張濤，劉凱，孫一鑫，王孝天，方濤，吳亞平，馮志華,*

1. 江蘇海洋大學(xué)江蘇省海洋生物資源與環(huán)境重點實驗室，連云港 222005 2. 華東師范大學(xué)河口海岸學(xué)國家重點實驗室，上海 200241 3. 江蘇海洋大學(xué)江蘇省海洋生物技術(shù)重點實驗室，連云港 222005 4. 江蘇海洋大學(xué)江蘇省海洋生物產(chǎn)業(yè)技術(shù)協(xié)同創(chuàng)新中心，連云港 222005

微塑料通常指粒徑<5 mm的塑料顆粒或碎片[1]，自被發(fā)現(xiàn)以來備受國內(nèi)外研究者關(guān)注。海洋中的微塑料主要包括聚丙烯(PP)、聚氯乙烯(PVC)、聚酰胺(PA)、聚乙烯(PE)、聚苯乙烯(PS)和聚對苯二甲酸乙二酯(PET)等材質(zhì)[2]。其中，PP材質(zhì)的塑料既被廣泛應(yīng)用于汽車行業(yè)，也常用于制作薄膜和管材；PVC不僅在管材方面多有應(yīng)用，還可作為電線電纜的制作原料[3]；PA則在日常辦公生活、機(jī)械工程和物流運輸?shù)阮I(lǐng)域多有應(yīng)用[4-6]。研究發(fā)現(xiàn)，微塑料在海洋垂直斷面中均有分布，海水表層中主要漂浮著密度較低的微塑料，深海和海底沉積物中的微塑料則主要為高密度微塑料，還有一些低密度微塑料在潛流和風(fēng)力等的作用下向深海轉(zhuǎn)移，最終聚集在海底沉積物中[7]。Lattin等[8]研究發(fā)現(xiàn)美國圣莫妮卡灣和加州海域中，海底微塑料豐度高于中部和表層海水中微塑料豐度，且進(jìn)入海底的微塑料不易返回上層水體，海底沉積物最終將成為微塑料的儲藏庫[9-10]。此外，微塑料具有多種環(huán)境行為，例如，微塑料能夠在生物體內(nèi)長期積累，并對其繁殖等活動產(chǎn)生影響[11]。并且，部分微塑料可在海洋環(huán)境中穩(wěn)定存在數(shù)百年至幾千年，也可能對海洋生物有慢性毒性效應(yīng)[12]。

底棲多毛類動物雙齒圍沙蠶(Perinereisaibuhitensis)主要棲息于潮間帶，以沉積物中的有機(jī)物為食，是多種海洋生物的捕食對象[13]。有研究發(fā)現(xiàn)，雙齒圍沙蠶易受環(huán)境中毒害物質(zhì)影響，且在海洋生態(tài)系統(tǒng)的食物鏈中起重要的傳遞作用[14]。溫度、氨氮、pH、重金屬和持久性有機(jī)污染物(POPs)等對雙齒圍沙蠶生理和代謝能力可造成一定影響[15-18]。此外，沙蠶可作為指示生物用于評價河口生態(tài)系統(tǒng)中重金屬、石油烴等有毒污染物的污染程度[18-20]，其體內(nèi)乙酰膽堿酯酶(AchE)活性可評價環(huán)境污染物的毒性效應(yīng)[18,21-22]。有研究者認(rèn)為沙蠶比淺溝蛤(Scrobiculariaplana)更適合作為沉積物污染狀況評價的指示生物[23]。

微塑料作為一種新型污染物，近幾年一直是國際海洋環(huán)境研究的熱點話題。大量的研究已經(jīng)證實微塑料廣泛存在于我國近海及河口區(qū)的沉積物中[24-26]。沙蠶攝食微塑料并由此引發(fā)的一系列不良影響可能通過食物鏈的傳遞對近岸海洋生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性產(chǎn)生影響。雖然已有研究證實了微塑料對沙蠶行為的不良影響[27]，但是關(guān)于微塑料對雙齒圍沙蠶生理代謝的影響尚未見報道。因此，探究微塑料對沙蠶的生理代謝的影響對于評估微塑料對近岸海域的生態(tài)環(huán)境效應(yīng)具有重要意義。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 材料與實驗條件

實驗所用海水、海沙、海淤泥和雙齒圍沙蠶均取自江蘇省連云港市高公島鄉(xiāng)潮間帶，海水通過孔徑為0.45 μm的醋酸纖維濾膜過濾后曝氣24 h；海沙在采樣現(xiàn)場經(jīng)孔徑為880 μm的篩網(wǎng)初步篩分去除大顆粒物質(zhì)后密封保存，轉(zhuǎn)移至實驗室后冷凍(-22 ℃)保存，海沙在使用前用上述過濾后的海水進(jìn)行浸泡洗滌；海淤泥經(jīng)1 mm孔徑的不銹鋼標(biāo)準(zhǔn)篩過濾后裝于冰盒中，將雙齒圍沙蠶轉(zhuǎn)移至冰盒中進(jìn)行1～2周的投喂暫養(yǎng)。

實驗前停止投喂，饑餓處理48 h。每組選擇1只體長約10 cm，體質(zhì)量約2 g且體形完整健康的雙齒圍沙蠶置于燒杯中，放于培養(yǎng)箱中于21 ℃無光條件下連續(xù)實驗16 d，并定期使用漩渦式充氣增氧機(jī)進(jìn)行1 h微曝氣，實驗前后稱取雙齒圍沙蠶質(zhì)量(圖1)。

實驗所使用的微塑料顆粒經(jīng)Mastersize 2000激光粒度儀分析粒徑。實驗選用不同粒徑的PP、PA和PVC微塑料顆粒(均為廣東省東莞市樟木頭樂華塑膠商行產(chǎn)品)，具體參數(shù)如表1所示。3種不同材質(zhì)的微塑料與海沙分別以不同質(zhì)量比混合均勻，設(shè)置0.1%(1 000 mg·kg-1)、1%(10 000 mg·kg-1)和5%(50 000 mg·kg-1)共3個不同濃度組[28]，最后加入約0.5 mm海沙覆蓋，以防止微塑料上浮?？瞻讓φ战M不添加微塑料顆粒，對照組與實驗組使用經(jīng)相同步驟處理的海沙，實驗組和對照組均設(shè)置3個重復(fù)。實驗參數(shù)的測定時間分別為0.5、2、4、8和16 d。

1.2 酶活性的測定

本研究分別測定過氧化氫酶(CAT)和乙酰膽堿酯酶(AchE)的活性。測定前制備組織勻漿，迅速稱取0.5 g的雙齒圍沙蠶頭部約15體節(jié)置于玻璃勻漿器中(冰水浴，0 ℃)，然后按1∶9(m∶V)比例加入0.9%的生理鹽水進(jìn)行機(jī)械勻漿，置于高速冷凍離心機(jī)中于4 ℃、2 500 r·min-1條件下離心10 min，取上清液，立即稀釋，用試劑盒(南京建成生物技術(shù)有限公司)測定CAT和AchE活性。

1.3 排氨率的測定

排氨率(N) (mg·(L·g·d)-1)計算公式為：

N=(Nt-N0)/(m×t)

式中：Nt為實驗時水體的氨氮質(zhì)量濃度(mg·L-1)；N0為對照組起始時水體的氨氮質(zhì)量濃度(mg·L-1)；m為沙蠶的質(zhì)量(g)；t為實驗持續(xù)時間(d)。

1.4 呼吸速率的測定

能量代謝以雙齒圍沙蠶的氧氣消耗速率，即呼吸速率來表征，單位為mg·(L·g·s)-1。測定之前用過濾海水將雙齒圍沙蠶洗凈，置于盛有100 mL干凈海水的玻璃錐形瓶中，瓶底部放有磁轉(zhuǎn)子用以均質(zhì)化水中的溶解氧。氧電極探頭放入錐形瓶中充分浸入海水(水溫20 ℃)，并以封口膜封住瓶口。將20 ℃時蒸餾水中的飽和溶解氧值8.82 mg·L-1設(shè)定為100%，測定在該溫度下雙齒圍沙蠶的耗氧量，時間間隔為5 s，共計數(shù)11次[31]。

圖1 不同濃度微塑料作用于雙齒圍沙蠶實驗示意圖注：PP表示聚丙烯，PA表示聚酰胺，PVC表示聚氯乙烯。Fig. 1 Schematic diagram of the experiment of different concentrations of microplastics on P. aibuhitensis Note: PP means polypropylene; PA means polyamide; PVC means polyvinyl chloride.

表1 實驗中微塑料材質(zhì)、粒徑和密度Table 1 Components, size and density arrangement of microplastics in experiment

耗氧率(R)(mg·(L·g·s)-1)計算公式為：

R=(Dt-D0)/(m×t)

式中：Dt為實驗時水樣的溶解氧濃度(mg·L-1)；D0為對照組起始時水樣的溶解氧濃度(mg·L-1)；m為沙蠶的質(zhì)量(g)；t為實驗持續(xù)時間(s)。

1.5 數(shù)據(jù)處理與分析

所有數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換和分析均在SPSS 23.0軟件上進(jìn)行，采用秩和檢驗(Wilcoxon-Mann-Whitney)，顯著性水平為P<0.05或P<0.01，運用Origin pro 2019繪制圖表。

2 結(jié)果(Results)

2.1 微塑料對雙齒圍沙蠶CAT和AchE活性的影響

實驗過程中雙齒圍沙蠶在培養(yǎng)1 d后均潛入沙土中，在16 d的實驗中無死亡且無明顯排泄物產(chǎn)生，實驗前后雙齒圍沙蠶體質(zhì)量未出現(xiàn)明顯變化(<0.02 g)。實驗前后對照組中的雙齒圍沙蠶在實驗前后CAT活性變化波動較小，處于較穩(wěn)定的狀態(tài)，在(12.00±0.70)～(15.00±0.73) U·mg-1濃度范圍內(nèi)。實驗組雙齒圍沙蠶體內(nèi)CAT活性變化如圖2所示，隨著實驗時間的延長，PP和PVC實驗組整體呈現(xiàn)先增高后降低趨勢。對于PA實驗組，在低濃度(0.1%)下總體呈現(xiàn)先增高后降低又增高趨勢，在中高濃度(1%和5%)下則呈現(xiàn)出降低再增高又降低的趨勢。在為期16 d的實驗過程中，微塑料濃度對雙齒圍沙蠶CAT活性存在顯著影響(P>0.05)，且隨著微塑料濃度升高，CAT活性隨之升高。在5%濃度不同材質(zhì)微塑料環(huán)境下雙齒圍沙蠶CAT活性均于實驗4 d出現(xiàn)最大值。在實驗4 d時，攝入5%濃度PP微塑料后雙齒圍沙蠶CAT活性達(dá)到最高，為(45.00±2.49) U·mg-1，是對照組CAT活性的3.46倍。

如圖3所示，對照組中雙齒圍沙蠶在實驗前后AchE活性處于相對穩(wěn)定狀態(tài)，濃度范圍在(0.75±0.04)～(0.96±0.05) U·mg-1。隨著實驗時間的延長，實驗組雙齒圍沙蠶AchE活性呈現(xiàn)先升高后降低趨勢，并在高濃度(5%)微塑料下，雙齒圍沙蠶AchE活性與對照組相比顯著升高(P<0.05)。在攝入5%濃度PP微塑料后，雙齒圍沙蠶AchE活性于4 d達(dá)到最高，為(2.20±0.10) U·mg-1，與對照組相比增長了193.33%；而在4 d攝入5%濃度PVC微塑料后雙齒圍沙蠶體內(nèi)AchE活性，僅為(1.14±0.05) U·mg-1，與對照組相比增長了34.11%。除此之外，在低濃度(0.1%)PVC實驗組出現(xiàn)抑制雙齒圍沙蠶AchE活性的情況，在16 d時與對照組相比AchE活性降低了34.11%，僅在高濃度(5%)微塑料環(huán)境下較對照組雙齒圍沙蠶體內(nèi)AchE活性有明顯提高。

圖2 不同材質(zhì)微塑料暴露下雙齒圍沙蠶體內(nèi)過氧化氫酶(CAT)活性變化Fig. 2 Catalase (CAT) activity of P. aibuhitensis exposed to different materials of microplastics

圖3 不同材質(zhì)微塑料暴露下雙齒圍沙蠶體內(nèi)乙酰膽堿酯酶(AchE)活性變化Fig. 3 Acetylcholinesterase (AchE) activity of P. aibuhitensis exposed to different materials of microplastics

2.2 微塑料對雙齒圍沙蠶排氨率的影響

2.3 微塑料對雙齒圍沙蠶呼吸速率的影響

由圖5可知，對照組雙齒圍沙蠶的呼吸速率在(0.011±0.001)～(0.014±0.001) mg·(L·g·s)-1之間變化，且不隨時間推移有顯著波動(P>0.05)。在實驗組中，隨著實驗時間的延長，雙齒圍沙蠶呼吸速率在0.5～4 d有明顯提高，在8 d之后，1%濃度不同材質(zhì)微塑料暴露下雙齒圍沙蠶呼吸速率維持在0.050 mg·(L·g·s)-1左右，約為對照組的5倍。本研究發(fā)現(xiàn)，由于雙齒圍沙蠶攝入微塑料的材質(zhì)不同，其呼吸速率有顯著差異(P<0.01)。但是，暴露時間的長短對雙齒圍沙蠶呼吸速率并未產(chǎn)生明顯影響(P>0.05)，而與環(huán)境中微塑料的濃度存在明顯的劑量關(guān)系，隨微塑料濃度的增加，5%濃度實驗組雙齒圍沙蠶的呼吸速率顯著提高(P<0.01)。

表2 不同微塑料暴露組水體氨氮濃度變化Table 2 Changes of ammonia nitrogen concentration exposed to different materials of microplastics (mg·L-1)

圖4 不同材質(zhì)微塑料暴露下雙齒圍沙蠶的排氨率變化Fig. 4 The ammonia excretion rate of P. aibuhitensis exposed to different materials of microplastics

圖5 不同材質(zhì)微塑料暴露下沙蠶的呼吸速率變化Fig. 5 Respiration rate of P. aibuhitensis exposed to different materials of microplastics

3 討論(Discussion)

生物體在受到重金屬、持久性有機(jī)污染物等環(huán)境污染物脅迫時，細(xì)胞內(nèi)會積累大量活性氧分子(ROS)，并且激活機(jī)體內(nèi)活性氧防護(hù)系統(tǒng)(過氧化氫酶、超氧化物歧化酶和過氧化物酶)以保護(hù)機(jī)體。此類酶主要參與將組織中有毒的H2O2轉(zhuǎn)化為無毒性的H2O和O2的代謝過程，因此其酶活大小反應(yīng)機(jī)體能否正常生存[32]。本研究發(fā)現(xiàn)，雙齒圍沙蠶在攝入微塑料后組織中CAT活性顯著提高，具體表現(xiàn)為先升高后降低，表明沙蠶在不同微塑料濃度作用下細(xì)胞可能受到一定程度的損傷，沙蠶體內(nèi)抗氧化物酶對微塑料顆粒產(chǎn)生的氧化脅迫作用作出響應(yīng)。并且，不同濃度的微塑料與CAT的活性之間存在顯著的劑量-效應(yīng)關(guān)系，Cd2+和苯并芘等污染物對沙蠶的酶活影響具有類似的規(guī)律[33]，但是作用機(jī)制不同。重金屬的生物毒性主要表現(xiàn)為細(xì)胞中累積并長期產(chǎn)生毒性效應(yīng)，而微塑料作為一種顆粒態(tài)環(huán)境污染物主要通過生物的口進(jìn)入消化道累積，同時生物體對于微塑料也具有一定的清除能力。目前的研究也表明，微塑料對生物體的不良影響主要包括磨損或阻塞消化道造成機(jī)械損傷、降低濾食率和生長率、導(dǎo)致能量消耗和氧化脅迫等[34-35]。本研究中，隨微塑料濃度提高至高濃度水平時，雙齒圍沙蠶體內(nèi)的CAT活性并沒有進(jìn)一步提高而是維持在與中濃度實驗組活性相當(dāng)?shù)乃剑憩F(xiàn)為機(jī)體對于氧化脅迫的適應(yīng)性。

乙酰膽堿酯酶(AchE)在神經(jīng)系統(tǒng)的信息傳導(dǎo)中起著關(guān)鍵作用，是生物體內(nèi)一種極為重要的水解酶。國外有研究者以海洋無脊椎動物體內(nèi)AchE活性為指標(biāo)，評價并揭示環(huán)境污染程度[36]。Oliveira等[37]研究發(fā)現(xiàn)，鰕虎魚(Pomatoschistusmicrops)體內(nèi)的AchE在微塑料與芘復(fù)合作用下活性顯著下降，表明微塑料與芘復(fù)合后會對鰕虎魚產(chǎn)生生物毒性作用。本研究中，暴露于低濃度微塑料中的雙齒圍沙蠶體內(nèi)的AchE活性出現(xiàn)了抑制現(xiàn)象，最大的抑制率達(dá)50%，表明微塑料對雙齒圍沙蠶神經(jīng)系統(tǒng)存在脅迫作用。而與高毒性物質(zhì)有機(jī)磷農(nóng)藥相比[32]，在為期16 d的暴露實驗中，不同濃度微塑料環(huán)境中雙齒圍沙蠶均未出現(xiàn)死亡現(xiàn)象，可能由于PP、PA本身無毒性，但PVC材質(zhì)的微塑料顆粒能夠釋放含氯的有毒物質(zhì)，從而對生物體產(chǎn)生毒性效應(yīng)。目前微塑料的毒性效應(yīng)多集中于對浮游生物、貝類和魚類的生長、存活等方面的影響[34,38-40]。本研究發(fā)現(xiàn)PP和PA對沙蠶無顯著毒性效應(yīng)，但是對于酶活具有刺激效應(yīng)。原因可能是暴露時間較短或者沙蠶長期生活于復(fù)雜的地質(zhì)環(huán)境中對于微塑料本身具有較高的耐受性，因此，有必要在更高濃度中以及更長的暴露時間下進(jìn)行試驗。此外，也可能由于本研究使用的方法與檢測的指標(biāo)不夠敏感，未能反映出微塑料對生物體的毒性效應(yīng)。

本研究中，不同材質(zhì)微塑料對雙齒圍沙蠶呼吸速率均有顯著影響。Holloway等[41]認(rèn)為生物機(jī)體通過提高自身呼吸速率從而獲得額外能量以對抗外界污染環(huán)境的脅迫作用，這很好解釋了本實驗中暴露于微塑料中的雙齒圍沙蠶呼吸速率較對照組高。并且，微塑料的攝入顯著增強(qiáng)雙齒圍沙蠶的物質(zhì)能量代謝效率，實驗組水體中的銨鹽含量較對照組出現(xiàn)了高積累現(xiàn)象。Green等[28]發(fā)現(xiàn)將雙齒圍沙蠶暴露于微塑料后，其代謝效率明顯增強(qiáng)，且不同材質(zhì)的微塑料產(chǎn)生的影響程度亦不相同。但是，本研究實驗結(jié)束后雙齒圍沙蠶體質(zhì)量變化<0.02 g，這可能是由于暴露時間較短，養(yǎng)殖所用沙土中仍有大量有機(jī)質(zhì)供雙齒圍沙蠶攝食，微塑料的存在并未對其短期生長產(chǎn)生明顯抑制作用。此外，實驗組雙齒圍沙蠶較對照組分泌粘液更多，且隨微塑料濃度的升高而增多。該結(jié)果與暴露于重金屬的沙蠶體表粘液分泌較多類似，是雙齒圍沙蠶對微塑料脅迫響應(yīng)的一種生理適應(yīng)機(jī)制[42]。

研究表明，微塑料因其粒徑較小，易進(jìn)入生物體內(nèi)并在鰓、胃、肝臟和胰腺等不同器官積累，從而嚴(yán)重威脅機(jī)體正常生長發(fā)育和物質(zhì)能量代謝[43]。隨著微塑料在環(huán)境中豐度的日益升高，其可能造成的生物毒性效應(yīng)和隨食物鏈的傳遞和累積更應(yīng)該值得關(guān)注。然而，目前所知微塑料對于生物的毒性機(jī)制仍然十分有限，需要開展更多的研究以應(yīng)對微塑料污染可能對生態(tài)系統(tǒng)的功能性和穩(wěn)定性造成的潛在危害。

本研究發(fā)現(xiàn)，隨環(huán)境中微塑料濃度的提高，雙齒圍沙蠶體內(nèi)CAT活性顯著提升。攝入PVC的雙齒圍沙蠶體內(nèi)AchE活性在低濃度(0.1%)時受到抑制，在高濃度(5%)下受到促進(jìn)，而攝入PP和PA的雙齒圍沙蠶體內(nèi)AchE酶活性在不同濃度下均表現(xiàn)為促進(jìn)作用。隨暴露時間的推移，雙齒圍沙蠶的排氨率發(fā)生顯著變化，且隨微塑料濃度的提高，呼吸速率也有顯著提升。因此，微塑料在高濃度情況下，可以對雙齒圍沙蠶產(chǎn)生氧化脅迫作用，并一定程度上影響其排氨率和呼吸速率。但是，微塑料對沙蠶的毒性作用機(jī)制仍需進(jìn)一步研究，在后期研究中有必要深入進(jìn)行雙齒尾沙蠶的組織、細(xì)胞和基因水平的試驗。