程志斌，劉艷菊,,*，郭青云，楊崢，鐘震宇，李俊芳，單云芳，孟玉萍，王欣欣

1. 北京麋鹿生態(tài)實(shí)驗(yàn)中心，北京 100076 2. 北京市科學(xué)技術(shù)研究院分析測(cè)試研究所(北京市理化分析測(cè)試中心)，北京 100089

城市化和工業(yè)化的發(fā)展導(dǎo)致了嚴(yán)重的全球性大氣污染問(wèn)題，其中，極端的“霧霾”污染天氣對(duì)人類健康的危害成為近年來(lái)社會(huì)各界普遍關(guān)注的焦點(diǎn)[1-5]。機(jī)動(dòng)車作為最重要的交通工具，其產(chǎn)生的尾氣已經(jīng)成為城市道路大氣細(xì)顆粒物PM2.5(空氣動(dòng)力學(xué)直徑≤2.5 μm的顆粒物)污染的主要來(lái)源[6-8]。其中，柴油車尾氣(diesel engine exhaust, DEE)排放的污染物包含一氧化碳、氮氧化物、碳?xì)浠衔?、二氧化硫、多環(huán)芳烴和柴油車尾氣顆粒物(diesel exhaust particles, DEPs)等有害物質(zhì)[9-10]。研究表明，在同等功率下，柴油車尾氣的毒性是汽油車尾氣毒性的100倍[11]，嚴(yán)重危害人體健康，導(dǎo)致呼吸系統(tǒng)[12]、神經(jīng)系統(tǒng)[13]和泌尿系統(tǒng)[14]等的組織細(xì)胞氧化、炎癥和DNA損傷，甚至誘發(fā)癌變[15-17]。

大氣細(xì)顆粒污染物給健康造成危害的致病機(jī)制一直是科學(xué)家探索的命題[18-21]。研究者認(rèn)為，DEPs具有重要的生物學(xué)毒性作用，長(zhǎng)期暴露的情況下，會(huì)侵入小鼠肺組織細(xì)胞、誘導(dǎo)Th2型炎癥反應(yīng)，造成肺組織DNA損傷，原因在于DEPs的表面電荷達(dá)-39.1 mV且具有許多粒徑<1 mm的顆粒物(有的粒徑為20 nm)，以及其化學(xué)組分中含有大量的銅和鈣等金屬氧化物[22]。研究發(fā)現(xiàn)，在暴露箱中暴露于1 mg·m-3或6 mg·m-3柴油車尾氣4周后，雄性Lambda/LacI轉(zhuǎn)基因鼠的肺組織DNA損傷程度和LacI基因的突變頻率均顯著高于對(duì)照組[23]。體外細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，DEPs會(huì)引起人的A549肺細(xì)胞和小鼠原始巨噬細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)，導(dǎo)致膜泄露、脂質(zhì)過(guò)氧化、細(xì)胞炎癥等，致使細(xì)胞DNA受到損傷[24]。盡管人們已從不同側(cè)面獲取了大氣細(xì)顆粒物污染給健康造成危害的信息，但復(fù)雜的致病機(jī)制仍無(wú)定論[25]。本研究通過(guò)自制暴露箱對(duì)小鼠進(jìn)行亞慢性暴露實(shí)驗(yàn)，采用柴油發(fā)動(dòng)機(jī)模擬未安裝凈化設(shè)施的柴油車尾氣暴露場(chǎng)景，研究柴油車尾氣對(duì)小鼠肺組織的氧化炎癥損傷和病理?yè)p傷作用，同時(shí)觀測(cè)暴露過(guò)程中柴油燃料尾氣的主要污染氣體及PM2.5化學(xué)成分含量，分析其對(duì)肺組織細(xì)胞凋亡及凋亡相關(guān)Bcl-2與Bax蛋白表達(dá)的影響情況，為探索柴油車尾氣排放對(duì)動(dòng)物機(jī)體的健康危害機(jī)制提供重要的實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料與方法(Materials and methods)

1.1 主要儀器設(shè)備與試劑耗材

主要儀器設(shè)備：拖拉機(jī)(福田歐豹400型，中國(guó))、中流量顆粒物采樣器(嶗應(yīng)2030，青島嶗山應(yīng)用技術(shù)研究所，中國(guó))、離子色譜儀(ICS 2000，Dionex公司，美國(guó))、元素碳/有機(jī)碳分析儀(DRI Model 2001A，Atmoslytic公司，美國(guó))、X射線熒光分析儀(MESA-50，HORIBA公司，日本)、氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(7890A-5977C，安捷倫公司，美國(guó))、全自動(dòng)生化儀(TBA-120FR ACCUTE型，東芝公司，日本)、可見(jiàn)光分光光度計(jì)(7200，上海優(yōu)尼柯儀器有限公司，中國(guó))、放射免疫儀(XH6080，西安核儀器廠，中國(guó))、光吸收酶標(biāo)儀(SunriseTMF50，帝肯，瑞士)、倒置顯微鏡(Nikon Ci-S，尼康公司，日本)、體視顯微鏡(SZ61，Olympus有限公司，日本)、穩(wěn)壓穩(wěn)流電泳儀(Powerpac HQ，Bio-Rad公司，美國(guó))、數(shù)碼凝膠成像系統(tǒng)(2020D，BINTA公司，中國(guó))、計(jì)算機(jī)圖像分析儀(Image-Pro Plus Analysis Software)、煙氣分析儀(Testo 340，德圖，德國(guó))、煙氣探針(Testo 0409 1202，德圖，德國(guó))、CO檢測(cè)儀(EM-20，香港澳洲新儀器，中國(guó))。

主要試劑耗材：石英濾膜(1851-090，Whatman公司，英國(guó))、柴油(0#中國(guó)石化)；小鼠白細(xì)胞介素6(interleukin-6, IL-6)、乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase, LDH)、腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor-α, TNF-α)、轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β(transforming growth factor-β, TGF-β)試劑盒(北京冬歌生物科技有限公司，中國(guó))；總抗氧化能力(total antioxidation capacity, T-AOC)試劑盒(100T/96S，蘇州科銘生物技術(shù)有限公司，中國(guó))、超氧化物歧化酶(superoxide dismutase, SOD)試劑盒(9670087，蘇州科銘生物技術(shù)有限公司，中國(guó))、丙二醛(malonic dialdehyde, MDA)試劑盒(0041235，蘇州科銘生物技術(shù)有限公司，中國(guó))、谷胱甘肽過(guò)氧化物酶(glutathione peroxidase, GSH-Px)試劑盒(A005，南京建成生物工程研究所，中國(guó))、Bax抗體(2772S，上海江林生物科技有限公司，中國(guó))、Bcl-2抗體(3498S，上海江林生物科技有限公司，中國(guó))、GAPDH抗體(KM9002，天津三箭生物技術(shù)有限公司，中國(guó))、羅氏TUNEL檢測(cè)細(xì)胞凋亡試劑盒；自制的50 L鋁箔氣袋；自制的1 m×1 m×0.5 m的聚四氟乙烯可密封的暴露箱。

1.2 暴露實(shí)驗(yàn)氣體制備和PM2.5樣品采集與化學(xué)成分測(cè)定

1.2.1 暴露氣體制備和PM2.5樣品采集

以柴油為燃料的拖拉機(jī)怠速運(yùn)行10 min廢氣排放狀態(tài)穩(wěn)定后，把不銹鋼采樣管伸入排氣管內(nèi)3 cm處，以100 L·min-1的流速把尾氣吸入自制的50 L鋁箔氣袋至飽滿，備亞慢性暴露實(shí)驗(yàn)用。用配有PM2.5采樣頭的中流量顆粒物采樣器在石英膜上同步采集2份PM2.5平行樣品，以備分析質(zhì)量濃度和化學(xué)物質(zhì)。參照文獻(xiàn)[26-27]對(duì)采樣前后的濾膜進(jìn)行預(yù)處理并用十萬(wàn)分之一天平稱重，獲得PM2.5的質(zhì)量濃度。

1.2.2 化學(xué)成分的測(cè)定

1.3 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物及亞慢性暴露實(shí)驗(yàn)

1.3.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

購(gòu)買北京華阜康生物科技股份有限公司(合格證號(hào)：11401300053484)的30只雄性7周齡SPF級(jí)ICR(Institute of Cancer Research，費(fèi)城癌癥研究所)小鼠，體質(zhì)量38 g±2 g，每個(gè)鼠籠飼養(yǎng)2只鼠。實(shí)驗(yàn)在室溫(22～29 ℃)下進(jìn)行，飼養(yǎng)場(chǎng)所每日消毒，操作人員穿著防護(hù)服，以保證潔凈的生長(zhǎng)環(huán)境。小鼠實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)性飼養(yǎng)1周。

1.3.2 亞慢性暴露實(shí)驗(yàn)

將小鼠隨機(jī)分為4個(gè)處理：1個(gè)對(duì)照組(blank control group, BCG)，即小鼠直接暴露于室內(nèi)空氣中(6只小鼠)；另外3個(gè)柴油暴露組均在可密封聚四氟乙烯暴露箱(1 m×1 m×0.5 m)內(nèi)完成，分別為0.5 h柴油暴露組(0.5 h diesel engine exhaust exposure groups, 0.5 h DEEG) (8只小鼠，箱內(nèi)柴油車尾氣日暴露0.5 h)、1 h柴油暴露組(1 h DEEG) (8只小鼠，箱內(nèi)柴油車尾氣日暴露1 h)、2 h柴油暴露組(2 h DEEG) (8只小鼠，箱內(nèi)柴油車尾氣日暴露2 h)。用不銹鋼波紋管密封連接已采集有柴油車尾氣的毒氣袋及暴露箱，通過(guò)控制PVC球閥、采用慢速氣泵，把袋內(nèi)氣體緩慢泵入已放置了小鼠的暴露箱內(nèi)，袋內(nèi)氣體完全泵入暴露箱后密封接口，讓小鼠按上述處理設(shè)計(jì)在柴油車尾氣中分別暴露0.5、1和2 h后，取出小鼠籠，打開(kāi)密封蓋，完全置換為新鮮空氣，至此完成1 d的暴露實(shí)驗(yàn)。亞慢性染毒時(shí)間參考汪正東等[29]的大鼠亞慢性呼吸染毒效應(yīng)研究，連續(xù)暴露實(shí)驗(yàn)95 d。

1.3.3 暴露氣體化學(xué)組分測(cè)定

柴油車尾氣亞慢性暴露的過(guò)程中，用煙氣分析儀和煙氣探針(泵速0.6 L·min-1)隨機(jī)測(cè)量暴露箱內(nèi)(每天小鼠進(jìn)入暴露箱開(kāi)始暴露的階段和暴露快結(jié)束之前階段)的O2、NOx、NO2、NO和SO2，CO檢測(cè)儀隨機(jī)測(cè)量暴露箱內(nèi)CO的氣體濃度。

1.4 動(dòng)物樣本制備及指標(biāo)測(cè)定

亞慢性暴露實(shí)驗(yàn)結(jié)束后，使用乙醚將實(shí)驗(yàn)鼠麻醉，然后采用頸椎脫臼法處死實(shí)驗(yàn)鼠。(1)采集右側(cè)鮮肺組織，-80 ℃下保存，根據(jù)相應(yīng)試劑盒提供的方法，采用雙抗體一步夾心法檢測(cè)炎癥指標(biāo)IL-6、LDH、TGF-β和TNF-α，微量法檢測(cè)T-AOC、MDA和SOD，比色法檢測(cè)GSH-Px；每組隨機(jī)選擇5只小鼠的鮮肺組織，用Western blot檢測(cè)凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2的表達(dá)；(2)采集左側(cè)鮮肺(同一部位)，用福爾馬林固定，制作蠟塊；HE染色后制作肺組織病理切片，觀察病理變化情況；每組隨機(jī)選擇4只小鼠的肺組織蠟塊，用TUNEL法檢測(cè)肺組織細(xì)胞凋亡率。

細(xì)胞凋亡率分析方法：從每個(gè)處理組的每張切片隨機(jī)挑選5個(gè)200倍視野進(jìn)行拍照。應(yīng)用Image-Pro Plus 6.0軟件選取相同的棕黃色細(xì)胞核作為判斷所有照片陽(yáng)性細(xì)胞的統(tǒng)一標(biāo)準(zhǔn)，選取相同的藍(lán)色細(xì)胞核為總細(xì)胞，對(duì)每張照片進(jìn)行分析，得出每張照片陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)以及總細(xì)胞數(shù)，并求出陽(yáng)性細(xì)胞百分比((陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)/總細(xì)胞數(shù))×100)即為凋亡率(%)。

1.5 數(shù)據(jù)分析

用Excel和SPSS 17.0軟件計(jì)算平均值和標(biāo)準(zhǔn)差，對(duì)各組之間IL-6、LDH、TNF-α、TGF-β、T-AOC、SOD、MDA和GSH-Px等炎癥反應(yīng)和氧化應(yīng)激指標(biāo)，Bax蛋白、Bcl-2蛋白和細(xì)胞凋亡率，以及暴露箱內(nèi)污染物濃度的差異性進(jìn)行單因素方差分析(One-Way ANOVA)，CO因均超過(guò)儀器量程無(wú)法統(tǒng)計(jì)差異性。方差齊性采用LSD檢驗(yàn)，方差非齊性采用Dunnett’s T3檢驗(yàn)，并繪制柱狀圖(平均值和標(biāo)準(zhǔn)誤)。

2 結(jié)果(Results)

2.1 亞慢性暴露箱內(nèi)柴油車尾氣中的氧氣和各類污染物濃度

統(tǒng)計(jì)分析表明，各組暴露箱在每天小鼠進(jìn)入暴露箱的開(kāi)始暴露階段和暴露快結(jié)束之前階段內(nèi)O2濃度和污染物濃度差異均不顯著(P>0.05)。暴露箱內(nèi)O2濃度為20.7%(表1)，達(dá)正常空氣中的濃度值；柴油車尾氣污染物濃度均偏高(表1)，污染物濃度平均值嚴(yán)重超過(guò)《環(huán)境空氣質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(GB3095—2012)中二級(jí)小時(shí)濃度限值，是其限值的數(shù)倍，例如，NOx可達(dá)15倍，NO2為18.5倍，SO2為8.64倍，CO為10.4倍。柴油車尾氣PM2.5中所測(cè)定的各類污染物中，OC濃度最高，高達(dá)2 309.53 μg·m-3，占PM2.5中總化學(xué)物質(zhì)濃度的51.95%；其次是EC，為2 035.05 μg·m-3，占45.78%；再次是陰離子和陽(yáng)離子，分別為57.43 μg·m-3和42.37 μg·m-3，各占1.29%和0.95%，最低的為7種重金屬，為0.023 μg·m-3，占0.0005‰。PAHs中芘的含量最高，為218.56 ng·m-3，其次為熒蒽，為166.83 ng·m-3，苯并(a)芘的含量高達(dá)98.17 ng·m-3(表2)。

2.2 柴油車尾氣亞慢性暴露對(duì)小鼠肺炎癥指標(biāo)的影響

統(tǒng)計(jì)分析表明，1 h柴油暴露組、2 h柴油暴露組小鼠肺組織的LDH分泌水平均顯著高于對(duì)照組(P<0.05)，3個(gè)柴油暴露組小鼠肺組織的IL-6、TNF-α和TGF-β的分泌水平與對(duì)照組無(wú)顯著差異(圖1)。這表明，柴油車尾氣亞慢性暴露會(huì)導(dǎo)致小鼠肺組織LDH的分泌顯著升高，但對(duì)IL-6、TNF-α和TGF-β的分泌無(wú)顯著影響。

2.3 柴油車尾氣亞慢性暴露對(duì)小鼠肺的氧化損傷

統(tǒng)計(jì)分析表明，1 h柴油暴露組、2 h柴油暴露組小鼠肺組織的T-AOC活性均顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；2 h柴油暴露組的GSH-Px活性顯著低于對(duì)照組(P<0.05)；各組之間MDA含量和SOD活性無(wú)顯著差異(圖2)。這表明，柴油車尾氣亞慢性暴露導(dǎo)致小鼠肺組織的T-AOC和GSH-Px活性降低，造成肺組織氧化損傷。

表1 亞慢性暴露箱內(nèi)氧氣及污染物濃度Table 1 Oxygen and pollutant concentration in subchronic exposure box

表2 亞慢性暴露箱PM2.5幾種主要化學(xué)組分濃度Table 2 Main chemical components in PM2.5 for subchronic exposure box

圖1 柴油車尾氣亞慢性暴露后小鼠的肺炎癥指標(biāo)水平注：BCG表示對(duì)照組，0.5 h、1 h和2 h DEEG表示0.5 h、1 h和2 h柴油暴露組，IL-6表示白細(xì)胞介素6，LDH表示乳酸脫氫酶， TNF-α表示腫瘤壞死因子α，TGF-β表示轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β；同一參數(shù)具有相同字母的2個(gè)處理之間無(wú)顯著差異(P>0.05)， 不具有相同字母的2個(gè)處理之間有顯著差異(P<0.05)。Fig. 1 The inflammatory factors in mice lung after subchronic exposure to diesel engine exhaust Notes: BCG means blank control group; 0.5 h, 1 h and 2 h DEEG means 0.5 h, 1 h and 2 h diesel engine exhaust exposure group; IL-6 means interleukin-6, LDH means lactate dehydrogenase, TNF-α means tumor necrosis factor-α, and TGF-β means transforming growth factor-β; there is no significant difference between two treatments with same letter at P>0.05, and there is significant difference between two treatments without same letter at P<0.05.

2.4 柴油車尾氣亞慢性暴露后小鼠肺組織的病理?yè)p傷

組織病理觀察結(jié)果表明(圖3)，柴油車尾氣對(duì)小鼠肺組織的損傷隨暴露時(shí)間的增加而加重，損傷程度表現(xiàn)為：2 h柴油暴露組>1 h柴油暴露組>0.5 h柴油暴露組。隨著暴露時(shí)間的延長(zhǎng)，小鼠肺出現(xiàn)損傷的細(xì)胞數(shù)量增多、損傷程度加重，如充血較重，出現(xiàn)大量淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡間質(zhì)增生明顯，1 h柴油暴露組和2 h柴油暴露組可見(jiàn)肺泡細(xì)支氣管黏膜細(xì)胞脫落。

2.5 柴油車尾氣亞慢性暴露對(duì)小鼠肺組織細(xì)胞凋亡的影響

細(xì)胞凋亡TUNEL染色研究表明，各柴油暴露組小鼠的肺組織細(xì)胞均出現(xiàn)異常，1 h柴油暴露組和2 h柴油暴露組的細(xì)胞凋亡情況更加嚴(yán)重(圖4)。統(tǒng)計(jì)分析表明，0.5 h柴油暴露組與對(duì)照組之間的小鼠肺組織的細(xì)胞凋亡率無(wú)顯著差異(P>0.05)，而1 h柴油暴露組的細(xì)胞凋亡率顯著高于0.5 h柴油暴露組和對(duì)照組(P<0.05)。這表明，柴油車尾氣亞慢性暴露可導(dǎo)致小鼠肺組織細(xì)胞凋亡，長(zhǎng)期每天長(zhǎng)時(shí)間柴油暴露可導(dǎo)致小鼠肺組織細(xì)胞凋亡率增加。

2.6 柴油車尾氣亞慢性暴露對(duì)小鼠肺組織細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2表達(dá)的影響

表征各暴露組小鼠肺組織細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2表達(dá)的電泳結(jié)果如圖5所示(每組5個(gè)測(cè)試樣本中隨機(jī)選擇4個(gè)作圖)。統(tǒng)計(jì)分析表明，小鼠肺組織的細(xì)胞凋亡蛋白Bax、Bcl-2的表達(dá)以及Bcl-2/Bax比值在不同處理組之間均不存在顯著差異(P>0.05)(圖4)。但細(xì)胞凋亡Bax蛋白表達(dá)水平上，0.5 h柴油暴露組顯著高于1 h柴油暴露組和2 h柴油暴露組(P<0.05)；細(xì)胞凋亡Bcl-2蛋白表達(dá)水平上，1 h柴油暴露組顯著高于2 h柴油暴露組(P<0.05)；細(xì)胞凋亡Bcl-2/Bax比值上，1 h柴油暴露組顯著高于0.5 h柴油暴露組(P<0.05)。這表明，柴油車尾氣亞慢性暴露使小鼠肺組織細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2表達(dá)產(chǎn)生異常。

圖2 柴油車尾氣亞慢性暴露后小鼠肺的氧化應(yīng)激指標(biāo)水平注：T-AOC表示總抗氧化能力，GSH-Px表示谷胱甘肽過(guò)氧化物酶，SOD表示超氧化物歧化酶，MDA表示丙二醛； 同一參數(shù)具有相同字母的2個(gè)處理之間無(wú)顯著差異(P>0.05)，不具有相同字母的2個(gè)處理之間有顯著差異(P<0.05)。Fig. 2 The oxidative stress factors in mice lung after subchronic exposure to diesel engine exhaustNotes: T-AOC means total antioxidant capacity, GSH-Px means glutathione peroxidase, SOD means superoxide dismutase, and MDA means malonic dialdehyde; there is no significant difference between two treatments with same letter at P>0.05, and there is significant difference between two treatments without same letter at P<0.05.

圖3 柴油車尾氣亞慢性暴露后小鼠肺組織病理切片HE染色圖(10×10)注：(a)空白對(duì)照組(BCG)，(b) 0.5 h柴油暴露組(0.5 h DEEG)，(c) 1 h柴油暴露組(1 h DEEG)，(d) 2 h柴油暴露組(2 h DEEG)； a肺泡組織充血，b淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡間質(zhì)增生，c肺泡細(xì)支氣管黏膜細(xì)胞脫落。Fig. 3 The pathological changes (HE stain) of lung in mice after subchronic exposure to diesel engine exhaust (10×10)Note: (a) blank control group (BCG), (b) 0.5 h diesel engine exhaust exposure group (0.5 DEEG), (c) 1 h diesel engine exhaust exposure group (1 h DEEG), (d) 2 h diesel engine exhaust exposure group (2 h DEEG); a, alveolar congestion; b, lymphocyte and neutrophil infiltration, alveolar interstitial hyperplasia; c, exfoliation of alveolar bronchiole mucosal cells.

3 討論(Discussion)

3.1 柴油車尾氣亞慢性暴露導(dǎo)致肺組織病變

病理變化研究表明，在柴油車尾氣暴露箱每天暴露0.5、1和2 h的情況下，連續(xù)暴露95 d后，小鼠肺組織會(huì)受到損傷，表現(xiàn)為肺組織充血，大量淋巴細(xì)胞、中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡間質(zhì)增生，1 h柴油暴露組和2 h柴油暴露組可見(jiàn)肺泡細(xì)支氣管黏膜細(xì)胞脫落，損傷隨日暴露時(shí)間增加而加重。這與楊玲等[30]的研究結(jié)果相一致，該研究中，每天暴露在排量為1.4 L和2.8 L的柴油機(jī)尾氣中0.5 h，連續(xù)暴露28 d后，小鼠的肺氣道上皮細(xì)胞脫落，支氣管周圍炎性細(xì)胞浸潤(rùn)。急性暴露研究也觀察到這一現(xiàn)象，利用氣管滴注法將小鼠急性暴露于小劑量DEPs，會(huì)引起小鼠短暫的急性輕、中度肺部炎癥和組織損傷，表現(xiàn)為中性粒細(xì)胞和肺泡巨噬細(xì)胞浸潤(rùn)，局灶性肺泡炎，可見(jiàn)DEPs滲入至肺組織造成傷害[25]。

圖4 柴油車尾氣亞慢性暴露后小鼠肺組織的細(xì)胞凋亡率、細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2的表達(dá)注：同一參數(shù)具有相同字母的2個(gè)處理之間無(wú)顯著差異(P>0.05)，不具有相同字母的2個(gè)處理之間有顯著差異(P<0.05)。Fig. 4 Cell apoptosis rate and its relative protein Bax, Bcl-2 expression level of mice lung after subchronic exposure to diesel engine exhaustNotes: There is no significant difference between two treatments with same letter at P>0.05, and there is significant difference between two treatments without same letter at P<0.05.

圖5 柴油車尾氣亞慢性暴露后小鼠肺組織細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白Bax、Bcl-2的表達(dá)電泳圖Fig. 5 The electrophoresis results for expression of Bax, Bcl-2 related to cell apoptosis in mice lung after subchronic exposure to diesel engine exhaust

3.2 TUNEL染色結(jié)果顯示暴露組細(xì)胞凋亡指數(shù)升高

本研究中，TUNEL染色結(jié)果表明，長(zhǎng)期每天長(zhǎng)時(shí)間暴露于柴油車尾氣的情況下，1 h柴油暴露組和2 h柴油暴露組細(xì)胞凋亡較對(duì)照組嚴(yán)重；統(tǒng)計(jì)細(xì)胞凋亡指數(shù)發(fā)現(xiàn)，柴油車尾氣亞慢性暴露(1 h·d-1和2 h·d-1)會(huì)導(dǎo)致小鼠肺組織細(xì)胞凋亡率增加。細(xì)胞凋亡又稱程序性細(xì)胞死亡，指為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主的有序死亡，它是細(xì)胞對(duì)環(huán)境的生理性或病理性刺激信號(hào)等產(chǎn)生的應(yīng)答有序變化，也是細(xì)胞在各種內(nèi)外信號(hào)激活細(xì)胞死亡程序后發(fā)生的一種自殺行為[31]。細(xì)胞凋亡是DEPs對(duì)動(dòng)物組織病理?yè)p傷的重要機(jī)制之一。例如，經(jīng)DEPs急性暴露12 h后，人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞降低了mdm2癌基因的表達(dá)，導(dǎo)致p53抑癌基因表達(dá)增加，從而引發(fā)細(xì)胞凋亡，最終導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙[32]。丁香酚能夠減弱DEPs急性暴露24 h后對(duì)caspase-3基因的細(xì)胞凋亡信號(hào)的激活，減少細(xì)胞凋亡，進(jìn)而避免DEPs引起小鼠肺組織炎癥和肺泡塌陷的變化[9]。

3.3 細(xì)胞凋亡重要環(huán)節(jié)中氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)相關(guān)指標(biāo)的表達(dá)和分泌水平

氧化應(yīng)激和炎癥反應(yīng)是導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的重要環(huán)節(jié)[33-34]。PM2.5被吸入機(jī)體后，遇到肺部表面的巨噬細(xì)胞、支氣管上皮細(xì)胞后促使其釋放大量炎癥細(xì)胞因子，如IL-6、IL-8，從而引發(fā)機(jī)體炎癥反應(yīng)[21]。有研究認(rèn)為，PM表面攜帶的鐵、銅、鋅和錳等金屬元素、多環(huán)芳烴和超細(xì)顆粒物等激活了機(jī)體自身的防御途徑，導(dǎo)致炎性因子釋放過(guò)多，產(chǎn)生炎性反應(yīng)，引起細(xì)胞破壞甚至死亡[35-37]。本研究中，柴油車尾氣亞慢性暴露會(huì)導(dǎo)致小鼠肺組織LDH的分泌顯著升高，而IL-6、TNF-α和TGF-β分泌水平未見(jiàn)顯著變化。這與以往DEPs急性暴露的研究結(jié)果相似，采用急性氣管滴注暴露方式，每只小鼠的DEPs暴露劑量為5、35和50 mg·kg-1，氣管滴注1、7和30 d后肺泡灌洗液中LDH的分泌水平均顯著高于對(duì)照組；在急性暴露1 d后IL-6的mRNA表達(dá)水平顯著升高，但在7 d和30 d后回歸至正常水平；炎癥指標(biāo)中TGF-β和TNF-α的mRNA表達(dá)水平始終未見(jiàn)顯著變化[38]。體外細(xì)胞暴露研究結(jié)果表明，柴油車尾氣顆粒物提取物使中國(guó)倉(cāng)鼠肺成纖維細(xì)胞內(nèi)的LDH漏出率增加，造成細(xì)胞損傷[39]。然而經(jīng)鼻滴注法滴注低劑量DEPs(15 μg DEPs每只小鼠)，亞慢性暴露90 d(每周連續(xù)滴注5 d)，實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，DEPs的炎癥指標(biāo)分泌水平與對(duì)照組沒(méi)有顯著差異，但是暴露組的組織病理變化顯著增大[40]。暴露時(shí)間長(zhǎng)短不一，會(huì)導(dǎo)致LDH、IL-6、TNF-α和TGF-β等炎癥指標(biāo)水平出現(xiàn)差異[38]，這也許是造成本研究中炎癥指標(biāo)表達(dá)水平異常的原因。氧化應(yīng)激方面，有研究表明，氣管滴注法進(jìn)行3次PM2.5暴露后(間隔48 h滴注1次)，雄性大鼠暴露組的SOD和GSH-Px活性水平顯著下降，反映脂質(zhì)過(guò)氧化的MDA水平則顯著增加[41]。采用氣管滴注法將小鼠急性暴露于DEPs 24 h后(暴露劑量為每只小鼠15 μg、20 μg的DEPs)，小鼠肺泡灌洗液和肺組織的SOD和GSH-Px活性水平、MDA含量也有相同變化規(guī)律[42-43]。本研究中，雖然柴油暴露組之間SOD水平無(wú)顯著差異，但1 h柴油暴露組和2 h柴油暴露組中T-AOC水平均顯著低于對(duì)照組；2 h柴油暴露組的GSH-Px活性顯著低于對(duì)照組；僅MDA水平在各組之間差異不顯著。組織氧化損傷一般會(huì)表現(xiàn)出細(xì)胞膜脂質(zhì)的過(guò)氧化，表現(xiàn)為過(guò)氧化產(chǎn)物MDA分泌增多，但這種過(guò)氧化一般作為氧化損傷前期表現(xiàn)，本研究中的小鼠在柴油車尾氣環(huán)境下暴露時(shí)間長(zhǎng)達(dá)95 d，這可能是MDA沒(méi)有差異性的主要原因。而且本研究中污染物除了柴油燃燒排放的顆粒物外，還有有毒氣體成分，因而表現(xiàn)出不同的氧化炎癥效應(yīng)。

3.4 作為細(xì)胞凋亡信號(hào)之一的Bcl-2蛋白、Bax蛋白表達(dá)水平

細(xì)胞凋亡的信號(hào)途徑具有多樣性，這使得凋亡的發(fā)生及調(diào)控機(jī)制非常復(fù)雜[44-45]。Bcl-2蛋白家族被認(rèn)為是線粒體凋亡信號(hào)通路中關(guān)鍵的調(diào)節(jié)因子，分為抗凋亡Bcl-2亞家族，主要包括Bcl-2、Mcl-1和Bcl-xL；促凋亡Bax亞家族，主要包括Bax、Bak和僅含BH3結(jié)構(gòu)域的BH3-only亞家族[46]。Bcl-2家族蛋白可通過(guò)與本家族或其他家族蛋白的相互作用促進(jìn)或抑制細(xì)胞凋亡，其中，Bcl-2蛋白可通過(guò)與Bax形成穩(wěn)定的化合物抑制后者的促凋亡功能，影響線粒體凋亡通路介導(dǎo)的細(xì)胞凋亡，而且Bcl-2蛋白還可以抑制或阻斷Fas和Fas-L所介導(dǎo)的死亡受體凋亡通路，從而達(dá)到抑制或阻斷細(xì)胞凋亡的作用[47]。本研究中，3個(gè)柴油暴露組Bcl-2蛋白、Bax蛋白表達(dá)水平及Bcl-2/Bax比值，雖然與對(duì)照組之間均不存在顯著差異，但是各暴露組之間存在顯著差異，說(shuō)明柴油車尾氣亞慢性暴露對(duì)小鼠細(xì)胞凋亡調(diào)控蛋白Bcl-2和Bax的表達(dá)具有影響。以往體外細(xì)胞暴露實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，小鼠單核巨噬細(xì)胞經(jīng)DEPs暴露后，Bax蛋白水平持續(xù)上調(diào)，認(rèn)為DEPs通過(guò)激活p53基因，繼而激活Bax，觸發(fā)J774A.1巨噬細(xì)胞凋亡[48]。但是通過(guò)人體暴露實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，哮喘患者、鼻炎患者在柴油車尾氣環(huán)境下(100 μg·m-3)暴露2 h，暴露后再經(jīng)過(guò)18 h，取支氣管活檢樣品，與健康對(duì)照者比較，促凋亡和抗凋亡蛋白(如Bak、Bcl-2)表達(dá)水平無(wú)顯著差異，未見(jiàn)支氣管上皮細(xì)胞凋亡或增殖，認(rèn)為接觸交通來(lái)源的污染并不會(huì)加重哮喘患者的呼吸癥狀[49]。

3.5 柴油車尾氣亞慢性暴露導(dǎo)致的小鼠肺部毒理傷害

柴油車尾氣的有害成分較多，DEPs中90%的顆粒物直徑<22.60 μm，50%的顆粒物直徑<6.80 μm，10%的顆粒物直徑<1.54 μm[9]。PM2.5毒理研究已表明，PM2.5顆粒物小，能夠進(jìn)入到肺組織細(xì)胞，造成氧化損傷、炎癥反應(yīng)，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡等[50-51]。本研究中，亞慢性暴露箱內(nèi)柴油車尾氣PM2.5中，OC含量最高，占51.95%；其次是EC，占45.78%；然后是陰陽(yáng)離子，分別占1.29%和0.95%；暴露箱中NO2濃度為3.705 mg·m-3，CO濃度為104.087 mg·m-3，均超過(guò)《環(huán)境空氣質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)》(GB3095—2012)的濃度限值；PAHs中致癌性最強(qiáng)的苯并(a)芘含量高達(dá)98.17 ng·m-3。這些污染物均是造成小鼠肺部毒理傷害的重要因素。以往研究表明，DEPs的物理化學(xué)性質(zhì)，如表面電荷、粒徑和化學(xué)成分，在生物毒理反應(yīng)中起著至關(guān)重要的作用，一次性氣管滴注急性暴露后，1、7、14和28 d后小鼠肺泡灌洗液和血液中的IL-6、TNF-α分泌水平均顯著升高，肺組織病理學(xué)觀察結(jié)果表明，DEPs的PM2.5滲入肺組織細(xì)胞之間[22]。暴露于高濃度DEE的地下曠工，由于吸入EC、揮發(fā)性有機(jī)物(VOCs)、NO2和DEPs，肺功能指標(biāo)一秒率(FEV1/FVC)的Z分值與EC和DEPs顯著相關(guān)，但與VOCs、NO2無(wú)關(guān)，地下曠工的肺功能顯著下降[52]。

本研究通過(guò)模擬柴油車尾氣污染環(huán)境，對(duì)小鼠進(jìn)行亞慢性染毒研究，結(jié)果表明，柴油車尾氣亞慢性暴露可通過(guò)顯著升高LDH、降低T-AOC和GSH-Px的活性而造成小鼠肺組織炎癥損傷和氧化應(yīng)激，導(dǎo)致細(xì)胞凋亡率升高，且存在時(shí)間效應(yīng)，造成凋亡蛋白Bax和Bcl-2表達(dá)水平顯著異常。暴露導(dǎo)致小鼠肺組織病理?yè)p傷，嚴(yán)重的肺充血、大量淋巴細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，肺泡間質(zhì)增生明顯，且損傷程度隨著暴露時(shí)間的增加而增加。小鼠亞慢性暴露過(guò)程中受到的氧化炎癥和病理?yè)p傷可能與柴油車尾氣中高濃度NO2、CO和PAHs等有毒氣體以及細(xì)顆粒物中高濃度的OC、EC等污染物的作用有關(guān)。