo

Nadal等[35]測試了配體對于誘導(dǎo)AR二聚化的影響，發(fā)現(xiàn)激動物質(zhì)能夠誘導(dǎo)AR二聚化，拮抗物質(zhì)則不能。Depoix等[57]研究發(fā)現(xiàn)RAR激動劑能夠顯著增加RAR-RXR的異源二聚，而RAR拮抗劑能夠抑制RAR-RXR的異源二聚。核受體二聚化與其轉(zhuǎn)錄活性的顯著相關(guān)性表明在預(yù)測EDCs誘導(dǎo)核受體轉(zhuǎn)錄活性時必須考慮其對核受體二聚化的影響。

除了配受體結(jié)合、共因子招募這2個過程，考慮核受體二聚化過程對于研究內(nèi)分泌干擾效應(yīng)的產(chǎn)生至關(guān)重要。然而目前有關(guān)EDCs對核受體二聚化的影響，只對ER進行了相對比較完善的研究，包括EDCs對于2種亞型(ERα和ERβ)各自的同源二聚體以及其一起形成的異源二聚體的影響。但EDCs對于其他核受體同源或者異源二聚體形成的影響研究相對較少，且主要集中研究各自的內(nèi)源性配體化合物或者相關(guān)藥物，今后可加強研究EDCs對除ER以外的其他核受體的二聚化影響。

3 核受體二聚化的研究方法(Research methods of nuclear receptor dimerization)

檢測同源或異源二聚體間蛋白-蛋白相互作用對于揭示核受體調(diào)控機制至關(guān)重要。目前，研究蛋白-蛋白相互作用的實驗種類繁多，如基于蛋白結(jié)構(gòu)解析的核磁共振(nuclear magnetic resonance spectroscopy, NMR)實驗和X射線衍射(X-ray)實驗，該類方法條件嚴(yán)格且價格昂貴[63]；基于蛋白的免疫共沉淀技術(shù)(co-immunoprecipitation, co-IP)和蛋白質(zhì)微陣列技術(shù)(protein microarrays)，操作過程繁雜，無法檢測到瞬時作用，且無法在活細(xì)胞中測定[64]；另一種經(jīng)典的測試技術(shù)是酵母二雜交或三雜交(Y2H/Y3H)試驗，由于其簡單易用，該體內(nèi)技術(shù)被廣泛用于大規(guī)模檢測蛋白-蛋白相互作用，然而Y2H/Y3H常因酵母細(xì)胞中異種基因的表達(dá)而產(chǎn)生假陽性或假陰性結(jié)果[65]。為了克服以上缺陷，開發(fā)了一系列體內(nèi)檢測技術(shù)用于檢測活細(xì)胞中的蛋白-蛋白相互作用，如熒光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)(fluorescence resonance energy transfer, FRET)、生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移技術(shù)(bioluminescence resonance energy transfer, BRET)和生物分子熒光互補技術(shù)(bimolecular fluorescence complementation, BiFC)等，這些技術(shù)克服了非活體狀態(tài)分析蛋白間相互作用的局限性[66]，研究活細(xì)胞內(nèi)核受體二聚化的形成對包括信號傳導(dǎo)和轉(zhuǎn)錄調(diào)節(jié)在內(nèi)的多種細(xì)胞過程具有重要意義[56]。然而，由于體外細(xì)胞篩選大量的干擾物費時費力，計算機輔助的核受體二聚化研究應(yīng)運而生。

3.1 熒光共振能量轉(zhuǎn)移(FRET)

FRET技術(shù)的供體分子(donor)和受體分子(receptor)均為熒光蛋白(fluorescent protein, FP，如YFP)，其分別偶聯(lián)2個目標(biāo)蛋白，當(dāng)供體和受體分子間距離<10 nm時，處于激發(fā)態(tài)的供體熒光團通過偶極子間的相互作用將能量以非輻射的方式轉(zhuǎn)移給鄰近的受體分子，即產(chǎn)生能量轉(zhuǎn)移[67](圖3(a))。

Feige等[68]利用FRET研究發(fā)現(xiàn)PPAR在沒有配體的情況下很容易與RXR形成異源二聚體。Tamrazi等[27]以位點特異性方式用單個熒光團對ER進行化學(xué)標(biāo)記，基于FRET測量ERα-LBD二聚體的熱力學(xué)和動力學(xué)穩(wěn)定性，并將該方法用于評估ER配體的激動劑和拮抗劑活性。Schaufele等[69]利用FRET研究了分別用CFP和YFP標(biāo)記的AR二聚體的形成，發(fā)現(xiàn)AR的二聚化只發(fā)生在小分子配體結(jié)合后，并主要在細(xì)胞核內(nèi)。Nadal等[35]利用FRET測試了配體對于誘導(dǎo)AR二聚化的影響，發(fā)現(xiàn)激動物質(zhì)能夠誘導(dǎo)AR二聚化，拮抗物質(zhì)則不能。Yoshimura等[70]將磷酸化突變體RXRα(YFP-T82D/S260D-RXRα)與CFP-RARβ共轉(zhuǎn)染于HEK293T細(xì)胞，在細(xì)胞核中檢測到的FRET信號非常低，而未磷酸化的RXRα(YFP-T82A/S260A-RXRα)與CFP-RARβ轉(zhuǎn)染后的FRET效率與野生型RXRα相當(dāng)，表明磷酸化的RXRα喪失了與RXRβ異源二聚化的能力。

FRET具有高靈敏性和特異性，能夠提供NR相互作用的位置信息，并且能夠和顯微鏡、色譜技術(shù)等多種儀器和技術(shù)結(jié)合使用[71〗。但是FRET需要一對FP分別作為供體蛋白和受體蛋白，目前可用于FRET的供-受體對存在光漂白的缺陷，即供體的發(fā)射光譜和受體吸收光譜有明顯的重疊[72-73]。

3.2 生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移(BRET)

與FRET不同，BRET利用生物發(fā)光酶如海腎螢光素酶(renilla reniformis luciferase, Rluc)作為供體分子，熒光蛋白作為受體分子，當(dāng)兩者之間距離<10 nm時，供體分子在底物如腔腸素(coelenterazine)的催化下發(fā)光并將能量轉(zhuǎn)移給受體[73](圖3(b))。

Mulero等[74]利用BRET技術(shù)檢測PPAR-RXR異源二聚體的形成。Powell和Xu[56]利用BRET技術(shù)證明植物雌激素可選擇性誘導(dǎo)ERα同源二聚體、ERβ同源二聚體和ERα-ERβ異源二聚體的產(chǎn)生，由于不同二聚體的功能差異顯著，使得該方法可用于ER二聚體選擇性的雌激素類物質(zhì)篩選。Grossmann等[75]利用BRET研究MR同源二聚過程，發(fā)現(xiàn)二聚化發(fā)生在熱休克蛋白(heat shock proteins, HSPs)解離以及核轉(zhuǎn)移之后。Giner等[76]優(yōu)化了BRET方法，可直接測定核受體二聚體對COA的募集，通過比較了維甲酸類物質(zhì)(rexinoids)誘導(dǎo)的RXR-RXR同源二聚體、Nur77-RXR異源二聚體和Nurr1-RXR異源二聚體對COA的募集發(fā)現(xiàn)不同的同源和異源二聚體顯示出對COA的差異性募集活性。Cotnoir-White等[77]在BRET的基礎(chǔ)上開發(fā)了一種在活細(xì)胞中檢測三元復(fù)合物的方法，即生物發(fā)光共振能量轉(zhuǎn)移與熒光增強的聯(lián)合轉(zhuǎn)移(bioluminescence resonance energy transfer with fluorescence enhancement by combined transfer, BRETFect)，并用該方檢測E2、OHT等配體誘導(dǎo)的ERα-ERα同源二聚體與ERα-ERβ異源二聚體對COA的募集。

BRET不需要激發(fā)源，利用化學(xué)供體底物，背景熒光值可忽略不計，避免了FRET可能產(chǎn)生的光漂白問題，減少假陰性結(jié)果[56]。但BRET需要特定設(shè)備，且熒光素及底物價格昂貴，無法對比較弱的核受體間蛋白相互作用進行檢測[73,78]。

3.3 雙分子熒光互補(BiFC)

BiFC是最通用的蛋白質(zhì)互補分析(protein-fragment complementation assays, PCA)技術(shù)，其原理是將FP切開形成不發(fā)熒光的2個片段(N末端和C末端)，這2個片段分別與目標(biāo)蛋白融合，如果目標(biāo)蛋白相互作用，則2個互補片段彼此靠得足夠近可恢復(fù)它們的熒光活性[78](圖3(c))。

圖3 FRET(a)、BRET(b)和BiFC(c)原理圖注：FRET中當(dāng)熒光供體蛋白和熒光受體蛋白間距離<10 nm時，供體將能量轉(zhuǎn)移給受體；BRET利用生物發(fā)光酶作為供體分子， 熒光蛋白作為受體分子，當(dāng)兩者之間距離<10 nm時，供體將能量轉(zhuǎn)移給受體；BiFC將熒光蛋白切開形成不發(fā)熒光的2個片段 (N末端和C末端)，并分別與目標(biāo)蛋白融合，如果目標(biāo)蛋白相互作用，則會恢復(fù)熒光活性。Fig. 3 Schematic diagram of FRET (a), BRET (b) and BiFC (c)Note: FRET indicates that when the distance between the fluorescent donor protein and the fluorescent receptor protein is less than 10 nm, the donor transfers energy to the receptor; BRET uses bioluminescent enzymes as donor and fluorescent protein as receptor; when the distance between them is less than 10 nm, the donor transfers energy to the receptor; BiFC cleaves the fluorescent protein into two fragments (N-terminal and C-terminal) that do not fluoresce, which are fused with the target protein respectively; if the target protein interacts, the fluorescence activity will be restored.

利用BiFC將全長的ERα分別融合到Y(jié)FP突變體(citrine-YFP)的N末端和C末端并共轉(zhuǎn)染于COS-7細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)ERα激動劑E2、BPA、染料木黃酮和對羥基苯甲酸丁酯(butylparabene)，拮抗劑氟維司群(ICI)以及選擇性雌激素受體調(diào)節(jié)劑4-羥基他莫昔芬(4-OHT)都能劑量依賴性地增加ERα-ERα同源二聚體熒光信號；有趣的是，ICI和4-OHT誘導(dǎo)的熒光信號高于E2，這可能是由于配體誘導(dǎo)的二聚體或構(gòu)象差異所致[79]。雄激素受體剪接變異體(AR splice variants, AR-Vs)的表達(dá)上升被認(rèn)為是產(chǎn)生以AR為靶點的藥物抗藥性的重要機制，Xu等[80]使用BiFC研究了2個主要的AR-Vs，發(fā)現(xiàn)它們不僅彼此間發(fā)生同源和異源二聚化，而且還與全長雄激素受體異源二聚化，闡明了AR-V介導(dǎo)基因調(diào)控的機制，并為合理的藥物設(shè)計提供了重要的途徑。Bedi[81]將LXRα貢獻二聚化界面的關(guān)鍵氨基酸進行突變，使用BiFC表征LXRα突變體與RXRα和PPARα在活細(xì)胞中形成異源二聚體的能力，證明二聚化界面關(guān)鍵氨基酸突變能夠削弱二聚化效應(yīng)。

BiFC方法簡單直觀，既可以檢測蛋白之間的相互作用，也可以定位相互作用蛋白質(zhì)的位點，避免了用外源試劑處理細(xì)胞可能產(chǎn)生的問題[82]。但其目標(biāo)蛋白容易受到FP片段的影響，當(dāng)2個目標(biāo)蛋白包含在單一復(fù)合物中但彼此沒有相互作用時易產(chǎn)生假陽性結(jié)果[83]。

3.4 計算機模擬

隨著計算機技術(shù)的發(fā)展，分子動力學(xué)模擬(molecular dynamics, MD)越來越多地被用來研究生物大分子作用[84]。但大多數(shù)MD模擬針對核受體單體進行研究，主要涉及配受體結(jié)合過程和共因子招募過程[51, 85]，僅有少部分針對核受體二聚化過程進行模擬研究。

Zhuang等[86]利用經(jīng)典的分子動力學(xué)模擬(MD)和隨機加速分子動力學(xué)(random acceleration molecular dynamics, RAMD)模擬分別研究甲狀腺激素T3與TRα-LBD、TRβ-LBD和TRα/LBD-RXR/LBD異源二聚體的解離效應(yīng)，發(fā)現(xiàn)相比于TR單體，TR異源二聚體顯著影響T3的解離，這為研究其他TR配體提供了重要信息。Sonoda等[87]利用部分增強采樣分子動力學(xué)模擬(locally enhanced sampling molecular dynamics simulations)分別研究E2和雌激素受體調(diào)節(jié)劑雷洛昔芬(raloxifene, RAL)與ERα-LBD單體和ERα/LBD-ERα/LBD同源二聚體間的解離機制，發(fā)現(xiàn)相比于ER單體，其二聚化強烈抑制E2并改變RAL的解離路徑。模擬研究中配體的解離路徑的差異表明二聚化對于配體調(diào)節(jié)具有重要作用。Chakraborty等[88]利用分子動力學(xué)模擬證明ERα-ERα同源二聚體比ERα-ERβ異源二聚體更穩(wěn)定。此外，F(xiàn)ratev等[89]利用加速分子動力學(xué)(accelerated molecular dynamics, aMD)模擬研究發(fā)現(xiàn)內(nèi)分泌干擾物配體可以通過二聚體間的相互作用控制H12的位置，這對于核受體的激活至關(guān)重要。計算機模擬方法因其快速且省時省力等優(yōu)點，已成為輔助內(nèi)分泌干擾物質(zhì)干擾核受體研究的重要手段之一。

4 總結(jié)與展望(Conclusions and prospect)

天然激素調(diào)控的核受體作為轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子，幾乎參與了人體所有組織和器官的功能調(diào)節(jié)。作為環(huán)境化合物的重要干擾靶點，當(dāng)EDCs作用于核受體后，會導(dǎo)致人體內(nèi)分泌系統(tǒng)紊亂，最終產(chǎn)生不良結(jié)局。EDCs主要通過模仿或拮抗天然激素，與核受體結(jié)合并影響核受體的二聚化過程，核受體通過同源或異源二聚后形成多聚體，進一步結(jié)合到DNA反應(yīng)原件，通過共調(diào)節(jié)因子的招募過程最終調(diào)控轉(zhuǎn)錄活性。在以往研究中，人們主要著眼于受體-配體競爭結(jié)合、共調(diào)節(jié)因子招募以及核受體-DNA結(jié)合過程，但卻無法完美解釋許多內(nèi)分泌干擾過程。近幾年，越來越多的研究發(fā)現(xiàn)，核受體二聚化過程也對EDCs的內(nèi)分泌干擾活性存在決定性的作用。因此，本文就EDCs介導(dǎo)的核受體二聚化轉(zhuǎn)錄機制、核受體二聚化與轉(zhuǎn)錄活性間的關(guān)系以及基于活細(xì)胞的核受體二聚化研究方法進行了概述，以期為深入理解內(nèi)分泌干擾物質(zhì)的分子機制，推進化合物內(nèi)分泌干擾風(fēng)險評估提供參考。

核受體二聚化過程對于研究化合物的內(nèi)分泌干擾效應(yīng)至關(guān)重要，已有進展主要針對EDCs對ER二聚化的影響，而關(guān)于EDCs與其他核受體二聚化過程的研究較少，探究EDCs對核受體二聚化的影響道阻且長。核受體二聚化機制復(fù)雜，環(huán)境領(lǐng)域研究核受體二聚化的過程極其依賴于生命科學(xué)技術(shù)的發(fā)展，但目前生命科學(xué)領(lǐng)域?qū)Χ刍貏e是異源二聚化的作用機制和生物學(xué)功能尚不明確。解析核受體二聚化機制涉及很多生命科學(xué)相關(guān)實驗，這對環(huán)境領(lǐng)域的研究人員而言困難重重，今后在探究EDCs對核受體二聚化影響機制的過程中需加強與生命科學(xué)的合作。

然而面對數(shù)以萬計的未知內(nèi)分泌干擾活性的環(huán)境污染物，生化實驗已經(jīng)無法對其內(nèi)分泌干擾活性逐一檢測，且利用生化實驗進行二聚化測定費時費力費財。隨著計算機技術(shù)的發(fā)展，分子動力學(xué)模擬、分子對接等相關(guān)技術(shù)越來越多地被應(yīng)用于生物大分子作用的研究中。已有很多計算機輔助的相關(guān)技術(shù)被用于研究配受體結(jié)合和共因子招募過程，但有關(guān)內(nèi)分泌干擾物對核受體二聚化影響的計算機模擬研究相對較少。今后可更多的將計算機技術(shù)應(yīng)用于核受體二聚化過程的研究，并結(jié)合配受體結(jié)合和共因子招募過程，開發(fā)基于分子啟動事件的核受體內(nèi)分泌干擾篩查模型，為綠色化學(xué)的開發(fā)夯實基礎(chǔ)。